可視化核酸檢測(cè)技術(shù)RPA-LFD 的研究和應(yīng)用進(jìn)展

于靈芝, 陶凌云,魏曉鋒

(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,上海201203)

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase ploymerase amplication， RPA） 是2006 年 由Piepenburg 等發(fā)明的一種新型恒溫（37～42 ℃）核酸擴(kuò)增技術(shù)［1］，既可以擴(kuò)增DNA 也可以擴(kuò)增RNA，省去了額外的cDNA合成步驟，整個(gè)過(guò)程進(jìn)行得非常快，一般可在10 min內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物［2］。與PCR 相比，整個(gè)過(guò)程不需要高溫變性和低溫退火，不依賴(lài)于精密的溫控設(shè)備PCR儀。RPA對(duì)儀器的要求大大降低，反應(yīng)時(shí)間明顯縮短，簡(jiǎn)單、快速、高效，靈敏度高，特異性強(qiáng)，因此被認(rèn)為是一種可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)［3］。

RPA擴(kuò)增結(jié)果可以通過(guò)凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光和側(cè)流層析試紙條等多種方法讀取。RPA-LFD檢測(cè)簡(jiǎn)單快速，設(shè)備便于攜帶，結(jié)果可肉眼判讀，可以真正實(shí)現(xiàn)病原體快速現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)，為病原體監(jiān)測(cè)和疾病防控提供了技術(shù)手段。但是，作為一項(xiàng)新的病原體檢測(cè)技術(shù)，目前RPA-LFD尚未得到廣泛研究。近年來(lái)，在人、畜、禽及水產(chǎn)動(dòng)物上已有RPA-LFD 研究報(bào)告，而在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體檢測(cè)方面的研究較少。本文對(duì)RPALFD檢測(cè)病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等病原體核酸的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，提示該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體能快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，從而在進(jìn)行快速有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督中具有重要的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步推廣。

1 RPA-LFD技術(shù)介紹

1.1 RPA-LFD的檢測(cè)原理

RPA-LFD 是一項(xiàng)將重組酶聚合酶擴(kuò)增、膠體金標(biāo)記（三明治夾心法）、分子雜交和側(cè)向流層析等方法相結(jié)合，且結(jié)果可視化的核酸檢測(cè)技術(shù)。目前研究中使用最多的是英國(guó)TwistDX Inc公司設(shè)計(jì)的TwistAmp nfo 試劑盒（Nfo為核酸外切酶Ⅳ）。其檢測(cè)原理如圖1 所示。首先，上游引物和含有3’端生物素（biotin）標(biāo)記的下游引物在重組酶和聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增，含有羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的特異性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，形成5’端為FAM 標(biāo)記，3’端為生物素標(biāo)記的產(chǎn)物。將該產(chǎn)物加到側(cè)向流動(dòng)試紙條的樣品孔中，通過(guò)毛細(xì)作用層析至結(jié)合墊（固定有標(biāo)記抗FAM 抗體的膠體金顆粒），該產(chǎn)物中的5’端FAM 與抗FAM 抗體的膠體金顆粒結(jié)合形成復(fù)合物。該復(fù)合物層析到檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）時(shí)，因T 線(xiàn)固定有鏈霉親和素（SA），含有生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物被鏈霉親和素捕獲顯紅色；沒(méi)有被捕獲的復(fù)合物繼續(xù)向上層析至質(zhì)控線(xiàn)（C 線(xiàn)）時(shí)，因C 線(xiàn)固定有特異性抗體，被特異性抗體捕獲顯紅色。此時(shí)結(jié)果為陽(yáng)性。該方法一般在5 min內(nèi)便可通過(guò)肉眼讀取檢測(cè)結(jié)果［3］。

圖1 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)-橫向流動(dòng)試紙條（RPA-LFD）的檢測(cè)原理Figure 1 Detection principle of recombinase ploymerase amplication-lateral flow dipstick（RPA-LFD）

1.2 RPA-LFD的優(yōu)點(diǎn)

RPA-LFD 不需要復(fù)雜的熱循環(huán)，只需要簡(jiǎn)單的加熱設(shè)備（如人體腋下夾持），37～42 ℃恒溫10～30 min便可完成核酸擴(kuò)增；之后將擴(kuò)增產(chǎn)物滴在側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l上，大約5 min 后即可肉眼觀測(cè)到結(jié)果。因此，該方法操作簡(jiǎn)單、快速，而且檢測(cè)結(jié)果的特異度和靈敏度與qPCR 相當(dāng)，不必依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室和精密儀器，無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員，即可輕松實(shí)現(xiàn)病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

