影響細(xì)菌人工染色體轉(zhuǎn)基因小鼠制備效率的因素分析

王芊芊, 王 偉, 劉 睿, 衛(wèi) 振，劉 沖

(1. 浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,杭州310058; 2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,杭州310058)

轉(zhuǎn)基因小鼠現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因功能研究、腫瘤學(xué)研究、發(fā)育生物學(xué)研究和基因治療等眾多生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。用于DNA 片段構(gòu)建的載體（vector）系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建過(guò)程中的重要工具。其中，細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）相較于質(zhì)粒（plasmid）的系統(tǒng)容量大，相較于黏粒（cosmid）和酵母人工染色體等則有穩(wěn)定性較好和便于通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)等優(yōu)點(diǎn)［1-6］。但是由于BAC載體承載大片段基因組DNA（＞80 kb），與普通小片段DNA（＜20 kb）轉(zhuǎn)基因小鼠相比整合率較低［7-8］，且BAC注射液易存在胚胎發(fā)育阻滯和大片段易降解等不足［9-12］，國(guó)內(nèi)鮮有研究機(jī)構(gòu)能穩(wěn)定制備BAC轉(zhuǎn)基因小鼠。

轉(zhuǎn)基因小鼠研制過(guò)程中各個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的微小差異都可直接影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本文通過(guò)對(duì)本中心歷時(shí)兩年的BAC 轉(zhuǎn)基因小鼠研制數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較了實(shí)驗(yàn)小鼠背景、BAC質(zhì)粒注射濃度、BAC 質(zhì)粒的片段大小和BAC 注射液存放時(shí)間等因素，以期選出最佳的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，從而獲得最高的BAC陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠效率。

1 材料與方法

1.1 BAC DNA的純化與制備

1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠的準(zhǔn)備

用于收集顯微注射的受精卵的小鼠共有兩種背景：C57BL/6J（B6）和FVB/N，均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2017-0005］。雄鼠為同背景3～6 月齡，單籠飼養(yǎng)；雌鼠每籠5只飼養(yǎng)。代孕母鼠為ICR，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。ICR雄鼠6～8周時(shí)在SPF 屏障系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行結(jié)扎手術(shù)，ICR 雌鼠為12～20周。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均為SPF級(jí)，飼養(yǎng)在本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障設(shè)施［SYXK（浙）2018-0016］的獨(dú)立通風(fēng)飼養(yǎng)籠盒內(nèi)，自由取食及飲水。飼養(yǎng)間內(nèi)溫度為22～24 ℃，12 h/12 h 明暗交替。研究中涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)為ZJU20200140）。

1.3 超數(shù)排卵和受精卵收集

實(shí)驗(yàn)前1 周購(gòu)買(mǎi)3～4 周的供卵雌鼠（C57 BL/6J和FVB/N），在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)1 周后，注射10 U 孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG），46～50 h 后注射10 U 人絨毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin，hCG）。注射hCG 后將雌鼠與單籠飼養(yǎng)的同品系雄鼠合籠，合籠后第2天早上檢查雌鼠的見(jiàn)栓情況。供卵的C57BL/6J 和FVB/N雌鼠均采用同樣的促排卵藥物劑量和注射間隔時(shí)間。

將見(jiàn)栓的供卵雌鼠挑出，安樂(lè)死后，剪下雙側(cè)的輸卵管，在M2 胚胎培養(yǎng)液（美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品，貨號(hào)M7167）中漂洗后，置于15 mg/mL M2 的透明質(zhì)酸酶液滴內(nèi)，用顯微鑷子刺破輸卵管的膨大部釋放受精卵團(tuán)，約3 min 后將消化掉卵丘細(xì)胞的卵子用口吸管轉(zhuǎn)移至M2 微滴中，多次漂洗后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)待用。

