糖尿病動(dòng)物皮膚損傷模型制備要素和受試物數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)分析

林 江, 駱 飛,劉 鵬,韓絲銀,陳振興,梁忠秀,蘭太進(jìn)

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,南寧530200)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止2017 年全世界約有4.51 億（18～99歲）糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2045年這一數(shù)字將增加至6.93 億［1］。在糖尿病的諸多并發(fā)癥中，傷口愈合能力受損是糖尿病的一個(gè)典型并發(fā)癥；如果慢性損傷和潰瘍發(fā)生在足部，則有可能引發(fā)糖尿病足，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致截肢［2］。動(dòng)物模型可為研究疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本文從PubMed和中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）等數(shù)據(jù)庫(kù)收集1997—2020 年（24 年）國(guó)內(nèi)外研究糖尿病動(dòng)物皮膚損傷模型的文獻(xiàn)276篇，應(yīng)用Excel錄入每篇文章的題目，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類、性別，糖尿病模型制作時(shí)是否給予高脂高糖飼料，制作糖尿病模型的試劑、造模時(shí)間、給藥劑量、給予方式，建立糖尿病模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)，制作創(chuàng)面的方法、創(chuàng)面位置、創(chuàng)面大小、受試物名稱等信息，制作《糖尿病動(dòng)物皮膚損傷模型的造模要素挖掘數(shù)據(jù)表》。然后對(duì)錄入的每項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，歸納總結(jié)造模要素和受試物情況，旨在為提高造模效率和科學(xué)評(píng)價(jià)受試物的有效性提供參考。

1 動(dòng)物選擇

1.1 種別

造模所用動(dòng)物種類根據(jù)其使用頻率由高到低依次為大鼠、小鼠、新西蘭兔和約克豬。大鼠220 篇，其中SD 大鼠142 篇，Wistar 大鼠74 篇；小鼠47 篇，其中C57BL/6 小鼠25 篇，昆明小鼠11篇，ICR小鼠3篇，BALB/c裸小鼠4篇，db/db小鼠3篇；新西蘭兔7篇；約克豬2篇。

1.2 性別

在實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)使用雄性動(dòng)物（233 篇）遠(yuǎn)高于單獨(dú)使用雌性動(dòng)物（11 篇），少數(shù)選用雌雄各半動(dòng)物（12篇），或雌雄不限（20篇）。

2 造模情況

2.1 糖尿病模型的建立

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，除自發(fā)性糖尿病db/db 小鼠模型外（3篇），絕大部分糖尿病動(dòng)物模型是由化學(xué)試劑或化學(xué)試劑聯(lián)合高脂高糖飼料建立，包括使用鏈脲佐菌素（210篇）、四氧嘧啶（30篇）、高脂或高脂高糖飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素（33 篇）。試劑給予方式大多為腹腔注射（232篇），少數(shù)采用尾靜脈注射（32 篇）；約克豬與新西蘭兔的注射方式為耳緣靜脈注射（9篇）。鏈脲佐菌素注射的次數(shù)有：一次性注射（217篇）；每天1次，連續(xù)注射2 d（8篇）；每天1次，連續(xù)注射3 d（5篇）；每天1次，連續(xù)注射5 d（9篇）；每天1次，連續(xù)注射6 d（3 篇）和每天1 次，連續(xù)注射7 d（2 篇）。四氧嘧啶注射的次數(shù)有：一次性注射（27 篇），每隔3 d注射1次且連續(xù)注射2次（1篇），以及每天注射1 次且連續(xù)注射3 d（1 篇）。此外，所使用動(dòng)物種類、造模試劑及其劑量、造模時(shí)間、評(píng)價(jià)指標(biāo)等情況詳見表1。

表1 化學(xué)試劑誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型的造模情況Table 1 Modeling of diabetes animal models induced by chemical reagents

2.2 皮膚創(chuàng)面的制作

皮膚創(chuàng)面的制作方法有全皮層切除（201篇）、特制打孔器打孔（39 篇）、燙傷（30 篇）、按壓（5 篇）、高位截肢（1 篇）。創(chuàng)面的位置常在背部（252 篇），少數(shù)位于足背部（24 篇）。創(chuàng)面的形狀有圓形和方形，但絕大部分為圓形。

