卵巢早衰動(dòng)物模型構(gòu)建方法及比較研究進(jìn)展

李虹璇, 李思慧, 馮嘉欣, 唐 凱, 盧 蕊, 韓絲銀

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,南寧530200; 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院,南寧530200)

卵巢早衰（prenature ovarian failure，POF）是指卵巢功能提前衰退，表現(xiàn)為40 歲之前的婦女出現(xiàn)非生理性的月經(jīng)停止，常伴有潮熱、盜汗、陰道干澀等絕經(jīng)期及不孕癥狀，以卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）升高及雌二醇（estradiol，E2）下降為主要特征［1］。近年來，POF婦女因受醫(yī)源、免疫、遺傳、代謝及環(huán)境等多種因素的影響，發(fā)病人群日漸低齡化，但由于臨床病理機(jī)制尚不明確，該病已成為生殖研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

人體POF 的臨床研究獲取卵巢組織較為困難，學(xué)者們一直在尋找理想可靠的方法構(gòu)建POF動(dòng)物模型，以深入研究和探討卵巢早衰的發(fā)生、發(fā)展并尋找治療方案。本文通過查閱分析國內(nèi)外有關(guān)POF動(dòng)物建模方法的最新研究文獻(xiàn)，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、造模方法、劑量、結(jié)果及成模時(shí)間等方面直觀比較分析各因素引發(fā)POF動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及優(yōu)缺點(diǎn)，以期為不同需要的研究者提供有用的建模信息。

1 不同因素引發(fā)POF動(dòng)物模型

1.1 醫(yī)源因素

1.1.1 化療和放療

癌癥是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。據(jù)報(bào)告，2014 年中國約有169 萬女性被診斷為癌癥，其中排名前五的癌癥種類中2.78%的患者年齡在30 歲以下，12.25%的患者年齡在30～44 歲之間［2］?；熀头暖熓桥R床治療惡性腫瘤與防止腫瘤復(fù)發(fā)的主要方法，但患者接受治療后會出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)損傷等不良反應(yīng)，化療與放療引起的卵巢早衰占POF患病人群的25%，成為引發(fā)女性生殖疾病的重要原因［3-5］。

順鉑是臨床上常用的化療藥物，有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對正常細(xì)胞造成損傷。順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的主要機(jī)制是損傷DNA，其次也有氧化應(yīng)激。順鉑對育齡期女性的生殖功能產(chǎn)生影響，主要是通過破壞卵巢功能導(dǎo)致POF。順鉑是構(gòu)建大鼠POF 模型常用的藥物［6］。董若曦等［7］表明Wistar 大鼠腹腔注射4 mg/kg 順鉑，間隔一周再次注射建立的化療損傷性POF大鼠模型效果最好。張麗娟等［8］表明SD大鼠腹腔注射6 mg/kg 順鉑，間隔一周再次注射建立化療損傷性POF大鼠模型的效果更為理想。

環(huán)磷酰胺也是常用的化療藥物之一，擁有高度卵巢毒性，可造成性腺組織永久性損傷。卵巢是環(huán)磷酰胺雌性生殖毒性作用的主要靶向器官［9-10］。張娟等［11］表明50 mg/kg 環(huán)磷酰胺連續(xù)腹腔注射家兔2 d 是誘導(dǎo)家兔POF 模型的最佳方式。劉慧瑩等［12］比較單藥和聯(lián)合用藥建立化療所致Wistar大鼠POF模型的效果，結(jié)果表明一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺120 mg/kg 聯(lián)合皮內(nèi)注射白消安12 mg/kg 造模法是一種較好的選擇。李慧等［13］用120 mg/kg 環(huán)磷酰胺與7.5 mg/kg 紫杉醇分別建立Wistar大鼠POF模型，結(jié)果表明環(huán)磷酰胺處理后大鼠的血清學(xué)表現(xiàn)與臨床卵巢早衰患者相一致，更適用于大鼠建模。

放療對卵巢組織的放射性損傷也是常見的不良反應(yīng)，主要引起卵巢內(nèi)各級卵泡凋亡，卵巢儲備嚴(yán)重減退。賀宇恒等［14］給予C57BL/6小鼠單次全身輻射4 Gy的X射線，7～14 d建立小鼠POF模型?；熀头暖熤翽OF的具體造模方法比較見表1。

表1 化療和放療致POF的具體造模方法比較Table 1 Specific modeling methods for premature ovarian failure(POF)induced by chemotherapy and radiotherapy