1.4 受精卵原核顯微注射

用于原核顯微注射的持卵針為自制（外徑120 μm，內(nèi)徑50 μm），注射針為購(gòu)買(mǎi)的商品化注射針（美國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品，型號(hào)Femtotips?Ⅱ）。顯微操作系統(tǒng)工作站包括熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品，型號(hào)IX71）、顯微操作臂和顯微注射泵（均為美國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品）等。

每次實(shí)驗(yàn)前將制備好的BAC DNA 溶液通過(guò)微量加樣吸頭（美國(guó)Eppendorf MicroloaderTM產(chǎn)品，0.5～20 μL）灌入顯微注射針內(nèi)，再將持卵針和注射針固定于顯微操作臂上。將盛有受精卵的培養(yǎng)皿置于顯微鏡下，調(diào)整好持卵針與注射針的位置，選取有清晰雄原核和雌原核的受精卵，將BAC DNA 注入其中一個(gè)原核中（看到核膜有明顯膨脹即停止注射）。注射后的胚胎放入M2微滴中，轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，0.5 h后移植或者放入KSOM（美國(guó)Millipore 公司產(chǎn)品，貨號(hào)M-107-D）微滴中，轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，過(guò)夜培養(yǎng)至第2 天發(fā)育到2 細(xì)胞期后移植。

1.5 注射后胚胎移植

稱(chēng)取戊巴比妥鈉粉劑，用無(wú)菌水配制成1%戊巴比妥鈉麻醉劑，充分溶解后，用0.22 μm 的濾器（購(gòu)自美國(guó)Millipore公司）過(guò)濾待用。見(jiàn)栓0.5 d 的受體ICR（ICR 雌鼠與結(jié)扎雄鼠合籠，第2 天早上檢栓，記為見(jiàn)栓0.5 d）按40～50 mg/kg的劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，置于體式顯微鏡（Olympus）下剪去體背一側(cè)小面積的被毛，用75%乙醇溶液消毒皮膚。然后在背部相當(dāng)于最后一根肋骨的位置剪開(kāi)一個(gè)縱向切口，用小鑷子小心夾住脂肪墊，牽引出卵巢、輸卵管和子宮，用脂肪夾夾住脂肪墊，固定好卵巢和輸卵管。在解剖鏡下找到輸卵管的傘口，用維納斯剪在卵巢囊膜上避開(kāi)大血管剪開(kāi)一個(gè)小口。用移植針小心吸取當(dāng)天注射受精卵或注射后發(fā)育至2細(xì)胞的胚胎25～28 枚，插入單側(cè)輸卵管的傘口，吹入胚胎。將脂肪墊、卵巢和輸卵管一起放回腹腔中，分別縫合肌肉層和皮膚。

1.6 基因型鑒定

待仔鼠出生7～10 d，剪取腳趾編號(hào)，剪腳趾過(guò)程中對(duì)仔鼠輔以異氟烷氣麻。并用腳趾組織提取DNA。針對(duì)不同的BAC 片段至少設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用PCR的方法鑒定目的基因是否整合至小鼠基因組。對(duì)鑒定為陽(yáng)性的小鼠采用免疫熒光染色的方法復(fù)核。

我抓住那只最肥的蘆花雞，懷著滿心愧疚，提刀在雞頸上拉了個(gè)口子。雞血涌出來(lái)，像一線猩紅的淚水。抱著痛苦抽搐的蘆花雞，我眼窩也潮熱起來(lái)，蹲在那兒直念叨：“雞呀雞呀你莫怪，你是人家一盤(pán)菜，早做菜來(lái)早投胎，轉(zhuǎn)世做人來(lái)討債！”

1.7 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)說(shuō)明

胚胎發(fā)育率是小鼠胚胎經(jīng)原核顯微注射，轉(zhuǎn)移至KSOM（Millipore）培養(yǎng)液滴中，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)后，于顯微注射實(shí)驗(yàn)第2 天統(tǒng)計(jì)發(fā)育至2 細(xì)胞期的胚胎數(shù)占注射后形態(tài)完整的胚胎總數(shù)的比例。仔鼠出生率為出生的仔鼠數(shù)量與移植胚胎數(shù)量的比例。轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率為陽(yáng)性BAC 轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)量與出生小鼠數(shù)量的比例。