大鼠創(chuàng)面面積范圍為0.21～7.07 cm2 （共有131篇明確了創(chuàng)面面積）。常用的面積有0.21 cm2（即0.30 cm×0.70 cm，9 篇）、0.50 cm2（即直徑為0.8 cm，3 篇）、0.78 cm2（即直徑為1.00 cm，8篇）、0.95 cm2（即直徑為1.10 cm，2篇）、1.13 cm2（即直徑為1.2 cm，2 篇）、1.77 cm2（即直徑為1.50 cm，15 篇）、2.54 cm2（即直徑為1.80 cm，30篇）、3.14 cm2（即直徑為2 cm，28篇）、4.00 cm2（即2.00 cm×2.00 cm，10 篇）、4.91 cm2（即直徑為2.50 cm，10篇）和7.07 cm2（即直徑為3.00 cm，14篇）。

小鼠創(chuàng)面面積范圍為0.20～1.00 cm2（共有31 篇明確了創(chuàng)面面積）。常用的創(chuàng)面面積有0.20 cm2（即直徑為0.50 cm，2 篇）、0.28 cm2（即直徑為0.60 cm，1 篇）、0.38 cm2（即直徑為0.70 cm，1篇）、0.50 cm2（即直徑為0.80 cm，9篇）、0.64 cm2（即0.80 cm×0.80 cm，8 篇）、0.79 cm2（即直徑為1.00 cm，5篇）、1.00 cm2（即1.00 cm×1.00 cm，5篇）。

新西蘭兔創(chuàng)面面積明確的共有6篇，分別為0.70、0.79、2.54、4.00、6.00和9.00 cm2。

約克豬創(chuàng)面面積為19.60 cm2，即直徑為5.00 cm（2篇）。

3 受試物

在上述動(dòng)物模型建立的基礎(chǔ)上，國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)開展了針對(duì)多種化學(xué)藥物、中藥及中藥提取物、中成藥及中藥復(fù)方、生物制劑以及物理療法等的治療效果評(píng)價(jià)，以及相應(yīng)作用機(jī)制的研究，為后續(xù)的糖尿病藥物開發(fā)及應(yīng)用積累了一定的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

3.1 化學(xué)藥物

基于上述動(dòng)物模型開展的藥效評(píng)價(jià)研究表明，多種化學(xué)藥物能促進(jìn)糖尿病皮膚損傷的修復(fù)，包括阿卡地新、α 硫辛酸、油酸、殼寡糖、硫化氫、L-精氨酸、氨基胍、硫酸鋅、硫酸乙酰肝素、硼酸、殼聚糖凝膠劑、NO 合劑（如硝普鈉、夾竹桃麻素、精氨酸）和載洛伐他汀纖維膜等。為了提高治療效果，部分化學(xué)藥物制備成適宜于皮膚給藥的凝膠劑或纖維膜等劑型，通過(guò)動(dòng)物模型確認(rèn)其療效，可為后續(xù)的臨床應(yīng)用提供參考。

3.2 中藥及中藥提取物

中藥對(duì)于慢性創(chuàng)面不愈具有一定的臨床療效。基于上述動(dòng)物模型，在確認(rèn)中藥及其提取物療效的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步開展作用機(jī)制研究，為臨床合理用藥奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為中藥活性成分篩選提供線索。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，具有促進(jìn)糖尿病皮膚損傷的中藥及中藥提取物包括蜂膠、蜂蜜、蘆薈凝膠、白芨多糖、大黃多糖、崗梅提取物、毛冬青浸膏、茴芹甲醇提取物、金雞毛草水提物、積雪草總苷、虎杖苷、雷公藤紅素、姜黃素、槲皮素、人參皂苷Rg3等。

