基于糖尿病-腫瘤小鼠模型研究糖尿病對(duì)結(jié)直腸癌/乳腺癌進(jìn)展及腸道菌群的影響

王曉鈺, 蔣升瑤,藺智兵,崔 立

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200240)

糖尿病是一種胰島素分泌功能缺陷或異常的代謝性疾病，在全球范圍內(nèi)造成廣泛的影響，加重了社會(huì)醫(yī)療支出，是世界主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的第9版全球糖尿病概覽［1］顯示，全球約4.63 億人患有糖尿病；我國(guó)糖尿病患病人數(shù)已超過(guò)1.2 億，位居世界首位。全球健康支出中約有12%用于糖尿病，估計(jì)到2040 年全球因糖尿病引起的健康總支出約為8 020 億美元［2］。2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）即非原發(fā)性糖尿病，是由于胰島素分泌相對(duì)不足或胰島素抵抗而引起血糖升高。T2DM患者通常伴隨著血脂異常、高血壓和糖耐量異常等癥狀。糖尿病引起的持續(xù)性高血糖會(huì)導(dǎo)致各種組織器官損傷或功能障礙，誘發(fā)人體重大健康事件。

結(jié)直腸癌是目前在全球人口中高發(fā)且具有高致死性的惡性腫瘤之一。中國(guó)結(jié)直腸癌的年均新發(fā)病例數(shù)在17 萬(wàn)左右，年均增長(zhǎng)率約為4.2%，位列中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和致死率的第4 位［3-4］。另外，在世界范圍內(nèi)，2018年新診斷出的女性乳腺癌患者在210萬(wàn)例左右，幾乎占女性癌癥病例的四分之一；乳腺癌是女性中最常見(jiàn)的癌癥，也是導(dǎo)致女性死亡的重要原因之一［5］。據(jù)研究，全球20%的癌癥與腸道微生物有著密切聯(lián)系［6-7］。人體內(nèi)的微生物超過(guò)100萬(wàn)億個(gè)，編碼的獨(dú)特基因是人類(lèi)基因組的100倍［8］。宿主通過(guò)多種行為調(diào)節(jié)其微生物群的組成，同時(shí)微生物群也可以很好地調(diào)節(jié)寄主的生理機(jī)能［9］。大多數(shù)定植于人類(lèi)腸道中的腸道菌群形成共生體發(fā)揮生理作用，包括抵抗病原體入侵、預(yù)防腫瘤發(fā)生、參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和毒素代謝等［10］。共生體處于微妙的平衡中，一旦腸道菌群生物量或多樣性發(fā)生改變，即進(jìn)入“失調(diào)”狀態(tài)，就可能誘導(dǎo)腫瘤等疾病的發(fā)生及進(jìn)展［11-12］。

糖尿病和癌癥有幾個(gè)共同的危險(xiǎn)因素，如衰老、肥胖、膳食失衡、缺乏運(yùn)動(dòng)、飲酒和吸煙等。臨床數(shù)據(jù)表明，糖尿病還對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有推動(dòng)作用［13］，是多種腫瘤的危險(xiǎn)因素。Noto 等［14］針對(duì)19 項(xiàng)隊(duì)列研究的Meta 分析顯示，糖尿病患者發(fā)生癌癥的總體風(fēng)險(xiǎn)比非糖尿病患者增加10%，相對(duì)危險(xiǎn)度（risk ratio，RR）＝1.10%，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為1.04～1.17。糖尿病患者發(fā)生結(jié)直腸癌［15］和乳腺癌［16］的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)增高了1.2～1.5倍。同時(shí)，糖尿病可促進(jìn)惡性腫瘤復(fù)發(fā)，對(duì)患者預(yù)后十分不利。一項(xiàng)關(guān)于女性乳腺癌的Meta分析研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)乳腺癌患者檢出乳腺癌時(shí)分期較晚，且全因死亡率增加［風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）＝1.49，95%CI＝1.21～2.56）］［17］。關(guān)于結(jié)直腸癌的Meta 分析結(jié)果顯示，糖尿病增加結(jié)直腸癌的短期及遠(yuǎn)期死亡率和復(fù)發(fā)率［18］。