1.3 RPA-LFD技術(shù)難點(diǎn)

目前，RPA-LFD 的一個(gè)重要技術(shù)瓶頸是其引物和探針既沒(méi)有明確的設(shè)計(jì)原則，也沒(méi)有專(zhuān)業(yè)的設(shè)計(jì)軟件。英國(guó)TwistDX Inc 公司對(duì)RPA-LFD引物和探針的設(shè)計(jì)給出了簡(jiǎn)單的指導(dǎo)建議：RPA引物設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一般為35 bp，引物的5’末端應(yīng)避免鳥(niǎo)嘌呤重復(fù)，GC 含量應(yīng)控制在30%～70%；引物的3’末端的任何一個(gè)堿基錯(cuò)配都會(huì)嚴(yán)重影響RPA擴(kuò)增效率，下游引物和探針序列之間疊加易形成二聚體，降低擴(kuò)增效果。探針設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為46～52 bp，5’末端含有抗原標(biāo)記（如FAM），3’末端含有聚合酶延伸封閉基團(tuán)（如磷酸化基團(tuán)）， 中部含有一個(gè)四氫呋喃基團(tuán)（tetrahydrofuran，THF）；而且5’末端到THF 位點(diǎn)含有不少于30個(gè)堿基，3’末端到THF位點(diǎn)含有不少于15 個(gè)堿基，擴(kuò)增時(shí)THF 可被Nfo酶切割，DNA聚合酶可以在該羧基端位點(diǎn)進(jìn)行延伸，與生物素（biotin）標(biāo)記的下游引物一起擴(kuò)增出含有FAM和biotin雙標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。

研究者通常需要手動(dòng)設(shè)計(jì)不同的引物和探針。探針長(zhǎng)度以及探針相對(duì)于引物的最佳位置并沒(méi)有固定的設(shè)計(jì)規(guī)則，這導(dǎo)致有很多種可能的組合，無(wú)疑會(huì)增加該方法中引物和探針合成及篩選的成本。因此，應(yīng)嚴(yán)格按照指導(dǎo)建議進(jìn)行設(shè)計(jì)，高質(zhì)量的引物和探針才可以使該方法的靈敏度和特異度得到保證［4］。隨著RPA-LFD技術(shù)的廣泛研究和應(yīng)用，不久的將來(lái)必然會(huì)開(kāi)發(fā)出一種軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物和探針，那么該技術(shù)的應(yīng)用成本將大大降低。

另外，由于RPA-LFD 方法具有高效擴(kuò)增的高靈敏度，在開(kāi)管蓋、取樣、上樣以及樣本在側(cè)向流動(dòng)試紙條上層析的過(guò)程中，氣體與樣本液面摩擦可能產(chǎn)生核酸氣溶膠污染，在下一次實(shí)驗(yàn)時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。所以，RPA-LFD 檢測(cè)應(yīng)盡量在通風(fēng)性好、空曠的環(huán)境條件下操作［5］。

1.4 RPA-LFD應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)核酸提取

現(xiàn)場(chǎng)分子診斷需要解決3 個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，包括樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增及檢測(cè)，而樣品準(zhǔn)備是其中最大的挑戰(zhàn)［6］。楊洋等［3］同時(shí)試驗(yàn)了cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠的兩種核酸提取方法。孫魁等［2］建立了堿裂解法結(jié)合紙基核酸純化的樣本處理體系，整個(gè)過(guò)程只需10～15 min。以上方法均擺脫了核酸提取過(guò)程中離心機(jī)的束縛，其與RPALFD 方法聯(lián)用，可以使分子診斷中的樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)擺脫實(shí)驗(yàn)室束縛，使得RPALFD方法真正應(yīng)用于臨床樣本的快速現(xiàn)場(chǎng)診斷。

2 RPA-LFD研究現(xiàn)狀

RPA-LFD 方法由于操作方便、快速、高效，已在人類(lèi)、畜禽及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病原體檢測(cè)中進(jìn)行了較多的研究。

2.1 RPA-LFD在人類(lèi)和畜禽上的研究進(jìn)展

2.1.1 用于病毒檢測(cè)

Lau等［7］優(yōu)化了一種快速檢測(cè)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 （severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）-RPA-LFD 方法，RTRPA 在37 ℃恒溫浴中反應(yīng)20 min，在LFD 上反應(yīng)5 min即肉眼可見(jiàn)結(jié)果。對(duì)78例陽(yáng)性和35例陰性鼻咽標(biāo)本進(jìn)行敏感性和特異性分析，結(jié)果顯示RT-RPA-LFD 和反轉(zhuǎn)錄定量PCR （reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR）的檢測(cè)限值分別為7.7和5.0拷貝/μL RNA，且均與其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)。RT-RPA 的臨床敏感度和特異度分別為98%和100%。