1.1.2 藥物

雷公藤具有抗炎、抗菌、免疫抑制、抗腫瘤等作用，其不同制劑已廣泛應(yīng)用于臨床；但是雷公藤具有生殖毒性，可導(dǎo)致POF［15］。郝娟等［16］給Wistar大鼠連續(xù)灌胃50 mg/kg雷公藤多甙14 d，建立了POF 大鼠模型。Fu 等［17］給SD 大鼠連續(xù)灌胃40 mg/kg雷公藤多苷70 d，建立了POF大鼠模型。陳淑萍等［18］給SD大鼠連續(xù)灌胃50 mg/kg雷公藤多苷14 d，也可以建立POF大鼠模型。郜然然［19］給SD 大鼠連續(xù)灌胃400 μg/kg 雷公藤甲素60 d 建立POF 大鼠模型。同時(shí)，高慧等［20］發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙建立的POF模型較環(huán)磷酰胺更為理想，SD大鼠卵巢受損的病理結(jié)果與人類一致。

氫化可的松是最早使用并且公認(rèn)的腎陽虛證造模藥物［21］。王凱等［22］給SD大鼠連續(xù)下肢肌注32 mg/kg氫化可的松12 d，可建立腎陽虛證POF大鼠模型。藥物致POF的具體造模方法比較見表2。

表2 藥物致POF的造模方法比較Table 2 Modeling methods for premature ovarian failure(POF)induced by drugs

1.2 免疫因素

據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，5%～30%的POF 患者自身免疫功能出現(xiàn)異常［23］。Tong等［24］將剛出生2～4 d的幼鼠麻醉后摘除兩片胸腺，手術(shù)后90%的14日齡幼鼠出現(xiàn)了自身免疫性POF。林建華等［25］以粗制的卵巢抗原免疫小鼠，每3 周加強(qiáng)免疫1次，交配2周后無小鼠受孕。Smith等［26］首次報(bào)告抗透明帶（zona pellucida，ZP）抗體與POF相關(guān)。Bagavant 等［27］發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體內(nèi)存在高濃度的ZP 抗體，會導(dǎo)致雌性鼠的生育能力下降。Horejsi 等［28］發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性閉經(jīng)患者中38.5%呈ZP抗體陽性，而在繼發(fā)性閉經(jīng)患者中有23.3%呈ZP 抗體陽性。田海清等［29］給BALB/c 小鼠雙后腳掌處皮下注射75 μg 純化抗透明帶3 多肽（pZP3），建立自身免疫性POF模型，免疫后6周即可達(dá)到良好的建模效果。

然而，王佩娟等［30］認(rèn)為，給出生3 d以內(nèi)的小鼠行胸腺切除術(shù)建立模型的手術(shù)難度大，小鼠的死亡率高，目前難以推廣應(yīng)用；而用pZP3 注射小鼠免疫建立POF模型，其表現(xiàn)與人類POF相似，且成模率比較高，有利于進(jìn)行臨床診斷學(xué)和治療學(xué)方面的研究。免疫因素致POF的具體造模方法比較見表3。

表3 免疫因素致POF的造模方法比較Table 3 Modeling methods for prematureovarian failure(POF)induced by immune factors

1.3 遺傳因素

Krishna等［31］從POF小鼠模型中發(fā)現(xiàn)一些突變 基 因，如INHa、FOXL2、MSH5、DMC1、ATM和BMP15。而基因敲除模型已成為研究基因結(jié)構(gòu)功能和建立人類疾病模型的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。目前，國內(nèi)外學(xué)者已通過敲除小鼠PTEN、GDF9、Cx37、Bcl2、FOXL2 基因建立了POF 模型［32-36］。本方法有助于人們了解某特定基因?qū)OF 的作用，但一種模型僅能研究1～2 個(gè)基因的作用。由于POF的發(fā)生并非僅幾種基因改變所致，因此該方法對于POF 病因?qū)W的研究有所局限，并且操作難度大、成本高［37］?；蚯贸翽OF的具體造模方法比較見表4。

表4 基因敲除致POF的造模方法比較Table 4 Modeling methods for prematureovarian failure(POF)induced by gene knockout

1.4 代謝因素

陳靜等［38］研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖血癥能夠引起成年女性原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)，并導(dǎo)致POF。李潔等［39］給昆明小鼠35%半乳糖食物70 d 可建立POF 模型。蘇先芝等［40］給小鼠頸背部皮下連續(xù)注射200 mg/kgD-半乳糖6 周，也可以建立POF模型。但是有研究發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖注射誘導(dǎo)模型的小鼠血清AMH 和雄激素水平均增高，這與卵巢衰老特征不符，因此提示代謝因素所致POF模型不能模擬卵巢衰老的真正病理生理?xiàng)l件［41］。代謝因素致POF的具體造模方法比較見表5。

表5 代謝因素致POF的造模方法比較Table 5 Modeling methods for prematureovarian failure(POF)caused by metabolic factors