基于糖尿病可增加惡性腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且關(guān)于糖尿病和腫瘤共同作用引起腸道菌群改變的文獻(xiàn)報(bào)道較少，本研究首先通過(guò)注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立糖尿病小鼠模型，并進(jìn)一步建立結(jié)直腸癌（CT26）和乳腺癌（4T1）的實(shí)體瘤模型，然后分析模型小鼠的體質(zhì)量、腫瘤體積、生存率和腸道菌群數(shù)據(jù)，以期探討糖尿病對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響，以及糖尿病和腫瘤聯(lián)合作用對(duì)腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠60 只，6 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（滬）2018-0004］；小鼠飼養(yǎng)于上海獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（滬）2016-0010］屏障設(shè)施。實(shí)驗(yàn)前至少適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周，自由飲食飲水，飼養(yǎng)室溫度控制為20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，晝夜各半循環(huán)照明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（SHVR1-SZ-20200420-03），實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則以確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。

1.1.2 細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)所用到的帶有l(wèi)uc 熒光標(biāo)記的小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞CT26-luc 和小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1-luc均為本實(shí)驗(yàn)室保存，用RPMI1640 培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.1.3 試劑與儀器

STZ 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；檸檬酸和檸檬酸鈉購(gòu)自上海滬試化工有限公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Puromycin 購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Eppendorf 5430R 高速冷凍離心機(jī)和移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；漩渦震蕩混勻器購(gòu)自上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；電子天平購(gòu)自美國(guó)Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

小鼠適應(yīng)環(huán)境后，分為空白對(duì)照、STZ、CT26、4T1、STZ+4T1 和STZ+CT26 共6 組，每組10 只。STZ、STZ+CT26 和STZ+4T1 這3 組小鼠于腹部皮下注射175 mg/kg的STZ，空白對(duì)照、CT26和4T1組小鼠注射與STZ溶液等量的緩沖液。1周后測(cè)量小鼠血糖，小鼠血糖穩(wěn)定在11 mmol/L以上，即為糖尿病模型構(gòu)建成功。使用提前培養(yǎng)的帶有l(wèi)uc 熒光素酶基因標(biāo)記的CT26 細(xì)胞和4T1細(xì)胞，在糖尿病小鼠模型基礎(chǔ)上于小鼠腋下接種形成實(shí)體瘤，制備糖尿病-腫瘤小鼠模型。CT26和STZ+CT26 組 小 鼠 注 射3×106個(gè)CT26 細(xì) 胞。4T1 和STZ+4T1 組 小 鼠 注 射3×106個(gè)4T1 細(xì) 胞。其他組小鼠注射等量的PBS。

1.2.2 模型動(dòng)物表觀數(shù)據(jù)測(cè)定

建模開(kāi)始后，每周使用電子天平測(cè)量一次各組小鼠的體質(zhì)量。腋下注射CT26和4T1細(xì)胞后，使用游標(biāo)卡尺每2天測(cè)量一次CT26、4T1、STZ+4T1和STZ+CT26組小鼠腫瘤的長(zhǎng)度（L）和寬度（W），計(jì)算腫瘤體積（V）。計(jì)算公式如下：V=L×W2/2。小鼠注射腫瘤細(xì)胞后，統(tǒng)計(jì)小鼠的生存率。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求［19］，腫瘤體積大于1 500 mm3時(shí)進(jìn)行安樂(lè)死，并判定為小鼠死亡，記錄每天的小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計(jì)生存率并繪制生存曲線。

1.2.3 小鼠糞便采集及腸道菌群分析

在造模成功后10 d，采集每組5 只實(shí)驗(yàn)小鼠的新鮮糞便，用無(wú)菌離心管收集新鮮的糞便樣本。將采集好的樣本貯藏于－80 ℃冰箱，由上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行糞便樣品的16 S V3～V4 區(qū)測(cè)序。利用QIIME2 基因云平臺(tái)（www.genescloud.cn）對(duì)腸道菌群原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和過(guò)濾，并通過(guò)DATA2和Vesearch方法對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行alpha 多樣性、beta 多樣性、物種組成和物種差異分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，使用GraphPad Prism 8 軟件制作統(tǒng)計(jì)圖。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化

對(duì)于糖尿病-結(jié)直腸癌小鼠模型（圖1A），7 d、14 d 的STZ+CT26 組小鼠體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01）；21 d 的STZ+CT26 組小鼠體質(zhì)量略有增加，但也低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。14 d的STZ+CT26組小鼠體質(zhì)量低于STZ組（P＜0.05），且明顯低于同組第7天（P＜0.01）。對(duì)于糖尿病-乳腺癌小鼠模型（圖1B），7 d 的STZ 組小鼠體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01）；14 d、21 d的STZ組和STZ+4T1組小鼠體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01），且STZ+4T1組小鼠體質(zhì)量明顯低于4T1 組（P＜0.01）。以上結(jié)果說(shuō)明，糖尿病和腫瘤同時(shí)作用可能比二者單獨(dú)作用對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響更大。