本研究采用SPSS 16.0 和Graphpad 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制圖。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)分析；多組間比較用方差分析，組內(nèi)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；方差齊性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)不適合方差分析的數(shù)據(jù)，則采用卡方檢驗(yàn)。以P值＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BAC 注射液濃度與仔鼠出生率和轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的關(guān)系

用C57BL/6J作為實(shí)驗(yàn)背景鼠時(shí)，選取了4種質(zhì)量濃度的BAC 注射液，分別為0.75、1.0、1.5和2.0 ng/μL。BAC 注射液質(zhì)量濃度為0.75 ng/μL時(shí)，仔鼠出生率最高為（16.52±0.79）%（n＝2），但陽(yáng)性率為0。當(dāng)BAC 注射液質(zhì)量濃度為2 ng/μL 時(shí)，仔鼠出生率最低為（14.08±6.01）%（n＝4），且陽(yáng)性率為0。當(dāng)BAC注射液質(zhì)量濃度為1.5 ng/μL 時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率最高，為（6.85±1.71）%（n＝23）。

用FVB/N 作為實(shí)驗(yàn)背景鼠時(shí)，同樣選取了0.75、1.0、1.5 和2.0 ng/μL 共4 種質(zhì)量濃度的BAC注射液。BAC注射液質(zhì)量濃度為0.75 ng/μL時(shí)，仔鼠出生率最高為（21.80±4.07）%（n＝4），但陽(yáng)性率僅為（1.67±1.67）%（n＝4）。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 ng/μL 和2.0 ng/μL 時(shí)，仔鼠出生率分別為（17.65±2.92）%（n＝4）和（15.80±7.53）%（n＝3），陽(yáng)性率為（7.15±4.13）%（n＝4）和（3.70±3.70）%（n＝3）。BAC 注射液質(zhì)量濃度為1.5 ng/μL 時(shí)，仔鼠出生率為（21.44±1.31）%（n＝58），陽(yáng)性率達(dá)到最高值為（12.86±1.57）%（n＝58）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析C57BL/6J 和FVB/N 兩種實(shí)驗(yàn)小鼠在4 種質(zhì)量濃度的BAC 注射液下的仔鼠出生率，結(jié)果顯示不同濃度之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.305，圖1A）；而轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率在不同濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.028，圖1B）。

圖1 BAC注射液質(zhì)量濃度與C57BL/6J、FVB/N仔鼠出生率（A）和轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率（B）的關(guān)系Figure 1 The relationships of BAC DNA concentration with birth rate(A)and transgene positive rate(B)of C57BL/6Jand FVB/N mice

2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠的背景與轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)選取C57BL/6J 和FVB/N 兩種背景的實(shí)驗(yàn)小鼠作為供卵鼠。注射所用的BAC 制備方法與受體小鼠相同。共注射了17 種不同的BAC DNA 溶液，其中8 種BAC 質(zhì)粒以C57BL/6J 小鼠為背景，另9 種BAC 質(zhì)粒以FVB/N 為背景。分別統(tǒng)計(jì)了C57BL/6J 和FVB/N 兩種小鼠在4 種注射液濃度下的胚胎發(fā)育率、仔鼠出生率、轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率差異。

C57BL/6J 小鼠的胚胎發(fā)育率為（81.76±2.55）%（n＝35），F(xiàn)VB/N 小鼠的胚胎發(fā)育率為（84.62±3.18）%（n＝21），略高于C57BL/6J 小鼠，但兩者之間并沒(méi)有顯著差異（P＝0.488，圖2A）。