Xiong 等［8-9］建立了檢測(cè)登革熱病毒（Dengue virus，DENV）的RT-RAA-LFD（RAA同RPA）方法。RT-RAA 在37 ℃恒溫浴中反應(yīng)20 min，擴(kuò)增子在LFD 上反應(yīng)3 min 即肉眼可見(jiàn)結(jié)果。RT-RAA-LFD方法的檢測(cè)限值為10拷貝/μL RNA，特異度高。RT-RAA-LFD 與商業(yè)化的RTqPCR 相比，在247 例臨床樣本中檢測(cè)一致性系數(shù)為0.957。

Gao 等［10］采用RPA-LFD 方法對(duì)豬德?tīng)査跔畈《荆╬orcine delta-coronavirus，PDCoV）進(jìn)行了研究，PDCoV 在37 ℃擴(kuò)增10 min，結(jié)果表明其檢測(cè)限值為1×102拷貝/μL，靈敏度比普通PCR 高10 倍，且與豬的其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)，陽(yáng)性檢出率（26.47%）也比普通PCR（23.53%）高。

此外，研究者對(duì)流感A 和B 病毒［11］、卡薩奇病毒［12］、豬塞尼卡谷病毒［4］、非洲豬瘟［13］、雞傳染性喉氣管炎病毒［14］、腺病毒［15］、新城疫病毒［16］、禽流感H9N2 及H7N9［17-18］、貓細(xì)小病毒［19］、南美藍(lán)對(duì)蝦濃核病毒［20］、鯉魚(yú)水腫病 毒［21］和錦鯉皰疹病毒-3［21］進(jìn)行了RPALFD 方法的研究，結(jié)果均顯示RPA-LFD 方法檢測(cè)快速，結(jié)果可靠，敏感度和特異度高，優(yōu)于PCR方法，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。

2.1.2 用于細(xì)菌檢測(cè)

Peng 等［22］建立了檢測(cè)類(lèi)鼻疽伯克氏菌的RPA-LFD 方法，該方法能在30 min 內(nèi)裸眼看到結(jié)果，最低檢測(cè)限值達(dá)20 fg（約25.6 個(gè)拷貝），靈敏度與qPCR 相當(dāng)，而且與其他類(lèi)鼻疽菌群復(fù)合物無(wú)交叉擴(kuò)增反應(yīng)。

Zhao 等［23］建立了檢測(cè)禽分枝桿菌副結(jié)核亞種的RPA-LFD 方法，在39 ℃擴(kuò)增30 min 即可肉眼觀察結(jié)果，最低檢出限值是每個(gè)反應(yīng)8 個(gè)拷貝，與PCR相當(dāng)，且對(duì)其他5種分枝桿菌無(wú)交叉反應(yīng)。與qPCR相比，RPA-LFD檢測(cè)的敏感度為100%，特異度為97.63%。

此外，RPA-LFD 檢測(cè)豬胞內(nèi)勞森氏菌與普通PCR 結(jié)果的符合率為100%［24］。Gao 等［25］建立了檢測(cè)貝類(lèi)沙門(mén)氏菌的RPA-LFD 方法，在40 ℃只需擴(kuò)增8 min就能達(dá)到檢測(cè)閾值，每個(gè)反應(yīng)（20 μL）可檢測(cè)到100 fg DNA，其實(shí)際性能優(yōu)于qPCR。

2.1.3 用于寄生蟲(chóng)檢測(cè)

Sun等［5］建立了檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)SjR2基因的LFD-RPA 檢測(cè)方法，在25～45 ℃條件下，反應(yīng)15～20 min后可通過(guò)肉眼判定糞便樣品的檢測(cè)結(jié)果，最低檢測(cè)限值為5 fg，這與qPCR 相同。與金標(biāo)準(zhǔn)Kato-Katz 法相比，LFD-RPA 檢測(cè)的敏感度為92.68 %，特異度為100 %，一致性系數(shù)為0.947；而酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的敏感度為85.71 %，特異度為93.55 %，一致性系數(shù)為0.793；間接血凝試驗(yàn)的檢測(cè)敏感度為78.57 %，特異度為83.87%，一致性系數(shù)為0.600。

此外，有學(xué)者建立了針對(duì)人惡性瘧原蟲(chóng)［26］和犬吉氏巴貝斯蟲(chóng)［27］等的LFD-RPA檢測(cè)方法，結(jié)果均表明該方法具有敏感、特異、快速的優(yōu)勢(shì)。

2.1.4 用于支原體檢測(cè)

Zhao 等［28］用RPA-LFD 方法檢測(cè)了442 個(gè)牛支原體樣本，39 ℃擴(kuò)增30 min 即可觀察檢測(cè)結(jié)果；同時(shí)與qPCR結(jié)果比較，RPA-LFD檢測(cè)的靈敏度為99.00%，特異度為95.61%，一致性系數(shù)是0.902，最低檢測(cè)限值為每個(gè)反應(yīng)20個(gè)拷貝。