2.2 小鼠腫瘤體積變化

CT26 和STZ+CT26 組，以及4T1 和STZ+4T1組小鼠腫瘤體積相比，整體差異不明顯（圖1C～D）。

2.3 小鼠造模后生存率

生存曲線圖顯示，對(duì)于CT26（圖1E）和4T1（圖1F）而言，無(wú)論是糖尿病-結(jié)直腸癌模型還是糖尿病-乳腺癌模型，糖尿病合并腫瘤組小鼠的生存率明顯低于腫瘤組小鼠（P＜0.01）。結(jié)果提示，糖尿病與腫瘤共同作用可明顯降低小鼠生存率。

圖1 糖尿病-結(jié)直腸癌和糖尿病-乳腺癌模型小鼠的體質(zhì)量（A～B）、腫瘤體積（C～D）和生存曲線（E～F）變化Figure 1 Changes in the body mass（A-B），tumor volume（C-D），and survival curve（E-F）of the diabetes-colorectal cancer and diabetes-breast cancer model mice

2.4 小鼠糞便中腸道菌群分析

2.4.1 腸道菌群alpha多樣性改變

圖2 顯示了糖尿病-結(jié)直腸癌模型和糖尿病-乳腺癌模型小鼠的腸道菌群alpha 多樣性改變，其中Chao1 和Observed_species 指數(shù)表征豐度，Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性。STZ+CT26組小鼠糞便樣品的物種豐度低于空白對(duì)照組、STZ 組和CT26 組小鼠（P＜0.05），群落的多樣性［Shannon（P＝0.063），Simpson 指數(shù)（P＝0.057）］略低于空白對(duì)照組、STZ 組和CT26組，但差異尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A）。STZ+4T1組小鼠糞便樣品的物種豐度及群落多樣性指數(shù)與空白對(duì)照組、STZ組和4T1組之間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。等級(jí)豐度曲線顯示，STZ+CT26 組小鼠的腸道菌群豐度低于其他3 組（圖2C）；STZ+4T1 組小鼠的腸道菌群豐度與空白對(duì)照組、STZ組和4T1組相比，差異不明顯（圖2D）。

圖2E 和圖2F 顯示，隨著樣品序列數(shù)目增加，小鼠腸道菌群的稀釋曲線趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。同時(shí)，圖2E結(jié)果與alpha多樣性指數(shù)一致：在測(cè)序深度相同的情況下，STZ+CT26 組的微生物豐度低于空白對(duì)照組、STZ 組和CT26 組，說(shuō)明糖尿病合并結(jié)直腸癌比二者單發(fā)更明顯降低小鼠菌群豐度。而圖2F 顯示，在測(cè)序深度相同的情況下，STZ+4T1 組的菌群豐度低于空白對(duì)照組和4T1組，但高于STZ組。

圖2 糖尿病-結(jié)直腸癌和糖尿病-乳腺癌模型小鼠的腸道菌群alpha多樣性Figure 2 Alpha diversity of the intestinal flora of diabetes-colorectal cancer and diabetes-breast cancer model mice

2.4.2 腸道菌群beta多樣性改變

Beta 多樣性分析包括PCA、PCoA 和NMDS分析。PCA使用方差分析來(lái)反映二維坐標(biāo)圖上的多組數(shù)據(jù)之間的差異，可以檢測(cè)樣本之間的差異和距離。PCoA 用于評(píng)估數(shù)據(jù)的相似性或差異。NMDS 通?；贐ary-curtis 距離比較樣本組之間的細(xì)菌群落組成差異。圖形中每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣本，顏色表示樣本分組。該點(diǎn)的接近性反映了樣本組成之間的相似性。圖3A～D 中，STZ+CT26組的矩陣較CT26組和STZ組離空白對(duì)照組更遠(yuǎn)，說(shuō)明糖尿病和結(jié)直腸癌聯(lián)合作用會(huì)比糖尿病或結(jié)直腸癌單獨(dú)作用引起的腸道菌群beta多樣性改變更大。圖3E～H中，STZ+4T1組的矩陣較4T1組和STZ組離空白對(duì)照組更近，說(shuō)明糖尿病和乳腺癌聯(lián)合作用比糖尿病或乳腺癌單獨(dú)作用引起的腸道菌群beta多樣性改變更小。

