應(yīng)用3D大腦類器官研究人類神經(jīng)發(fā)育和疾病

唐曉艷 張馨月 徐敏 劉妍

很多人對醫(yī)療事業(yè)的未來，都存在這樣一種憧憬：當(dāng)身上的組織器官出現(xiàn)問題時(shí)，人們可以在體外培養(yǎng)新鮮健康的相同組織器官用于移植。其實(shí)在當(dāng)下，類器官的出現(xiàn)就是這種技術(shù)的成果體現(xiàn)。

類器官模型是在模式動物模型不能完全代替人體模型，且人體實(shí)驗(yàn)和流產(chǎn)胚胎存在倫理限制的情況下出現(xiàn)的。早在1965—1985年，科研工作者就已經(jīng)使用“類器官”來研究發(fā)育生物學(xué)，但當(dāng)時(shí)的“類器官”只是因?yàn)槠湫螒B(tài)類似器官被冠以此名。直至多能干細(xì)胞學(xué)科的興起，才使類器官“名副其實(shí)”，真正擁有類似器官的功能和結(jié)構(gòu)。

人多能干細(xì)胞（包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞）在特定誘導(dǎo)條件下可分化為體內(nèi)任意一種細(xì)胞或組織類型。隨著近年來干細(xì)胞領(lǐng)域的不斷發(fā)展，類器官技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。類器官是指利用人體干細(xì)胞或者由器官特異性祖細(xì)胞，在三維環(huán)境中培養(yǎng)出類似于器官的組織，具有自我更新和自我組織的能力。類器官的發(fā)展是從腸類器官培養(yǎng)系統(tǒng)開始的。2009年，研究者將小鼠腸道干細(xì)胞放置在凝膠基質(zhì)中生長，用以模擬組織的細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些干細(xì)胞最終形成了表面有孔、內(nèi)部有類似腸道絨毛和隱窩的球狀結(jié)構(gòu)[1]。隨著類器官培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已培育出人的腸、視網(wǎng)膜、大腦、肝臟和腎類器官。

傳統(tǒng)模擬神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法是從人多能干細(xì)胞中分化得到神經(jīng)元。這是一種2D培養(yǎng)體系，該體系分化得到的細(xì)胞無法模擬人類大腦3D空間的內(nèi)環(huán)境，也無法反映出3D層面細(xì)胞間的相互作用，所以3D培養(yǎng)體系應(yīng)運(yùn)而生。從人多能干細(xì)胞產(chǎn)生3D大腦類器官的最普遍方法是先形成擬胚體（形態(tài)學(xué)上與哺乳動物早期胚胎發(fā)育階段有著很高相似度的一種球狀結(jié)構(gòu)），再將這些懸浮培養(yǎng)的擬胚體樣聚集體逐漸分化為幾個(gè)極化的神經(jīng)前體細(xì)胞花環(huán)結(jié)構(gòu)，隨即重新吹懸成神經(jīng)球，最后用含有高水平神經(jīng)元的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基質(zhì)膠進(jìn)行包埋。

迄今為止，利用人多能干細(xì)胞已經(jīng)可以培育區(qū)域特異的類腦器官，如大腦皮質(zhì)、前腦、中腦、下丘腦、小腦和海馬等。2011年，最早用3D技術(shù)培育出完整的神經(jīng)組織：視杯類器官。2013年，研究者利用人胚胎干細(xì)胞，運(yùn)用凝膠基質(zhì)包埋的方法在3D培養(yǎng)環(huán)境中培育出大腦類器官，其具備人類大腦發(fā)育初期的一些主要區(qū)域，如視網(wǎng)膜、背側(cè)皮層、腹側(cè)前腦、中腦、脈絡(luò)叢和海馬等結(jié)構(gòu)，并利用此模型闡明了小頭畸形的發(fā)病機(jī)理。還有研究者運(yùn)用微型生物反應(yīng)器生成3種類型的腦區(qū)域性類器官（前腦、中腦和下丘腦），揭示了寨卡病毒影響人類大腦發(fā)育的機(jī)制。此外，通過將人胚胎干細(xì)胞異位表達(dá)乙型肝炎病毒變體2，誘導(dǎo)在大腦皮層類器官中生成血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，創(chuàng)建了具有脈管系統(tǒng)的血管化類器官。2017年，研究者首次在體外構(gòu)建了皮層和基底前腦融合類器官，重現(xiàn)了胚胎發(fā)育時(shí)期中間神經(jīng)元的遷移過程。近日，有課題組構(gòu)建了大腦皮層和后腦/脊髓的類器官，并將它們與人類骨骼肌類器官融合，形成3D“皮質(zhì)—脊髓—肌肉”運(yùn)動組裝體。他們用該運(yùn)動組裝體證實(shí)皮質(zhì)下行神經(jīng)元投射可調(diào)節(jié)脊髓功能網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)脊髓源性運(yùn)動神經(jīng)元可進(jìn)一步控制肌肉產(chǎn)生節(jié)律波動。研究人員對于3D大腦類器官模型的每一步探索都是在努力構(gòu)建更貼合人體結(jié)構(gòu)的體外模型，以此深入了解人體神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。