C57BL/6J 的仔鼠出生率為（14.85±1.38）%（n＝55）。FVB/N 的仔鼠出生率為（17.39±1.62）%（n＝33），略高于C57BL/6J小鼠。兩者之間并沒(méi)有顯著差異（P=0.245，圖2B）。

C57BL/6J 的轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率為（3.75±1.05）%（n＝49），F(xiàn)VB/N 的轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率為（9.34±2.11）%（n＝31）。C57BL/6J的轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率顯著低于FVB/N（P＝0.011，圖2C）。

圖2 兩種實(shí)驗(yàn)小鼠背景與胚胎顯微注射后胚胎發(fā)育率、仔鼠出生率和轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的關(guān)系Figure 2 The relationships of two backgrounds with embryo development rate,birth rate,and transgene positive rate after embryo microinjection

2.3 BAC 注射液制備后存放時(shí)間與轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的關(guān)系

17 種BAC 注射液制備至顯微注射當(dāng)天最短為1 d，最長(zhǎng)為43 d，其中有部分實(shí)驗(yàn)為同種BAC 溶液分別放置了不同的時(shí)間來(lái)進(jìn)行顯微注射。儲(chǔ)存條件：PA緩沖液中，存于4 ℃。陽(yáng)性率最高（50%）的一次實(shí)驗(yàn)是BAC注射液制備距注射2 d，陽(yáng)性率最低（0%）的在2～43 d 均有分布。從圖3看，BAC注射液的存放時(shí)間與轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率并不呈線性關(guān)系。

圖3 BAC注射液的存放時(shí)間與轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率之間的關(guān)系Figure 3 The relationships between the storage time of BAC DNA injection and the positive rate of transgenic mice

2.4 BAC質(zhì)粒大小與轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的關(guān)系

所有注射的17 種BAC 注射液中包含的BAC DNA片段大小范圍為99～197 kb，共有7個(gè)不同的片段，分別為99 kb、114 kb、126 kb、137 kb、177 kb、180 kb 和197 kb。以這7 種不同大小的BAC片段進(jìn)行胚胎顯微注射，統(tǒng)計(jì)注射后胚胎存活率、注射后胚胎發(fā)育率（胚胎發(fā)育率）、注射胚胎移植后仔鼠出生率（仔鼠出生率）和BAC轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率，結(jié)果如表1和圖4所示。

圖4 BAC片段大小與胚胎存活率、胚胎發(fā)育率、仔鼠出生率和轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的關(guān)系Figure 4 Correlations of the size of BAC DNA with survival embryo rate，embryo development rate, birth rate, and the positive rate of transgenic mice

表1 注射7種片段大小的BAC DNA所對(duì)應(yīng)的胚胎存活率、胚胎發(fā)育率、仔鼠出生率和轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率Table 1 Survival embryo rate,embryo development rate,birth rate,and the positive rate of transgenic mice inejcted with seven different BAC DNA sizes（± s）

表1 注射7種片段大小的BAC DNA所對(duì)應(yīng)的胚胎存活率、胚胎發(fā)育率、仔鼠出生率和轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率Table 1 Survival embryo rate,embryo development rate,birth rate,and the positive rate of transgenic mice inejcted with seven different BAC DNA sizes（± s）

注：*P＜0.05，*P＜0.01，vs BAC 片段大小為114 kb 組；△P＜0.05，△△P＜0.01，vs BAC 片段大小為99 kb 組。注射后胚胎存活率=胚胎經(jīng)顯微注射0.5 h 后仍存活的數(shù)量/顯微注射的胚胎總數(shù)；胚胎發(fā)育率=顯微注射后發(fā)育至2 細(xì)胞的胚胎數(shù)/顯微注射后存活的胚胎總數(shù)；仔鼠出生率=出生仔鼠數(shù)量/移植胚胎數(shù)量；轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率=陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)量/出生小鼠數(shù)量。

