四氯化碳誘導急性肝損傷大鼠模型對心臟的影響

張麗麗, 萬 鑫, 冀菁荃, 李 婷, 范毅敏, 李寶紅, 田帥燕

(1. 山西省長治醫(yī)學院病理生理學教研室, 長治046000; 2. 山西省長治醫(yī)學院第一臨床學院,長治046000; 3. 山西省長治醫(yī)學院生理學教研室, 長治046000; 4. 山西省長治醫(yī)學院機能實驗室,長治046000;5. 山西省長治醫(yī)學院基礎醫(yī)學部,長治046000)

2008年，山西省晉中市發(fā)生兩起甲苯急性中毒事件，均導致人員死亡。已知甲苯在體內的代謝器官主要為肝臟，其次是腦、腎等。而這兩例中毒患者除了有明顯的中樞神經(jīng)中毒癥狀外，還有心臟及其他代謝器官的損傷，這提示心臟及代謝器官也可能是急性毒作用的主要靶器官［1］。

工業(yè)毒物四氯化碳（CCl4）是目前最常用的誘導急性肝損傷的化學物質。CCl4致肝損傷的主要機制是在肝內活化后產(chǎn)生強毒性的二氯甲基自由基（·CCl2）和過氧化甲基自由基（·OOCCl2），引發(fā)脂質過氧化，導致肝細胞膜通透性增加，肝細胞大量破壞［2-4］。肝臟是人體最大的代謝器官，當其結構和功能受到損害時必然會引起體內其他重要臟器的結構和功能異常。有文獻報道，CCl4腹腔注射會同時損傷動物的心、脾、肺、腎、腦等器官［5］。根據(jù)血液動力學特點，來自肝靜脈的血液經(jīng)下腔靜脈直接回流至右心房，而心臟是機體內對缺血缺氧等損傷性反應極為敏感的臟器［6-8］。

本研究通過單次腹腔注射CCl4致大鼠急性肝損傷模型的建立，觀察急性肝損傷時大鼠心臟功能、結構形態(tài)方面的變化；進一步對急性肝損傷后不同時間點、不同濃度CCl4致心臟損傷情況進行比較，從而為急性肝損傷時心肌保護的基礎研究及臨床防治等后續(xù)相關研究工作提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備

清潔級雄性SD 大鼠48 只，6 周齡，體質量200～210 g，購買并飼養(yǎng)于斯貝福（北京）生物技術有限公司［SCXK（京）2019-0010；SYXK（京）2019-0030］。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度20～26 ℃，相對濕度40%～60%，光照周期明暗各12 h，自由飲食，適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。實驗方案經(jīng)本院實驗動物福利倫理委員會審核通過（No.DW2018090），符合動物實驗3R原則。

大鼠隨機分為正常對照組，CCl4低濃度模型組（20% CCl4）、中濃度模型組（40% CCl4）和高濃度模型組（60%CCl4），每組12 只。模型組大鼠一次性腹腔注射新鮮配制的不同濃度CCl4植物油溶液0.3 mL/100 g，正常對照組腹腔注射等體積的植物油。每組大鼠以相同數(shù)量，分兩批于注射藥物后24 h、48 h，用3%戊巴比妥鈉按0.1 mL/100 g（體質量）進行腹腔注射麻醉［9］。大鼠取仰臥位固定，連接BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)（購自成都泰盟科技有限公司）的心電圖電極，記錄標準Ⅱ導聯(lián)心電圖。隨后采集血液及肝臟、心臟標本檢測相關指標。

1.2 主要試劑

分析純CCl4（批號20160905）購自天津市富宇精細化工有限公司；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）（貨號C009-1）、考馬斯亮藍蛋白（貨號A045-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（貨號A003-1）、總超氧化物歧化酶（total-superoxide dismutase，T-SOD）（貨號A001-1）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）（貨號A032） 和心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponin I，cTnⅠ）（貨號H149-4）檢測試劑盒均購自南京建成科技有限公司，植物油為超市購買的橄欖油。

1.3 ELISA法檢測大鼠血清酶學指標

經(jīng)腹主動脈取血，置于冰塊上靜置1 h，以3 000 r/min 轉速于4 ℃條件下離心15 min，取上層血清保存于－20 ℃。按試劑盒說明書檢測肝損傷敏感指標ALT水平，用ELISA法檢測心肌損傷敏感指標cTnⅠ水平。

1.4 分光光度計檢測心肌組織勻漿指標

采用超聲波細胞粉碎機制備10%心肌組織勻漿，按試劑盒說明書方法檢測心肌組織勻漿中MDA、SOD和CK水平，蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