探究人腦神經(jīng)發(fā)育障礙疾病

神經(jīng)發(fā)育障礙是由胚胎階段大腦發(fā)育異常所致的一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損的疾病，是一種廣泛、多樣化的神經(jīng)行為學(xué)障礙。患者往往伴有認(rèn)知、語言、社交互動及運(yùn)動行為的缺陷。常見的神經(jīng)發(fā)育障礙包括小頭畸形、自閉癥、提摩西氏綜合征、精神分裂癥、癲癇、威廉姆斯綜合征、唐氏綜合征、智力障礙、無腦回畸形、蕾特氏癥等。類器官技術(shù)的出現(xiàn)，規(guī)避了由于使用動物模型及流產(chǎn)胚胎而面臨的種屬差異和倫理問題，為研究神經(jīng)發(fā)育疾病及藥物篩選提供了新的技術(shù)平臺。

以小頭畸形為例，該疾病是一種由于患者的祖細(xì)胞產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡的失衡致使腦內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，繼而導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育異常的疾病。小頭畸形分為原發(fā)性小頭畸形和繼發(fā)性小頭畸形，其中原發(fā)性小頭畸形是常染色體隱性遺傳的散發(fā)性神經(jīng)發(fā)育疾病，發(fā)病原因是祖細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘體失控和細(xì)胞周期動力學(xué)異常。

迄今為止，研究人員已經(jīng)篩選出與原發(fā)性小頭畸形發(fā)生相關(guān)的18個(gè)基因突變。蘭開斯特（Lancaster）等首次使用大腦類器官對小頭畸形進(jìn)行建模，他們將攜帶了編碼CDK5調(diào)節(jié)亞基相關(guān)蛋白2（CDK5RAP2）突變基因的小頭顱病患者的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化為大腦類器官[2]。結(jié)果顯示，與對照組相比，在分化而成的患者腦類器官中，中神經(jīng)前體細(xì)胞顯示出增殖減少和提前分化等病理表型。同時(shí)，研究人員使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將對照組類器官的CDK5RAP2基因進(jìn)行敲減，結(jié)果顯示敲減組類器官同樣表現(xiàn)出相似的病理表型。此后，還有研究者構(gòu)建了WDR62基因突變的人源性腦類器官模型，證實(shí)WDR62基因缺陷可使其下游效應(yīng)因子中心體蛋白CEP70被募集到初級纖毛基體的過程中斷，纖毛分解延遲、纖毛長度增加、細(xì)胞周期進(jìn)程受損，從而導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞增殖減少和提前分化，最終造成小頭畸形類器官體積減小，驗(yàn)證了WDR62基因表達(dá)異?？蓪?dǎo)致小頭畸形患者神經(jīng)發(fā)育障礙。這些研究結(jié)果表明，構(gòu)建患者來源的類器官模型可在很大程度上推動腦部疾病遺傳機(jī)制相關(guān)研究的發(fā)展。