2.2 RPA-LFD在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究進(jìn)展

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926［29］規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)檢測(cè)方法，多采用培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光實(shí)驗(yàn)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)等。北京和黑龍江等地方標(biāo)準(zhǔn)［30-32］進(jìn)一步規(guī)定了實(shí)驗(yàn)用牛、實(shí)驗(yàn)用羊、實(shí)驗(yàn)用豬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物學(xué)檢測(cè)方法，包括抗原檢測(cè)、抗體檢測(cè)和核酸檢測(cè)。上述標(biāo)準(zhǔn)中的方法檢測(cè)時(shí)間少則數(shù)小時(shí)，多則數(shù)周；如果發(fā)現(xiàn)可疑結(jié)果，還需要重新檢測(cè)，耗時(shí)耗力。近年來(lái)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)［33-35］采用了熒光定量PCR方法對(duì)螺桿菌、肺支原體和小鼠肝炎病毒等一系列微生物進(jìn)行檢測(cè)，證明該方法快速、靈敏、特異，但需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員、精密儀器和實(shí)驗(yàn)室操作環(huán)境。

對(duì)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)需要排除的微生物，包括口蹄疫病毒、山羊/綿羊痘病毒、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒、偽狂犬病病毒、多殺性巴氏桿菌和布魯氏菌等，目前也有了一些應(yīng)用RPALFD 檢測(cè)的研究結(jié)果。例如，Wang 等［36-37］建立了檢測(cè)口蹄疫病毒的RPA-LFD 方法，38 ℃擴(kuò)增20 min 即可觀察到結(jié)果；同時(shí)與qPCR 比較，該方法對(duì)質(zhì)粒DNA的最低檢測(cè)限值為每個(gè)反應(yīng)3個(gè)拷貝，對(duì)病毒RNA 的最低檢測(cè)限值為每個(gè)反應(yīng)50 個(gè)拷貝，對(duì)其他氣泡性病變的病毒無(wú)交叉反應(yīng)。通過(guò)126例臨床樣本檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RPA-LFD與qPCR 檢測(cè)結(jié)果的一致性為98.41%。同時(shí)，通過(guò)對(duì)不一致陽(yáng)性結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，RPA-LFD 方法比qPCR更敏感。

Tu等［38］建立了檢測(cè)山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒的RPA-LFD 方法，37 ℃、30 min 完成反應(yīng)，最低檢測(cè)限值為80 pg總DNA和10個(gè)拷貝質(zhì)粒DNA，與羊痘和牛白血病等病毒無(wú)交叉反應(yīng)。Yang等［39］建立了檢測(cè)山羊/綿羊痘病毒的RPA-LFD方法，38 ℃下溫浴20 min完成反應(yīng)，與小反芻獸疫和口蹄疫等病毒無(wú)交叉反應(yīng)。針對(duì)107例臨床標(biāo)本的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，該方法能特異性檢測(cè)羊組織和血液中的山羊/綿羊痘病毒，與實(shí)時(shí)qPCR對(duì)比無(wú)差異。

此外有研究發(fā)現(xiàn)，采用RPA-LFD 方法在39 ℃反應(yīng)20 min可快速檢測(cè)出偽狂犬病病毒［40］、布魯氏菌［41］和多殺性巴氏桿菌［42］，經(jīng)與實(shí)時(shí)定量PCR 方法或?qū)崟r(shí)RPA 方法比較，以及臨床樣本驗(yàn)證，結(jié)果顯示RPA-LFD 檢測(cè)方法快速、靈敏、特異。

需要強(qiáng)調(diào)的是，本文介紹的RPA-LFD 檢測(cè)方法不需要非常專(zhuān)業(yè)的人員，不依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室，可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，30 min左右即可目測(cè)得到結(jié)果，這為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物監(jiān)測(cè)提供了一種快速、便攜、靈敏和特異的替代工具，也為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)提供一種新的檢測(cè)手段。

3 展望

近年來(lái)，RPA-LFD 技術(shù)作為一種快速的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，以其獨(dú)特的優(yōu)越性引起了研究者們的廣泛重視。它同時(shí)滿(mǎn)足以下所有快速分子診斷的標(biāo)準(zhǔn)：快速臨床確診，非實(shí)驗(yàn)人員操作，較低的檢測(cè)成本，快速進(jìn)行所有檢測(cè)，可以接受的檢測(cè)效果，以及與金標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)或者更低的成本效率［43-44］。隨著該技術(shù)的不斷成熟和發(fā)展，RPA-LFD 可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)，這將對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的監(jiān)督檢測(cè)，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全生產(chǎn)和使用具有非常重要的作用，從而有效避免動(dòng)物疫病帶來(lái)的重大經(jīng)濟(jì)損失。