1.5 HE 染色觀察肝組織和心肌組織的病理學變化

在大鼠肝左葉相同部位，取大小約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 的肝組織；在心尖區(qū)，取大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的心肌組織。所有組織均置于體積分數(shù)為10%的甲醛溶液中固定后，常規(guī)脫水浸蠟、石蠟包埋、切片。然后進行蘇木精-伊紅（HE）染色、中性樹膠封固定。光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝、心臟組織的病理學變化。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠一般情況

正常對照組大鼠活潑好動，無異常變化。CCl4低/中濃度模型組大鼠存活率為100%，CCl4高濃度模型組存活率為83%。高濃度模型組大鼠一般情況稍差，精神不振，反應遲鈍，食量減少。手術操作中觀察到正常對照組大鼠肝臟顏色呈鮮紅色，表面光滑，邊緣銳利；高濃度模型組部分大鼠腹腔有積液，肝臟腫大且表面覆有白色膿狀物（圖1）。

圖1 對照組和CCl4高濃度模型組大鼠肝臟圖片F(xiàn)igure 1 Pictures of rat liver in the control and the high concentration CCl4 model groups

2.2 肝臟組織病理學改變

正常對照組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞索排列整齊，肝竇結構清晰，未見水腫和壞死肝細胞；CCl4處理后的模型組大鼠肝細胞排列紊亂，肝小葉結構逐漸破壞或消失，細胞質染色不均，肝細胞胞質內出現(xiàn)腫脹空泡和脂滴，而且肝細胞炎性反應及水腫、壞死程度隨CCl4注射濃度的增加而逐漸加重。CCl4注射相同濃度不同時間點的大鼠肝臟HE 染色結果無明顯差異（圖2）。

圖2 各組大鼠肝組織病理學變化（HE，×100）Figure 2 Pathological changes in the liver tissue in each group of rats（HE，×100）

2.3 血清ALT和cTnⅠ含量變化

與正常對照組相比，CCl4處理后的各濃度模型組大鼠血清ALT 和cTnⅠ含量均顯著升高（P＜0.01）。但低濃度模型組、中濃度模型組48 h 血清ALT 含量較24 h 降低，高濃度模型組48 h 血清ALT 含量較24 h 升高；低濃度模型組、高濃度模型組內兩個時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3A）。而高濃度模型組較低濃度模型組24 h 血清cTnⅠ表達水平高（P＜0.05），中濃度模型組、高濃度模型組48 h 血清cTnⅠ表達水平均較24 h 高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 各組大鼠不同時間點血清ALT含量和cTnⅠ水平Figure 3 Serum alanine aminotransferase（ALT）and cTnⅠlevels at different time points in each group of rats

2.4 大鼠心電圖變化

與正常對照組相比，CCl4處理后的各濃度模型組大鼠心電圖出現(xiàn)了不同程度的ST段弓背向上抬高、T 波高尖、Q-T 間期延長等電生理變化（圖4）。

圖4 各組大鼠不同時間點心電圖檢測Figure 4 Electrocardiogram at different time points in each group of rats

2.5 心肌組織病理學改變

正常對照組大鼠的心肌細胞形態(tài)基本正常，均勻整齊排列；低濃度模型組心肌細胞明顯肥大，有不同程度水腫，心肌細胞排列不整齊；中濃度模型組心肌細胞炎性反應明顯，肌原纖維走向不規(guī)則；高濃度模型組心肌細胞脂肪變性更加嚴重，細胞呈空泡狀，無明顯心肌結構。心肌細胞炎性反應及水腫、壞死程度隨CCl4注射濃度的增加而逐漸加重。CCl4相同濃度組48 h心肌病理改變較24 h更為明顯（圖5）。

圖5 各組大鼠心肌組織病理學變化（HE，×100）Figure 5 Pathological changes in the myocardial tissue in each group of rats（HE，×100）

2.6 心肌組織勻漿MDA、SOD及CK水平變化

與正常對照組相比，CCl4處理后的各濃度模型組大鼠心肌組織勻漿中MDA、CK 含量顯著升高（P＜0.05）。中濃度模型組、高濃度模型組較低濃度模型組大鼠MDA 含量升高（P＜0.05），且48 h 時較同濃度模型組24 h 時含量升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。各濃度模型組48 h CK 含量均較24 h 升高（P＜0.05），48 h 中濃度模型組、高濃度模型組大鼠CK含量較相同時間點低濃度模型組升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。各濃度模型組SOD 活性均較正常對照組明顯降低（P＜0.05），高濃度模型組較低濃度模型組SOD 含量降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠心肌組織勻漿MDA、SOD及CK檢測結果Table 1 Content of malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and creatine kinase(CK)in each group of rats（-x±s,n=6）