BAC片段大小/kb 99 114 126 137 177 180 197數(shù)量9 17 491 1 17 9注射后胚胎存活率/%67.81±13.62 74.97±7.76 66.72±9.05 63.17±8.60**56.17±10.14**△57.06±6.41**△66.79±10.17*胚胎發(fā)育率/%68.06±14.08 92.30±5.48△△91.40±4.26△△90.78±2.65△△78.92±13.01*88.27±10.41△△92.62±1.01△△仔鼠出生率/%13.61±15.65 16.02±7.46 15.24±10.64 19.26±8.76 16.07±10.92 19.63±8.31 22.49±9.41轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率/%3.24±6.52 0.74±3.03 13.30±9.78**12.88±17.36 9.63±9.44*7.32±9.57 13.56±12.88*

通過(guò)SPSS16 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，BAC DNA 片段大小對(duì)注射后胚胎存活率和胚胎發(fā)育率的影響極顯著（P＝0），對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的影響顯著（P＝0.015），對(duì)仔鼠出生率影響不顯著（P＝0.488）。

多重比較顯示，當(dāng)BAC 片段為114 kb 時(shí)，注射后胚胎存活率最高，明顯高于137 kb、177 kb和180 kb片段（P＜0.01），也高于197 kb片段（P＜0.05）。BAC 片段為177 kb 時(shí)，注射后胚胎存活率最低，為（56.17±10.14）%，明顯低于99 kb和114 kb片段（P＜0.01）。

多重比較顯示，當(dāng)BAC 片段為197 kb 時(shí)，胚胎發(fā)育率最高，為（92.62±1.01）%，明顯高于99 kb片段（P＜0.01），也高于177 kb片段（P＜0.05）。BAC為99 kb時(shí)，胚胎發(fā)育率最低，略低于177 kb片段（P＞0.05），極顯著低于其他各組（P＜0.01）。

當(dāng)BAC片段為197 kb時(shí)，仔鼠出生率最高，為（22.49±9.41）%。BAC為99 kb時(shí)，仔鼠出生率最低，為（13.61±15.65）%，但組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

多重比較顯示，當(dāng)BAC 片段為197 kb 時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率最高，為（13.56±12.88）%，明顯高于114 kb（P＜0.01），也高于99 kb（P＜0.05）。

3 討論

影響B(tài)AC 轉(zhuǎn)基因小鼠研制效率的因素有很多，最關(guān)鍵的一些因素包括BAC DNA 的制備方法［14-15］、BAC DNA 的純化及儲(chǔ)存條件和儲(chǔ)存時(shí)間［16］、BAC注射液的濃度［17］、供體小鼠的背景等［18-20］。本文首先采用同一種BAC DNA，以同一種注射液濃度（1.5 ng/μL）分別注射C57BL/6J 和FVB/N 兩種不同背景小鼠的受精卵并移植，比較了仔鼠出生率和轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率，結(jié)果顯示FVB/N 均略高于C57BL/6J。但因?yàn)镃57BL/6J的數(shù)據(jù)相對(duì)較少，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故未單獨(dú)列出。隨后在選用固定的BAC DNA 制備方法的前提下，分別比較了BAC 注射液濃度、實(shí)驗(yàn)小鼠背景、BAC DNA 片段大小、BAC 注射液制備后存放時(shí)間與轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的關(guān)系。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在一定范圍內(nèi)，BAC注射液質(zhì)量濃度與轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率呈正相關(guān)。隨著濃度升高，陽(yáng)性仔鼠在出生仔鼠中的占比逐漸升高。但BAC 注射液質(zhì)量濃度與仔鼠出生率基本呈負(fù)相關(guān)，即注射液濃度越高，存活下來(lái)的仔鼠數(shù)量越少，特別是當(dāng)注射液質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 ng/μL時(shí)，C57BL/6J和FVB/N的仔鼠出生率均為最低，從而導(dǎo)致最終獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)量反而下降。這個(gè)結(jié)果也與文獻(xiàn)［14］的結(jié)果吻合。而且由于BAC 注射液對(duì)于小鼠早期胚胎本身就具有一定的毒性，且BAC片段普遍大于100 kb，相對(duì)于普通轉(zhuǎn)基因片段大得多，因此，獲得BAC 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠相對(duì)更困難。相對(duì)于小片段的質(zhì)粒，BAC轉(zhuǎn)基因小鼠研制中適于注射的濃度范圍非常小。實(shí)驗(yàn)中需要找到最佳的BAC 注射液濃度，讓仔鼠出生率與轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率之間達(dá)到平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)BAC 注射液質(zhì)量濃度為1.5 ng/μL 時(shí)，C57BL/6J 和FVB/N 的仔鼠出生率分別為（15.87±2.02）%和（21.44±1.31）%，轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率分別為（6.85±1.71）%和（12.86±1.57）%，說(shuō)明此濃度為最佳注射濃度。

