新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評關(guān)注點

李紅然

·新型冠狀病毒專欄·

新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評關(guān)注點

李紅然

100081 北京，國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，Email：lihr@cmde.org.cn

新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎，COVID-19）為新發(fā)急性呼吸道傳染病，目前已成為全球性的公共衛(wèi)生事件[1]。新冠肺炎疑似病例的確診需要具備病原學(xué)或血清學(xué)證據(jù)[2]，目前國內(nèi)廣泛應(yīng)用的新型冠狀病毒（新冠病毒）病原學(xué)檢測為實時熒光 PCR 核酸檢測，其具有快速、靈敏、特異等特點。病毒基因組測序亦屬于核酸檢測范疇，一般用于對結(jié)果進行確認以及病毒變異監(jiān)測[3]。本文所指新冠病毒核酸檢測試劑是指基于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法，擴增新冠病毒特異性基因，并通過熒光標(biāo)記的探針，對反應(yīng)過程中的 PCR 產(chǎn)物進行實時檢測的試劑。

2020 年 1 月底，我國率先批準(zhǔn)全球首個新冠病毒核酸檢測試劑，截至目前，國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的新冠病毒核酸檢測試劑已近 30 個。醫(yī)療器械技術(shù)審評中心（CMDE）于 2020 年 2 月 12 日在官網(wǎng)公布了《2019 新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評要點》（以下簡稱“要點”）[4]，對相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)和申報具有重要的指導(dǎo)作用。目前，有多家企業(yè)正在開發(fā)或申報新冠病毒核酸檢測試劑，部分企業(yè)由于對新發(fā)傳染性病毒的研發(fā)經(jīng)驗不足，對“要點”的理解不充分，導(dǎo)致在注冊申報過程中面臨較大困難。本文根據(jù)“要點”的內(nèi)容，結(jié)合多個相關(guān)產(chǎn)品的審評經(jīng)驗，總結(jié)注冊資料中出現(xiàn)問題較多的關(guān)鍵點，對新冠病毒核酸檢測試劑注冊的部分內(nèi)容進行闡述，旨在為相關(guān)試劑的研發(fā)和注冊申報提供建議和參考，提升產(chǎn)品研發(fā)速度，提高申報資料的質(zhì)量。

1 主要原材料

新冠病毒核酸檢測試劑的主要原材料包括引物和探針，脫氧三磷酸核苷（dNTP），酶（DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶 DNA 糖基化酶），陰性和陽性質(zhì)控品，內(nèi)標(biāo)（內(nèi)對照）。下面對注冊申報中問題較多的原材料進行描述。

1.1 引物和探針

引物和探針是決定試劑能否準(zhǔn)確且特異檢出新冠病毒的重要原材料。申請人應(yīng)針對所選擇的靶基因，合理設(shè)計引物和探針，詳述設(shè)計原則。一般需設(shè)計多對引物和探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗的方式，對病毒進行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，其中序列比對包括與已公布新冠病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來源、不同滴度的新冠病毒核酸陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。

如果采用雙靶標(biāo)或三靶標(biāo)的多重 PCR 檢測，應(yīng)注意各引物探針間的相互兼容性以及擴增效率的一致性。一般來講，反應(yīng)體系中僅有一對引物探針時，其擴增效率最高。在加入其他引物探針后，應(yīng)通過合理設(shè)計，使擴增效率不被顯著影響。

1.2 質(zhì)控品

新冠病毒核酸檢測試劑應(yīng)包含陰性和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品一般采用假病毒，以監(jiān)測產(chǎn)品的提取和擴增。不建議采用質(zhì)粒，因為質(zhì)粒無法監(jiān)測提取和逆轉(zhuǎn)錄過程。說明書中需明確陰、陽性質(zhì)控品參與核酸提取過程，并對質(zhì)控品的檢測結(jié)果（如 Ct 值）做出明確的范圍要求，不可僅描述為陰性或陽性。