圖3 糖尿病-結(jié)直腸癌（A～D）和糖尿病-乳腺癌（E～H）模型小鼠的腸道菌群beta多樣性Figure 3 Beta diversity of the intestinal flora of diabetes-colorectal cancer（A-D）and diabetes-breast cancer（E-H）model mice

2.4.3 腸道菌群物種組成改變

在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于分析，人為地給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系、種、屬、分組等）設(shè)置同一標(biāo)志，即分類(lèi)操作單元（operational taxonomic unit，OTU）；由OTU組成venn 圖，以反映腸道菌群物種的組成變化。對(duì)每個(gè)樣本而言，OTU豐度構(gòu)成該樣本的組成結(jié)構(gòu)，該結(jié)果是后續(xù)物種豐度研究的基礎(chǔ)。Venn圖可以直觀展示樣本中OTU 組成的相似性和特異性。如圖4顯示，STZ+CT26組共檢出OTU 5 917個(gè)，其中與空白對(duì)照組、STZ 組、CT26 組的共有OTU 分別為1 756 個(gè)、1 586 個(gè)和1 522 個(gè)，分別占總OTU 比例的29.68%、26.80%和25.72%；STZ+CT26 組與STZ 組和CT26 組的共有OTU 為992 個(gè)，其中不與空白對(duì)照組共有的OTU 為115個(gè)，占比11.59%。STZ+4T1組共檢出OTU 7 446個(gè)，其中與空白對(duì)照組、STZ組、4T1 組的共有OTU 分 別 為2 653 個(gè)、2 208 個(gè) 和1 973 個(gè)，分別占總OTU 比例的35.63%、29.65%和26.50%；STZ+4T1 組與STZ 組和4T1 組的共有OTU 為1 207 個(gè)，其中不與空白對(duì)照組共有的OTU 為294個(gè)，占比24.36%。STZ 組、CT26 組、4T1 組各檢出OTU 7 082 個(gè)、8 489 個(gè)和5 917 個(gè)，其中STZ 組和CT26 組共有OTU 為2 005 個(gè)，分別占STZ 組 和CT26 組 總OTU 比 例 的28.31% 和23.62%；STZ 組和4T1 組共有OTU 為1 586 個(gè)，分別占STZ 組和4T1 組總OTU 比例的22.39%和26.80%。

圖4 糖尿病-結(jié)直腸癌和糖尿病-乳腺癌模型小鼠腸道菌群的OTU venn圖Figure 4 OTU venn diagram of the intestinal flora of diabetes-colorectal cancer and diabetes-breast cancer model mice

圖5A和圖5C顯示了小鼠糞便樣品在門(mén)水平上的物種組成差異，各組樣本生成的OTU 主要由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）等組成，其中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在糖尿病-結(jié)直腸癌和糖尿病-乳腺癌模型中占比遠(yuǎn)高于其他菌。STZ 組和STZ+CT26組相較于其他組的放線菌門(mén)（Actinobacteria）細(xì)菌水平顯著升高（P＜0.05）。圖5B 和圖5D 顯示了小鼠糞便樣品在屬水平上的物種組成差異。各組樣本生成的OTU 主要由乳桿菌屬（Lactobacillus）、顫螺菌屬（Oscillospira）、螺桿菌屬（Helicobacter）等組成，其中乳桿菌屬和顫螺菌屬占絕對(duì)主導(dǎo)地位。STZ+CT26 組的乳桿菌屬（Lactobacillus）水平較空白對(duì)照組、STZ組和CT26 組高，STZ 組和STZ+CT26 組相較于其他組的棒桿菌屬（Corynebacterium）細(xì)菌水平顯著升高（P＜0.05）。

圖5 糖尿病-結(jié)直腸癌和糖尿病-乳腺癌模型小鼠的腸道菌群物種分類(lèi)學(xué)門(mén)和屬水平組成Figure 5 Taxonomic phyla and genus composition of the intestinal flora of diabetes-colorectal cancer and diabetes-breast cancer model mice