小頭畸形的另一個(gè)主要致病因素是寨卡病毒。曾有多個(gè)研究小組使用寨卡病毒感染大腦類器官來觀察病毒致病的機(jī)制。在對包括美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的藥物、臨床試驗(yàn)候選藥物和藥理活性化合物在內(nèi)的約6000種化合物的藥物篩選過程中，研究者發(fā)現(xiàn)caspase-3活性抑制劑Emricasan和Niclosamide（B類驅(qū)蟲藥）可挽救寨卡病毒誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞的凋亡，并有效抑制寨卡病毒的復(fù)制，因此確定了抗寨卡病毒藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物[3]。由此可見，基于人腦類器官的研究不僅加深了我們對小頭畸形發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，也為驗(yàn)證候選藥物提供了新的藥物篩選平臺。

探究人腦神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病又稱神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是一類以中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)變性導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行性退化為特征的疾病，主要包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥。這些神經(jīng)退行性疾病嚴(yán)重影響了美國600萬人的生活質(zhì)量，且其病理機(jī)制尚不明確，針對此類疾病，目前尚無有效的治療方法。該綜合征病理特征復(fù)雜多樣，而動物模型不能完全概括人類神經(jīng)系統(tǒng)的獨(dú)特性和復(fù)雜性，在開發(fā)用于神經(jīng)退行性疾病治療藥物的過程中，科研人員面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，基于多能干細(xì)胞技術(shù)的3D類器官模型則為研究上述疾病開辟了新的道路。

以阿爾茨海默病為例，該疾病又稱老年癡呆，臨床上往往表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知和執(zhí)行功能的進(jìn)行性和不可逆轉(zhuǎn)性衰退。截至目前，僅有兩種經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的用于治療阿爾茨海默病的臨床藥物：乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，但以上兩類藥物的治療效果非常有限，因此，開發(fā)新型藥物療法為當(dāng)前生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)。

阿爾茨海默病主要的病理學(xué)特征為β-淀粉樣蛋白斑塊和tau蛋白纏結(jié)。這些病理過程的下游效應(yīng)為神經(jīng)元變性、突觸和神經(jīng)元丟失，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的萎縮。研究者在人神經(jīng)干細(xì)胞來源的3D大腦類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，β-淀粉樣蛋白前體蛋白和早老素1突變可誘導(dǎo)顯著的β-淀粉樣蛋白細(xì)胞外沉積；此外，在神經(jīng)突觸中也可見銀陽性的P-tau聚集物及絲狀tau蛋白。其他研究者在類器官中過表達(dá)家族性阿爾茨海默病基因，也觀測到了β-淀粉樣蛋白的聚集及遲發(fā)tau病理學(xué)特征。

另一項(xiàng)關(guān)于阿爾茨海默病患者來源類器官的研究證實(shí)了標(biāo)志性阿爾茨海默病病理的自發(fā)出現(xiàn)，包括淀粉樣蛋白聚集體的生成和tau蛋白的異常磷酸化。此外，β-和γ-分泌酶抑制劑處理可有效減輕類器官中阿爾茨海默病的相關(guān)病理表型[4]。同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)散發(fā)性阿爾茨海默病與APOE位點(diǎn)基因突變有關(guān)，其中APOE4突變被認(rèn)為是散發(fā)性阿爾茨海默病最大的遺傳危險(xiǎn)因素。研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/ Cas9基因編輯技術(shù)將APOE4基因引入健康人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系，結(jié)果顯示，攜帶APOE4基因型的大腦類器官表現(xiàn)出β-淀粉樣蛋白積累和tau蛋白磷酸化增加，同時(shí)APOE4基因型來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞對β-淀粉樣蛋白42的吸收率降低，而將APOE4轉(zhuǎn)變成APOE3基因后，可明顯改善其阿爾茨海默病的病理特征。以上結(jié)果證實(shí)了APOE4基因在散發(fā)性阿爾茨海默病發(fā)病過程中的關(guān)鍵作用。

由此可見，利用中樞神經(jīng)系統(tǒng)類器官建立的神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型是探究人類遲發(fā)性神經(jīng)退行性疾病潛在病因的一個(gè)有力工具，同時(shí)也為篩選治療藥物提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺。