3.3 中成藥及中藥復(fù)方

中藥復(fù)方是中藥發(fā)揮作用的主要形式，部分中藥復(fù)方及中成藥在臨床上已經(jīng)取得了較好的治療效果。通過(guò)建立糖尿病皮膚損傷模型，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，可為臨床聯(lián)合應(yīng)用提供可靠數(shù)據(jù)，最終提高臨床治療效果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，基于上述糖尿病皮膚損傷模型開展研究的中成藥及中藥復(fù)方包括：康膚霜、芪蛭降糖膠嚢、丹黃散、蚓黃散、愈瘍靈軟膏、益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方、益氣活血祛濕膏、益氣化瘀方、一效膏、蕁蓬膏、血竭生肌膏、血竭殼聚糖藥膜、消毒愈肌液、消毒愈肌膏、鮮蟾皮、托里消毒散精簡(jiǎn)方、糖足洗液、生肌象皮膏、傷瘍愈軟膏、龍血竭、加味桃核承氣湯、復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏、復(fù)方愈瘍散、膚痔清軟膏、天樓解毒消腫散、唐肌康、四效散、四妙勇安湯、生肌化瘀方、生肌巴布貼、祛瘀生肌方、益氣化瘀生肌方、瘍愈涂劑、祛瘀生肌方、活血化瘀方、化疽生新膏、蜂蠟膏、京萬(wàn)紅軟膏、金創(chuàng)抗菌膏、解毒洗藥、回陽(yáng)生肌散、回陽(yáng)生肌膏、莪術(shù)醇軟膏、創(chuàng)愈生肌散、濕潤(rùn)燒傷膏、通塞脈片和康樂欣等。

3.4 生物制劑

國(guó)內(nèi)外學(xué)者在上述動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，嘗試探討了多種生物制劑（如胰島素、多種來(lái)源的干細(xì)胞、各種促進(jìn)修復(fù)的細(xì)胞因子、胰島素聯(lián)合細(xì)胞因子等）對(duì)糖尿病皮膚損傷的修復(fù)作用，結(jié)果顯示很多生物制劑均可在一定程度上促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，開展研究的生物制劑包括胰島素、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、凝血酶、蛆蟲分泌物抗菌肽、富血小板纖維蛋白、熱休克蛋白90、外源性P 物質(zhì)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1凝膠、重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子卡波姆940凝膠、重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子凝膠、重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 凝膠、神經(jīng)生長(zhǎng)因子凝膠、重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165-胰島素復(fù)合凝膠、神經(jīng)生長(zhǎng)因子-胰島素復(fù)合凝膠和低氧誘導(dǎo)導(dǎo)電水凝膠等。

3.5 物理療法

近年來(lái)，物理療法也被報(bào)告具有促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的作用。在上述動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，國(guó)內(nèi)外學(xué)者探討了低能量體外震波、紅光、封閉負(fù)壓引流、封閉負(fù)壓引流聯(lián)合局部氧療、低劑量輻射、超短波、磁力介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向創(chuàng)面聚集等對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合的影響，結(jié)果顯示這些物理療法均具有一定的效果，為后續(xù)聯(lián)合藥物治療奠定了基礎(chǔ)。

3.6 陽(yáng)性對(duì)照藥

國(guó)內(nèi)外學(xué)者在進(jìn)行糖尿病創(chuàng)面愈合研究的過(guò)程中，采用了多種已經(jīng)上市銷售的中藥、西藥及生物制劑作為陽(yáng)性對(duì)照藥，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。這些陽(yáng)性對(duì)照藥包括如意金黃散、濕潤(rùn)燒傷膏、康復(fù)新液、外用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠、復(fù)方磺胺嘧啶鋅凝膠、外用重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠、重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠等。

4 總結(jié)與展望

創(chuàng)面愈合異常是糖尿病患者常見的并發(fā)癥。建立與臨床發(fā)病特征相似且穩(wěn)定、重復(fù)性好的動(dòng)物模型是研究糖尿病發(fā)病機(jī)制及治療的必要手段。通過(guò)檢索和分析文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，糖尿病動(dòng)物創(chuàng)面損傷模型的制備與物種、性別，建立糖尿病模型所用的試劑、劑量、注射方式、注射次數(shù)、造模時(shí)間，制作創(chuàng)面的方法、創(chuàng)面的位置和大小等因素相關(guān)。動(dòng)物種類以大鼠最常用，其中SD大鼠為主，Wistar 大鼠也較多使用；小鼠則以C57BL/6J 小鼠為主，其他動(dòng)物使用較少；可能原因是大鼠、小鼠繁殖周期短，飼養(yǎng)成本低，同時(shí)相關(guān)檢測(cè)試劑供應(yīng)豐富，有利于開展相關(guān)研究。