1.5 環(huán)境因素

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，人們居住條件改善，室內(nèi)裝修和各種消費(fèi)品的使用使室內(nèi)化工原料超標(biāo)，導(dǎo)致POF 發(fā)病增多。楊秀萍等［42］給Wistar大鼠連續(xù)灌胃5 mL 的20%乙醇12 d 建立了POF模型。蘇先芝等［40］給SPF 級雌性ICR 小鼠連續(xù)腹腔注射160 mg/kg 去氧乙烯基環(huán)己烯15 d，可建立POF 模型。蘇曉華等［43］給昆明小鼠連續(xù)吸入10 mg/m3密度的氣態(tài)甲醛14 d 也可以建立POF模型。環(huán)境因素致POF的具體造模方法比較見表6。

表6 環(huán)境因素致POF的造模方法比較Table 6 Modeling methods for prematureovarian failure(POF)caused by environmental factors

1.6 其他因素

應(yīng)激會引起全身性的內(nèi)分泌反應(yīng)，細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)一步影響功能代謝。連曉媛等［44］給Wistar 大鼠連續(xù)15 d制動(dòng)應(yīng)激，結(jié)果顯示可誘導(dǎo)卵巢功能紊亂和退化，效果較明顯。有學(xué)者采用從日本引進(jìn)的DahIS高血壓大鼠，研究發(fā)現(xiàn)卵巢是受高血壓影響的靶器官，隨高血壓病情加重，POF現(xiàn)象更明顯，故認(rèn)為DahIS高血壓大鼠可作為POF動(dòng)物模型［45］。

2 不同因素引發(fā)POF動(dòng)物模型的比較

2.1 各因素建模特點(diǎn)比較

各因素引發(fā)POF 的造模方法側(cè)重于不同的病因?qū)W，最適用于各自病因POF 的發(fā)病機(jī)制和治療研究，有著各自的獨(dú)特性和局限性。進(jìn)一步比較分析各因素引發(fā)POF 的致病機(jī)制、適用造模方向及造模優(yōu)缺點(diǎn)，見表7。在實(shí)際研究中，應(yīng)根據(jù)研究目的和要求來選擇相似因素和病因所建的POF 動(dòng)物模型，同時(shí)綜合考慮造模成功率、所需時(shí)間和成本等，以便順利地進(jìn)行POF 發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和臨床治療的研究。

表7 各因素致POF的造模比較Table 7 Comparative analysis of premature ovarian failure(POF)models induced by various factors

2.2 各因素建模效果比較

盡管不同因素引發(fā)POF的機(jī)制不盡相同，但最終都應(yīng)包括相關(guān)激素變化和卵巢損傷。周宇等［46］比較3 mg/kg順鉑用藥和卵巢切除法分別誘導(dǎo)的ICR 小鼠POF 模型，結(jié)果表明小鼠卵巢切除模型能夠更好地模擬POF 的癥狀，且對學(xué)習(xí)記憶的影響較小，更適用于研究藥物對POF 模型小鼠腦功能的影響。周慧等［47］分別給予SD 大鼠120 mg/kg 環(huán)磷酰胺、35%半乳糖食物和12 mg/kg白消安，結(jié)果表明環(huán)磷酰胺和半乳糖能夠建立POF模型，但是白消安未能成功建模。Zhang等［48］分別給予ICR小鼠、KM19小鼠和SD大鼠120 mg/kg環(huán)磷酰胺、12 mg/kg白消安、3 或4 mg/kg 順鉑、160 mg/kg 去氧乙烯基環(huán)己烯、35%半乳糖顆粒和50 mg/kg 雷公藤多苷，結(jié)果表明環(huán)磷酰胺、順鉑、去氧乙烯基環(huán)己烯、半乳糖都能夠建立POF模型，但是白消安和雷公藤多苷沒有明顯的建模效果。

3 總結(jié)

近十年，學(xué)者們已有相關(guān)綜述介紹了醫(yī)源、免疫、遺傳、環(huán)境等因素構(gòu)建的POF 動(dòng)物模型［37，49-50］。本文進(jìn)一步整理了文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，全面分析比較了各種因素引發(fā)的多種POF動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，期望為不同需要的研究者提供直觀有用的POF建模信息。整體上，腫瘤和自身免疫性疾病在臨床上發(fā)病率高，社會關(guān)注度高，國內(nèi)外研究化療藥物和自身免疫性疾病導(dǎo)致的POF模型最多，特別是環(huán)磷酰胺、順鉑、pZP3具有代表性，可作為POF 發(fā)病機(jī)制和治療研究的常用動(dòng)物模型。此外，近年來環(huán)境化學(xué)物質(zhì)不斷使POF發(fā)病率上升，目前去氧乙烯基環(huán)己烯造模最穩(wěn)定；但是有關(guān)化學(xué)物質(zhì)引發(fā)POF模型的研究尚少，需要更多關(guān)注。