圖6 顯示了小鼠糞便樣品在門(mén)水平和屬水平上的物種組成熱圖。STZ+CT26 組相較于CT26組水平降低的物種屬有擬桿菌屬（Bacteroides）、別樣桿菌屬（Alistipes）、胃瘤球菌屬（Ruminococcus）和理研菌屬（Rikenella），相較于STZ 組水平降低的物種屬有腸球菌屬（Enterococcus）和氣球菌屬（Aerococcus），相較于空白對(duì)照組、STZ 組和CT26 組水平降低的物種屬為瘤胃球菌屬（［Ruminococcus］）、普氏菌屬（Prevotella）和臭桿菌屬（Odoribacter），相較于空白對(duì)照組、STZ 組和CT26 水平升高的物種屬為乳球菌屬（Lactococcus）和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）。STZ+4T1 組相較于4T1 組水平降低的物種屬有擬桿菌屬（Bacteroides）、別樣桿菌屬（Alistipes）、糞球菌屬（Coprococcus）、瘤胃球菌屬（［Ruminococcus］）和普氏屬（Prevotella）。STZ+4T1組相較于STZ組和4T1組升高的物種屬有魏斯氏菌屬（Weissella）、丁酸球菌屬（Butyricicoccus）、顫螺菌屬（Oscillospira）、普氏菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和變形菌屬（Proteus）。STZ+4T1組相較于STZ組降低的物種屬有擬桿菌屬（Bacteroides）、別樣桿菌屬（Alistipes）、糞球菌屬（Coprococcus）、幽門(mén)螺桿菌屬（Helicobacter）和胃螺桿菌樣菌屬（Flexispira）。

圖6 糖尿病-結(jié)直腸癌（A～B）和糖尿病-乳腺癌（C～D）模型小鼠的門(mén)和屬水平物種組成熱圖Figure 6 Heat map of species composition at the phylum and genus level of the intestinal flora of diabetes-colorectal cancer（A-B）and diabetes-breast cancer（C-D）model mice

3 討論

T2DM可能通過(guò)多種機(jī)制（如高血糖、糖脂代謝異常、慢性炎性反應(yīng)等）共同作用促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明，T2DM患者體內(nèi)循環(huán)胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）水平比健康人群顯著升高，高水平的IGF-1 與患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，且糖尿病患者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)高于非糖尿病患者［20］。在一項(xiàng)糖尿病合并結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)研究［21］中發(fā)現(xiàn)，2 000例腫瘤患者（惡性結(jié)直腸癌患者500 例，非惡性腫瘤患者1 500 例）中同時(shí)患有結(jié)直腸癌和T2DM 的患者占比達(dá)12.40%，而非結(jié)直腸癌患者中T2DM 患病率僅有3.93%，糖尿病合并結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)性顯著增加［比值比（odds ratio，OR）＝3.99，P＜0.01］；該研究［21］同時(shí)指出糖尿病可促進(jìn)結(jié)直腸癌病情進(jìn)展，糖尿病患者合并結(jié)直腸癌處于進(jìn)展期的比例顯著高于非糖尿病的結(jié)直腸癌患者（P＜0.05）。糖尿病合并結(jié)直腸癌患者死亡率較僅患結(jié)直腸癌的患者明顯升高（HR＝1.4，95%CI為1.0～2.0）［22］。大量流行病學(xué)研究也表明，T2DM患者的乳腺癌發(fā)病率更高，且同時(shí)患有T2DM和乳腺癌的患者腫瘤病理分期更晚，肌層浸潤(rùn)更深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多，預(yù)后更差［23］。T2DM可能是結(jié)直腸癌與乳腺癌的危險(xiǎn)因素之一。一項(xiàng)針對(duì)T2DM與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的Meta 分析［24］表明，T2DM 增加了消化系統(tǒng)惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)（RR＝1.52，95%CI為1.40～1.66），其中與結(jié)直腸癌合并的RR為1.32（95%CI為1.23～1.40）。同時(shí)有研究［25］指出，T2DM增加了生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（RR＝1.15，95%CI為1.03～1.28），其中T2DM與乳腺癌合并的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度為1.16（95%CI為1.03～1.32）。

腸道微生態(tài)在人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與吸收中承擔(dān)著重要角色，與多個(gè)組織、器官存在密切的相互作用，是人體代謝平衡的有力保障。近年來(lái)隨著宏基因組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)在微生態(tài)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，通過(guò)分析不同人群的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)和特征，腸道微生態(tài)與糖尿病之間的研究也層出不窮。Larsen 等［26］發(fā)現(xiàn)，T2DM 患者腸道中厚壁菌門(mén)和梭菌屬所占的比例顯著降低，擬桿菌與厚壁菌的比例與血糖水平有關(guān)。華大基因的研究者［27］對(duì)T2DM 患者的腸道細(xì)菌含量進(jìn)行了分析，鑒定并驗(yàn)證了約6 萬(wàn)個(gè)T2DM 相關(guān)分子標(biāo)志，發(fā)現(xiàn)T2DM患者腸道菌群的豐度及分布與健康人群存在差異，提示T2DM打破了人體腸道菌群平衡。