實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物性別以雄性居多，原因可能是雌性動(dòng)物體內(nèi)含雌激素，本身具有調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合的作用，這可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。已知雌激素可作用于創(chuàng)面愈合的3個(gè)時(shí)期，包括炎癥期、增殖期與重塑期。在炎癥期，雌激素主要通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞趨化性和嗜中性黏附分子的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)；在增殖期，雌激素對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞具有促有絲分裂的作用，可增加創(chuàng)面的再上皮化速率；在重塑期，雌激素可通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞對(duì)蛋白激酶的分泌，進(jìn)而影響膠原的降解，調(diào)節(jié)重塑期的進(jìn)程［3］。

采用化學(xué)藥物造成胰島細(xì)胞損傷可制備糖尿病模型，其中以鏈脲佐菌素最為常用，少數(shù)也使用四氧嘧啶。針對(duì)不同動(dòng)物，所用化學(xué)藥物的劑量存在明顯不同。鏈脲佐菌素導(dǎo)致糖尿病的機(jī)制尚未明確，其可能的原因是β細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-2 攝取鏈脲佐菌素，引起DNA 烷基化損傷，繼而誘導(dǎo)多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶過(guò)度激活，使β細(xì)胞因能量衰竭而死亡，最終誘發(fā)糖尿?。淮送?，鏈脲佐菌素還可能通過(guò)抑制O-連接氮乙酰葡糖胺糖苷酶，使得氮乙酰葡糖胺堆積，影響胰島素的釋放［4］。四氧嘧啶是一種細(xì)胞毒劑，選擇性損傷動(dòng)物的胰島β細(xì)胞，使胰島分泌功能喪失，血糖升高，形成多飲、多食、多尿的典型糖尿病表現(xiàn)。然而四氧嘧啶造模的安全劑量范圍較窄，劑量偏小時(shí)造模往往不能成功，劑量偏大時(shí)容易造成動(dòng)物死亡［5-6］。因此，目前實(shí)驗(yàn)多采用鏈脲佐菌素制作糖尿病動(dòng)物模型。另外，造模試劑大多采用腹腔注射的方式，少數(shù)采用尾靜脈注射，且大多為一次性注射，而造模試劑所用劑量與造模時(shí)間的跨度較大。

造成糖尿病動(dòng)物皮膚損傷的方式有多種，但從便于給藥的角度考慮，筆者認(rèn)為宜在動(dòng)物背部制作創(chuàng)面，以保證在給藥及飼養(yǎng)期間動(dòng)物不易對(duì)創(chuàng)面造成破壞，保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。關(guān)于皮膚損傷面積大小，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，大鼠以創(chuàng)面直徑為1.5～2.0 cm最常用，小鼠以創(chuàng)面直徑為0.8～1.0 cm最常用；而兔創(chuàng)面面積不具有規(guī)律性，可根據(jù)需要自行選擇；約克豬創(chuàng)面直徑一般為5.0 cm。

糖尿病創(chuàng)面愈合異常涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的共同作用，單個(gè)作用靶點(diǎn)很難達(dá)到較好的長(zhǎng)期臨床療效?，F(xiàn)有的資料表明，多種藥物或物理干預(yù)都具有促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的作用，如果在受試物作用機(jī)制清楚的情況下，可綜合使用多種受試物或采用序貫療法，應(yīng)該能取得較好的治療效果。此外，干細(xì)胞療法及配合物理療法是目前在促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面修復(fù)方面比較有潛力的治療方法。

通過(guò)本次文獻(xiàn)分析，筆者認(rèn)為后續(xù)開展糖尿病皮膚損傷模型的制備時(shí)，推薦以下適宜的造模方法：應(yīng)用雄性SD 大鼠，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素65 mg/kg，以隨機(jī)血糖值大于16.7 mmol/L為糖尿病模型建立的考察指標(biāo)，于背部制作創(chuàng)面直徑為1.8 cm（約1角硬幣大小）的皮膚損傷。