1.3 內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對樣本可能含有的管內(nèi)抑制因素而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增，已上市試劑的內(nèi)標(biāo)有內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)（如采用基因 RNaseP、β-Globin 等）和外源性內(nèi)標(biāo)（如 RNA 假病毒），亦有外源加入的序列。內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)內(nèi)源基因可以監(jiān)測采樣，推薦采用。但是應(yīng)對內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)內(nèi)源基因的擴增引物、探針濃度等進行研究，使內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線，且在樣本中細胞數(shù)量過多時不會對靶基因檢測造成抑制。外源性內(nèi)標(biāo)外源基因一般擴增曲線穩(wěn)定，在提取樣本核酸前加入，參與提取過程，但不能監(jiān)測采樣過程。說明書中需對內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果（如 Ct 值）做出明確的范圍要求。

1.4 企業(yè)參考品

良好的企業(yè)參考品，可衡量產(chǎn)品性能，驗證各批次產(chǎn)品持續(xù)穩(wěn)定的有效性。企業(yè)參考品一般需采用臨床樣本進行制備，僅 SARS 和 MERS 冠狀病毒，如難以獲取樣本或病毒株，可采用假病毒。申請人應(yīng)對企業(yè)參考品的來源、樣本類型、型別鑒定、病毒滴度等信息進行精確的試驗驗證，建議采用質(zhì)量較好的已上市同類試劑結(jié)合臨床確診信息進行樣本確認，不可僅采用申報產(chǎn)品確定新冠病毒核酸陰、陽性。陽性參考品應(yīng)著重考慮不同來源的病毒樣本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同來源的 5 個病毒樣本。陰性參考品的設(shè)置不應(yīng)少于“要點”建議的病原體。檢測限參考品的濃度水平可采用 90% ~ 95% 陽性檢出率水平或略高于檢測限的水平，應(yīng)至少包含一個檢測限附近水平的樣本，其檢測的可接受標(biāo)準(zhǔn)為陽性，以達到驗證產(chǎn)品檢測限的目的。部分企業(yè)認為 95% 陽性檢出率水平的檢測限參考品，其檢測結(jié)果的可接受標(biāo)準(zhǔn)為：陰性或者陽性。但是這樣無法起到控制產(chǎn)品檢測限的目的。對于 5% 情況下檢出為陰性時，可進行再次檢測，或者直接設(shè)置 100% 陽性檢出率水平的檢測限參考品。重復(fù)性參考品建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度為最低檢測限附近的濃度。

2 反應(yīng)體系研究

2.1 樣本的采集和處理

鑒于新冠病毒實驗室檢測需要，申報產(chǎn)品一般包括上呼吸道樣本（口咽拭子、鼻咽拭子）和下呼吸道樣本（痰液、肺泡灌洗液）。各種樣本的采集和處理方式研究包括：

⑴采樣拭子的材質(zhì)要求：對拭子頭和拭子桿的要求。

⑵采樣后放入的保存液/采樣液及容器：明確相關(guān)溶液的產(chǎn)品名稱、生產(chǎn)廠家及備案號等信息。如適用多種保存液/采樣液，均應(yīng)進行驗證。

⑶痰液采集后處理用的消化液：例如含二硫蘇糖醇或蛋白酶 K 的磷酸鹽緩沖液、乙酰半胱氨酸等。

⑷樣本的滅活方式：熱滅活或化學(xué)滅活。熱滅活一般采用 56 ℃加熱 30 min 進行滅活?；瘜W(xué)滅活可于采樣后直接放入含 2 ~ 3 mol/L 異硫氰酸胍或鹽酸胍的病毒裂解液中，使病毒迅速滅活，需研究其使用濃度、裂解液用量、樣本用量，加入裂解液后的樣本保存時間。

樣本的采集和處理方式研究資料應(yīng)在注冊申報的反應(yīng)體系研究部分提交，并在分析性能評估及臨床試驗等資料中對采集和處理方式進行驗證和確認。樣本采集和處理方式可參考《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》[5]，但應(yīng)在申報資料和產(chǎn)品說明書中明確具體內(nèi)容。