3 討論

CCl4誘導建立急性肝損傷動物模型是經(jīng)典的研究方法，該模型最早、最廣泛地應用于實驗性肝纖維化研究。國內外構建大鼠急性肝損傷模型的文獻絕大部分都選擇CCl4作為誘導劑。采用CCl4構建肝損傷模型的原因可能有以下幾點。（1）CCl4毒性大、造膜周期短。研究發(fā)現(xiàn)CCl4進入體內15 min 即可引起肝細胞損傷，至48 h達到高峰。（2）CCl4構建肝損傷模型能準確反映肝細胞功能、代謝及形態(tài)學變化，實驗指標穩(wěn)定且重復性好。（3）皮下注射CCl4造模周期長，動物死亡率高，操作不當會發(fā)生皮下滲漏；灌胃法造模時間長，且個體差異較大，死亡率高；蒸氣吸入法較復雜且容易引起肝外病變。經(jīng)過比較，多數(shù)研究者認為利用CCl4腹腔注射制備肝損傷動物模型具有皮下注射、灌胃、蒸氣吸入造模所不可比擬的優(yōu)點，如快速高效、操作簡便、病理結果可靠、不易外漏等［10］。

本研究用不同濃度CCl4油溶液腹腔注射的方法制備急性肝損傷大鼠模型。CCl4代謝產(chǎn)物引起的脂質過氧化反應是致肝損傷的主要機制［11-12］。ALT主要存在于肝細胞質中，當肝細胞受到自由基攻擊時，細胞膜通透性增高，細胞內ALT釋放量增加，因此血清ALT是反映肝細胞損傷程度的重要指標之一［13-14］。本研究檢測大鼠血清ALT含量及HE 染色病理學觀察結果均證實，CCl4致急性肝損傷模型制作成功。低/中濃度CCl4模型組均可造成短時的肝毒性刺激，ALT表達在24 h均高于48 h，此變化在一定程度上反映了肝臟的損傷程度和損傷后的修復過程；而高濃度CCl4模型組大鼠隨時間延長出現(xiàn)了嚴重且不可逆的肝損傷病理變化。綜上可知，不同濃度CCl4誘導的肝損傷嚴重程度不同。

心肌細胞極易受毒性物質作用，出現(xiàn)功能和形態(tài)結構的改變。cTnⅠ是一種心肌細胞內酶，心肌損傷后cTnⅠ可快速彌散至血漿，對判斷心肌損傷的敏感性和特異性較高［15-16］。CK 主要存在于心肌細胞質和線粒體中，心肌損傷后細胞質內CK表達增加［17］。本實驗中模型組大鼠的血清cTnⅠ和心肌勻漿CK 含量均明顯增加；且模型組大鼠心肌組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)了變性、壞死、炎性浸潤等不同程度的病理改變，是心肌缺血損傷的直接證據(jù)。心電圖檢測CCl4處理后模型組大鼠出現(xiàn)T波高尖、ST段抬高、Q-T間期延長等電生理變化，也反映了心肌缺血或壞死的程度。

已有研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基生成及脂質過氧化反應是心肌缺血損傷的重要機制［18］。本研究中，CCl4致肝損傷后可能通過某種機制導致心肌組織發(fā)生過氧化損傷，氧自由基與不飽和脂肪酸反應形成過氧化脂質，分解生成MDA。MDA與蛋白質的游離氨基及核酸結合，使生物大分子發(fā)生交聯(lián)，嚴重損傷心肌細胞膜結構，使心肌細胞腫脹、壞死［19-20］。SOD、MDA 水平變化能夠直觀反映出氧化應激的變化過程，是測定氧化應激的標志物［21］。本研究中，CCl4處理組大鼠在過氧化損傷作用下，心肌組織MDA 生成增加，清除氧自由基的SOD活性降低。

以上實驗中血清cTnⅠ和心肌勻漿CK、MDA及SOD檢測結果均證實，高濃度CCl4模型組大鼠心肌損傷程度較低濃度模型組嚴重，相同濃度CCl4模型組48 h損傷較24 h明顯。這說明不同濃度CCl4處理誘導的心臟損傷呈濃度和時間依賴性。

綜上所述，通過CCl4急性肝損傷模型的成功建立，觀察到急性肝損傷時大鼠心臟功能、結構形態(tài)方面的變化，并進一步對急性肝損傷后不同時間點心臟損傷情況進行了比較研究，證實CCl4引起的心肌損傷嚴重程度取決于毒物的攝入量和持續(xù)時間。本研究為臨床診斷和治療毒物所致急性肝損傷心臟病變提供了有力依據(jù)，為如何防治和減輕由肝損傷誘發(fā)的心肌過氧化損傷提供了新的思路。