通過(guò)比較C57BL/6J 和FVB/N 兩種背景的實(shí)驗(yàn)小鼠作為供卵小鼠的效果，結(jié)果顯示C57BL/6J的仔鼠出生率略低于FVB/N，沒(méi)有顯著差異，但C57BL/6J 的轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率顯著低于FVB/N，提示FVB/N 小鼠更有利于作為BAC 轉(zhuǎn)基因小鼠研制的供卵小鼠。推測(cè)其主要因素有兩個(gè)：一是FVB/N 小鼠受精卵中雄原核與雌原核的體積較C57BL/6J 的明顯更大［20］，在注射過(guò)程中，注射針尖更容易到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)的準(zhǔn)確位置；而C57BL/6J 小鼠的受精卵在注射過(guò)程中，由于原核體積相對(duì)較小，且核內(nèi)還有極具黏性的核仁，注射針尖需到達(dá)原核內(nèi)且避開(kāi)核仁，顯微注射操作具有較大的難度，例如實(shí)際操作中經(jīng)常因?yàn)樽⑸溽樇獾竭_(dá)C57BL/6J 小鼠受精卵的原核中后粘到核仁，并在出針時(shí)牽拉出核仁，導(dǎo)致胚胎死亡。二是C57BL/6J 小鼠受精卵相對(duì)FVB/N 的有更多的色素顆粒。在高倍鏡下觀察時(shí)，C57BL/6J小鼠的受精卵常常因?yàn)樯仡w粒遮擋而導(dǎo)致原核邊界看不清楚，從而影響顯微注射的準(zhǔn)確性，而FVB/N小鼠的受精卵在顯微鏡下非常透亮，原核大且邊界很清晰更有利于顯微注射。

本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了7 種不同的BAC DNA 片段大小與注射后胚胎存活率、注射后胚胎發(fā)育率、注射胚胎移植后仔鼠出生率和BAC 轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的數(shù)據(jù)，分析后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BAC片段達(dá)到197 kb時(shí)，胚胎發(fā)育率和轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率均為組間最高，提示轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率并不與BAC 片段大小呈反比，即隨著注射的BAC片段不斷增大，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠并不比片段較小時(shí)更難獲得。因此，只要采取合適的方式制備BAC 注射液并稀釋至最優(yōu)的注射濃度，同時(shí)選取FVB 背景小鼠，那么BAC 片段的大小并不是獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的限制因素。在上述實(shí)驗(yàn)中，BAC注射液制備后的存放時(shí)間為1～43 d，通過(guò)對(duì)比存放時(shí)間與轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，這兩者間并不呈線性關(guān)系。因此，只要保存條件得當(dāng)，BAC注射液自制備之日起后的近1個(gè)月時(shí)間內(nèi)均可用于注射，但建議越早注射越好。所有實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性率最高（50%）的一次實(shí)驗(yàn)是BAC注射液制備距注射2 d，而當(dāng)注射液存放超過(guò)30 d 后，陽(yáng)性率明顯下降。