2.2 核酸提取和擴增

申請人應(yīng)研究申報產(chǎn)品核酸提取和擴增的最佳反應(yīng)體系，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP 濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下，盡量擴大核酸提取體系和 PCR 反應(yīng)的加樣量，以提高產(chǎn)品的靈敏度。核酸快速檢測應(yīng)基于對逆轉(zhuǎn)錄、變性、退火和延伸等各步驟反應(yīng)時間的合理研究，結(jié)合適用儀器的升降溫速度等性能。不可為追求快速檢測，而盲目縮短反應(yīng)時間。另外，不同適用機型的反應(yīng)條件如有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

3 分析性能評估

3.1 分析性能評估總體要求

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實樣本，如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)粒進行分析性能評估。對于最低檢測限、包容性、精密度等各項性能中采用的臨床樣本，應(yīng)為不同患者來源的樣本，不可采用重復(fù)樣本。

3.2 最低檢測限

新冠病毒核酸檢測試劑的最低檢測限是確保在樣本中病毒載量較低時，能夠檢出陽性的關(guān)鍵性能。建議合理進行產(chǎn)品設(shè)計，優(yōu)化反應(yīng)體系，使產(chǎn)品檢測限≤ 500 拷貝/ml。應(yīng)采用科學(xué)的方法標(biāo)定樣本中病毒的滴度，并參考國家參考品中靈敏度參考品的量值。最低檢測限的確定和驗證需分別采用 5 個樣本進行。

3.3 包容性

建議選擇我國出現(xiàn)的流行株和全球代表性的突變株進行包容性研究，至少驗證具有時間和區(qū)域特征性的 20 個不同來源的病毒樣本或毒株。將這些樣本或毒株稀釋到試劑盒的最低檢測限水平，應(yīng)均可達到90% ~ 95% 陽性檢出率。對其進行多次重復(fù)檢測，重復(fù)性亦應(yīng)符合要求。

3.4 精密度

應(yīng)合理設(shè)計精密度試驗，納入檢測試劑、核酸分離/純化步驟、分析儀、操作者、地點、檢測輪次等要素綜合設(shè)計試驗，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。注意不可僅分析單因素對精密度的影響，例如運行內(nèi)精密度、運行間精密度、人員間精密度等，應(yīng)增加綜合上述各因素的實驗室內(nèi)精密度和實驗室間精密度分析。

對于精密度的評價周期，“要點”中推薦了為期至少 20 天的檢測或者為期至少 5 天的檢測?！耙c”發(fā)布時間為 2020 年 2 月 12 日，當(dāng)時疫情形勢緊急，我國新冠病毒檢測試劑產(chǎn)能不足。目前疫情已經(jīng)持續(xù)超過一年時間，我國新冠病毒檢測試劑產(chǎn)能已經(jīng)可以滿足需求，所以推薦至少進行為期 20 天的實驗室內(nèi)精密度評價。

3.5 特異性

3.5.1 交叉反應(yīng) 應(yīng)對“要點”中明確的交叉病原體及其型別采用真實樣本進行充分研究，提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證，例如不低于 106CFU/ml 的細菌，不低于 105PFU/ml 的病毒。對于各種病原體及型別的樣本，應(yīng)分別進行研究。

3.5.2 內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾 新冠病毒核酸檢測試劑適用樣本類型一般為口咽拭子、鼻咽拭子、痰液等。樣本中潛在的干擾物質(zhì)包括內(nèi)源性的血液、黏液、分泌物等，以及抗病毒、抗細菌、緩解鼻塞和咽部癥狀的外源性藥物。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度條件（“最差條件”）下進行試驗，檢測多例新冠病毒核酸臨界陽性水平的樣本。對結(jié)果進行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異。