腸道菌群平衡被打破有可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。腸道菌群活躍于機(jī)體的各種代謝過(guò)程，如多糖代謝、膽汁酸和類(lèi)固醇代謝及腸道生理功能的維持等。腸道菌群失調(diào)即細(xì)菌種類(lèi)、數(shù)量及分布發(fā)生變化，偏離正常結(jié)構(gòu)，會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。腸道菌群失衡引起的慢性炎癥狀態(tài)與機(jī)體自身免疫有關(guān)聯(lián)，抑制腫瘤免疫反應(yīng)等［28］。同時(shí)，腸道細(xì)菌也會(huì)產(chǎn)生有毒或致癌的代謝產(chǎn)物，例如腸道厭氧菌能參與膽汁酸的代謝，產(chǎn)生次級(jí)膽汁酸并誘導(dǎo)DNA 損傷，增加腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者腸道菌群的構(gòu)成與健康人群相差較大［29］。結(jié)直腸癌患者的菌群失衡發(fā)生率很高，他們的菌群結(jié)構(gòu)或許相似，但菌群多樣性顯著降低。在結(jié)直腸癌患者腸道中，部分變形桿菌、脆弱擬桿菌（產(chǎn)腸毒素型）等有害菌在腸道細(xì)菌中占比明顯升高。

腸道菌群失衡可能與多種調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化（如擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)所占比例降低，產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌數(shù)量減少等）與T2DM密切相關(guān)，可能通過(guò)參與體內(nèi)物質(zhì)的合成，誘發(fā)人體產(chǎn)生多種機(jī)制（如慢性炎性反應(yīng)、代謝性?xún)?nèi)毒素血癥等），繼而引發(fā)胰島β 細(xì)胞的破壞和凋亡、降低人體對(duì)胰島素的敏感性，最終導(dǎo)致T2DM的發(fā)生。近年來(lái)的研究指出，多種機(jī)制共同作用促進(jìn)了糖尿病相關(guān)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。免疫細(xì)胞參與肥胖和肥胖導(dǎo)致的T2DM進(jìn)展。肥胖會(huì)對(duì)包括先天性T 細(xì)胞群——黏膜相關(guān)恒定T 細(xì)胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT）在內(nèi)的免疫細(xì)胞的比例和功能產(chǎn)生負(fù)面影響。Endesfelder 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，肥胖及T2DM 患者外周MAIT細(xì)胞的比例較空白對(duì)照組減低，并且這種減低的趨勢(shì)與該細(xì)胞參與的其他疾病相比更為顯著。MAIT 細(xì)胞被激活后分泌多種細(xì)胞因子，直接或間接參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系［31］。糖尿病可能通過(guò)改變腸道菌群影響免疫細(xì)胞亞群，最終對(duì)腫瘤的進(jìn)展造成影響。

本研究通過(guò)小鼠模型研究了糖尿病與腫瘤聯(lián)合作用對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響。首先使用CT26 和4T1細(xì)胞建立了糖尿病聯(lián)合CT26或4T1兩種小鼠模型。通過(guò)收集小鼠的體質(zhì)量、腫瘤體積和生存率數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于兩種糖尿病-腫瘤模型而言，糖尿病和腫瘤聯(lián)合作用會(huì)使小鼠的生存率較僅患腫瘤的小鼠顯著降低。本研究進(jìn)一步關(guān)注了腸道菌群在糖尿病影響腫瘤進(jìn)展中的變化，收集各組小鼠糞便，采用16S 測(cè)序法分析腸道菌群變化。根據(jù)稀釋曲線、等級(jí)豐度曲線和alpha 多樣性指數(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病-腫瘤聯(lián)合作用降低了小鼠腸道菌群的豐富度和均勻度；PCA、PcoA和NMDS 分析顯示，糖尿病-腫瘤聯(lián)合作用改變了小鼠腸道菌群的菌群構(gòu)成；針對(duì)門(mén)水平和屬水平的物種組成分析和物種組成熱圖結(jié)果顯示，糖尿病-腫瘤聯(lián)合作用改變了小鼠腸道菌群的菌種組成。本研究結(jié)果提示，在糖尿病合并結(jié)直腸癌/乳腺癌小鼠模型中，糖尿病和結(jié)直腸癌/乳腺癌聯(lián)合作用促進(jìn)了結(jié)直腸癌/乳腺癌的進(jìn)展，并對(duì)腸道菌群的構(gòu)成造成不利影響。