3D腦類器官技術(shù)的發(fā)展至今還不足10年，仍處于起步階段。就其細(xì)胞和分子組成而言，目前腦類器官的體系可以模仿妊娠中期的人類胎兒大腦。然而，由于大腦類器官缺乏血管循環(huán)系統(tǒng)，因此其主要依靠自由擴(kuò)散從培養(yǎng)基中進(jìn)行氧氣交換和吸取營養(yǎng)。當(dāng)在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)時(shí)，由于缺乏氧氣和營養(yǎng)，類器官中間的細(xì)胞會出現(xiàn)大量凋亡。因此，建立一種改進(jìn)的腦類器官循環(huán)系統(tǒng)為大勢所趨。

最近，已成功地從誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中分化出血管類器官，包含自組裝成毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞。血管類器官可移植到小鼠中形成穩(wěn)定的灌注血管樹，包括動脈、小動脈和小靜脈[5]。在未來針對人腦類器官技術(shù)的優(yōu)化中，可將人腦類器官與血管類器官結(jié)合在一起，以期建立功能性的封閉循環(huán)系統(tǒng)，以支持體外的長期培養(yǎng)并用于研究神經(jīng)血管的相互作用。

人腦細(xì)胞組成不僅僅包含源自神經(jīng)外胚層的神經(jīng)細(xì)胞，還包含各種類型的非神經(jīng)細(xì)胞。當(dāng)前大多數(shù)關(guān)于類器官的研究主要集中在將胚狀體誘導(dǎo)為神經(jīng)外胚層，從而缺失了大量非神經(jīng)細(xì)胞，例如小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞和腦膜等。因此，當(dāng)前的大腦類器官體系尚無法對由非神經(jīng)元細(xì)胞之間的相互作用或非神經(jīng)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用介導(dǎo)的大腦疾病進(jìn)行建模。研究表明，在沒有添加雙重SMAD蛋白抑制劑的情況下，大腦類器官可自發(fā)生成中胚層祖細(xì)胞，它們能夠在神經(jīng)外胚層細(xì)胞提供的中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境作用下分化為成熟的小膠質(zhì)細(xì)胞。此外，2D分化的小膠質(zhì)細(xì)胞與大腦類器官的共培養(yǎng)體系也有助于研究小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用。因此，大腦類器官與更廣泛的支持性非神經(jīng)細(xì)胞的共培養(yǎng)將成為未來的一項(xiàng)研究熱點(diǎn)。

人腦皮質(zhì)溝回形成是其大腦皮層面積遠(yuǎn)大于嚙齒類動物的一個(gè)重要原因，溝回的形成與認(rèn)知能力高度相關(guān)。然而，使用當(dāng)前體系在大腦類器官中通常未觀察到明顯的溝回結(jié)構(gòu)。有趣的是，最近的一項(xiàng)研究表明，通過激活PTEN-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可使大腦類器官中產(chǎn)生類似溝回的褶皺[6]。這表明，進(jìn)一步的技術(shù)改良有望使大腦類器官產(chǎn)生與實(shí)際人腦更為相似的結(jié)構(gòu)。

總之，盡管目前大腦類器官培育體系尚存在技術(shù)缺陷，也不具有人體天然器官的立體結(jié)構(gòu)及復(fù)雜的功能。但不可否認(rèn)的是，3D大腦類器官模型已為人類研究大腦發(fā)育及疾病機(jī)制帶來了巨大進(jìn)展，關(guān)于大腦類器官的構(gòu)建及應(yīng)用研究仍將是未來生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)，且應(yīng)用類器官移植替代藥物療法治愈神經(jīng)系統(tǒng)疾病依然是未來精準(zhǔn)醫(yī)療的一個(gè)重要發(fā)展方向。作為一種新興的生物培養(yǎng)技術(shù)，大腦類器官在研究人腦發(fā)育、疾病機(jī)制、組織替代療法以及藥物篩選等方面，均有著巨大的研究潛力和應(yīng)用價(jià)值。

[本文相關(guān)研究得到國家自然科學(xué)基金（81922022， 91849117， 81471301）和國家重點(diǎn)研究與發(fā)展計(jì)劃（2016 YFC1306703）的資助。]

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關(guān)鍵詞：大腦類器官 多潛能干細(xì)胞 神經(jīng)系統(tǒng)疾病 ■