3.6 適用的樣本類型

新冠病毒核酸檢測試劑適用的不同樣本類型是不可比的，應(yīng)分別進行性能評估驗證。明確所有分析性能中研究的具體樣本類型，采集和處理方式。

3.7 新冠病毒突變株檢測能力評價

自從新冠肺炎流行以來，全世界已出現(xiàn)了多個突變株，部分突變株可能會導(dǎo)致傳播能力增強[6-7]。如果檢測區(qū)域發(fā)生突變，尤其是引物探針結(jié)合位點變化，可能會影響試劑的檢測性能，所以需對不同突變株進行評價，包括：英國 B.1.1.7 突變株、南非 B.1.351 突變株、巴西 P.1 突變株、巴西 N.9 突變株、芬蘭 Fin-796H 突變株、尼日利亞 B.1.525 突變株、法國 B.1 突變株、印度 B.1.617 雙突變株（該突變株譜系包括 B.1.617.1、B.1.617.2、B.1.617.3）等。申請人應(yīng)根據(jù)病毒變異情況適時補充其他突變株。評價過程首先應(yīng)進行生物信息學(xué)分析，對試劑的檢測區(qū)域及引物探針進行序列比對，并形成報告，報告中需包括突變株序列編號、擴增基因名稱、靶擴增區(qū)域與突變株比對圖（在圖中標(biāo)出引物、探針）。生物信息學(xué)分析如顯示檢測區(qū)域包含突變位點，則應(yīng)認為該突變對試劑的檢測能力存在潛在影響。應(yīng)列明可能存在影響的位點，并采用人工合成樣本或真實臨床突變株（如可獲得）進行試驗驗證。驗證應(yīng)采用所有適用樣本類型，進行最低檢測限和精密度的試驗。

4 陽性判斷值

新冠病毒核酸檢測試劑一般檢測開放讀碼框 1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）基因及核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）基因雙靶標(biāo)，也有單靶標(biāo)（ORF1ab）和三靶標(biāo)（ORF1ab、N 和 E）檢測試劑。申請人應(yīng)納入一定數(shù)量的陰性、陽性及弱陽性樣本，采用 ROC 曲線研究各靶標(biāo)的陽性判斷值（Ct 值），同時研究各靶標(biāo)雙陽、單陽等的結(jié)果判讀規(guī)則。對于結(jié)果判定涉及復(fù)檢要求的試劑，例如某靶標(biāo)單陽性時需要復(fù)檢，應(yīng)關(guān)注各靶標(biāo)基因檢測能力的一致性。使用至少 20 例臨床樣本梯度稀釋，對每個基因分別進行檢測，觀察不同基因靈敏度的差異，確保各基因的檢測能力基本一致。

5 產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書是前期設(shè)計開發(fā)結(jié)果的總結(jié)，應(yīng)包括經(jīng)驗證確認的預(yù)期用途、產(chǎn)品的組成、使用等信息及必要的提醒內(nèi)容。說明書中需明確完成檢測所需的全部試劑及設(shè)備，包括需要但未提供的產(chǎn)品的名稱、廠家、貨號及備案號。新冠病毒核酸檢測試劑的注意事項一般應(yīng)包括檢測時的生物安全防護相關(guān)內(nèi)容，并應(yīng)包括對試劑使用的提醒，例如：試劑保存運輸及使用過程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測過程操作不規(guī)范等，請嚴格按照說明書操作。因拭子等樣本采集過程及病毒感染過程本身的特點，可能存在采集到的樣本量不足等原因帶來的假陰性結(jié)果，應(yīng)結(jié)合臨床其他診療信息綜合判斷，必要時復(fù)測。

6 總結(jié)

基于熒光 PCR 法的新冠病毒核酸檢測試劑為新冠病毒感染提供病原學(xué)證據(jù)，是臨床診斷的重要依據(jù)之一。在新冠肺炎疫情防控的一年多時間里，新冠病毒核酸檢測試劑發(fā)揮了不可替代的重要作用。多個新冠病毒核酸檢測試劑仍在研發(fā)或注冊申報過程中。本文根據(jù)相關(guān)產(chǎn)品的審評經(jīng)驗，對注冊申報資料中出現(xiàn)問題較多的內(nèi)容進行總結(jié)，這些內(nèi)容既是研發(fā)和驗證產(chǎn)品過程中容易疏漏之處，也是技術(shù)審評的關(guān)注點。旨在為相關(guān)試劑的開發(fā)和注冊申報提供參考，促進產(chǎn)品的安全有效性驗證，提升疫情防控用產(chǎn)品的上市速度。

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