小鼠腹主動脈瘤模型的建立及組織學(xué)特征分析

夏聰聰, 劉浩樂, 魏盼盼, 成大欣, 胥寶會, 劉恩岐, 趙四海

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心, 西安710061; 2. 斯坦福大學(xué)血管外科系, 美國加利福尼亞94305)

腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是指腹主動脈局部擴(kuò)大至動脈橫徑超過正常值的50%時形成的主動脈致死性疾?。?-2］。晚期動脈瘤破裂是多數(shù)AAA患者死亡的主要原因。盡管針對AAA 的研究逐漸增多，但其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚［3］。迄今為止，尚無治療AAA 的有效藥物。AAA 特征性表現(xiàn)為主動脈直徑變大、平滑肌細(xì)胞減少、彈力纖維層斷裂或消失、細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎性反應(yīng)增加等［3-5］。當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)水解，血流負(fù)荷力超過局部細(xì)胞外基質(zhì)承受能力時，發(fā)生血管破裂。由于目前大多數(shù)AAA 患者采用血管內(nèi)介入方法進(jìn)行治療，因此很難收集到臨床AAA標(biāo)本。

嚙齒類動物是研究AAA 發(fā)病機(jī)制的理想模型［5-7］。建立AAA模型的常用方法有：豬胰彈性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）灌注法、血管緊張素（angiotensinⅡ，AngⅡ）法和氯化鈣法［7-10］。PPE 灌注法誘導(dǎo)的模型中，小鼠主動脈的一個節(jié)段經(jīng)PPE 灌注5 min 左右，數(shù)天到數(shù)周的PPE 刺激能引起動脈的彈性纖維斷裂、炎性細(xì)胞浸潤和平滑肌細(xì)胞凋亡，該模型很好地模擬了炎性反應(yīng)在動脈瘤發(fā)生發(fā)展中的作用［9］。AngⅡ模型的主要特征是動脈夾層出現(xiàn)，造成血管外徑增大、中膜破壞，引發(fā)炎性反應(yīng)，以及彈力纖維局部斷裂；在研究夾層動脈瘤時，AngⅡ模型較有優(yōu)勢；然而，外源性AngⅡ用量較大，該AAA 模型掩蓋了內(nèi)源性AngⅡ在AAA 發(fā)病機(jī)制中的作用，其組織學(xué)特征不如PPE 模型典型。氯化鈣誘導(dǎo)的模型由外膜損傷引起，鈣離子轉(zhuǎn)化為CaPO4沉淀，引起彈力纖維層破壞，進(jìn)而造成外膜損傷；該法不需要復(fù)雜的外科手術(shù)，可在腎下腹主動脈誘導(dǎo)AAA 的發(fā)生。氯化鈣模型是一種鈣離子局部超載引起的病變，可能與人的疾病起始不完全相同?？傊谘芯垦装Y與動脈瘤的關(guān)系上，PPE模型相對穩(wěn)定，且能直接定位到血管具體位置。

本研究采用PPE 灌注法成功構(gòu)建小鼠AAA模型，手術(shù)操作相對復(fù)雜，術(shù)中需穿刺動脈，阻斷腹主動脈下端的血循環(huán)，而且PPE易造成血流重建后的下肢血栓和癱瘓。另外在成模的14 d觀察期中，可能需要超聲等影像學(xué)檢測，限制了無影像學(xué)設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用該模型。針對以上問題，進(jìn)一步調(diào)整手術(shù)步驟，降低術(shù)后小鼠癱瘓和死亡率，同時建立了一套血管直徑測量和組織學(xué)評價方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AAA 模型構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究炎癥在AAA 發(fā)病機(jī)制中的作用提供了模型基礎(chǔ)和方法學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

30 只雄性C57BL/6J 小鼠（引種品系C57BL/6JNifdc），8～10周齡，體質(zhì)量25～27 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［SCXK（陜）2018-001］提供，并在本中心飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)［SYXK（陜）2020-005］。30 只小鼠分為兩組，20 只小鼠為模型組，腹主動脈階段性輸注PPE溶液；10只小鼠為溶劑對照組，輸注PBS。用于組織學(xué)比較的正常血管為本實(shí)驗(yàn)室留存樣本。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目經(jīng)西安交通大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施（批準(zhǔn)號：2021-1077），所有實(shí)驗(yàn)過程遵循國家實(shí)驗(yàn)動物管理的相關(guān)法律和規(guī)定。

PPE（貨號E1250-25 mg）購自美國Sigma公司，用PBS配制成1.5 U/mL溶液備用；過氧化物酶、驢抗羊二抗購自美國Jackson Immuno-Research公司；過氧化物酶底物試劑盒購自美國Vector公司；羊抗小鼠平滑肌細(xì)胞α-actin抗體購自美國Novus 公司；大鼠抗小鼠CD68 抗體及羊抗大鼠二抗購自美國BioLegend公司。

1.2 AAA模型的建立

對文獻(xiàn)［8］建立的手術(shù)方法進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，具體步驟如下：小鼠稱體質(zhì)量后，放入吸入式麻醉機(jī)的誘導(dǎo)麻醉盒，5 %異氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉；待小鼠麻醉后，將小鼠仰臥位固定，用吸入面罩吸入2%異氟烷持續(xù)麻醉；脫毛膏去除腹部被毛，75%乙醇溶液消毒手術(shù)區(qū)，沿腹中線切開長2～3 cm 切口，充分暴露腎下腹主動脈至髂動脈段，鈍性器械分離動脈周圍組織；分離側(cè)支血管后結(jié)扎以防止灌注時漏液，游離出1 cm 左右長的腹主動脈段。腹主動脈上下游分別埋8-0 絲線并結(jié)扎，在分離出的主動脈下游段用8-0 縫合針頭扎破血管，迅速用棉簽擠出血液，手持鑷子將PE-10 插管沿血管開口處插入血管。結(jié)扎固定插管后，用灌注泵迅速推進(jìn)約30 μL PPE，灌注5 min 后，取下插管，棉簽按壓去除血管內(nèi)PPE 殘留，10-0絲線縫合血管開口，開放血流，棉簽按壓止血并關(guān)腹。溶劑對照組手術(shù)方法同上，但在腹主動脈管腔內(nèi)灌注的是PBS。

術(shù)后將小鼠籠盒置于復(fù)溫毯保暖數(shù)小時，待小鼠活動正常后，將籠盒放回飼養(yǎng)室，整個手術(shù)過程在體視顯微鏡下完成。本研究方法對以往手術(shù)步驟主要進(jìn)行了3點(diǎn)優(yōu)化：一是利用縫合針刺破血管后，再將插管插入腹主動脈，避免了PE管尖端較軟、不易刺破血管或?qū)ρ軗p傷較大的問題；二是為了避免術(shù)后血流重建后PPE溶液進(jìn)入短暫缺血的下肢循環(huán)，引起小鼠血栓和下肢癱瘓，在灌注PPE結(jié)束后，對PPE進(jìn)行了清理；三是增加了術(shù)后小鼠保溫護(hù)理，幫助小鼠在代謝較低的情況下快速恢復(fù)。

1.3 動脈直徑測量及取材

術(shù)前及術(shù)后14 d，體視顯微鏡拍照記錄小鼠腹主動脈直徑變化，直徑數(shù)據(jù)通過軟件測量獲得（一般用10～20 倍視野圖片）。鏡下分離腹主動脈，直徑增大50%以上判定為AAA 形成。PPE或PBS灌注14 d后處死小鼠，取手術(shù)段動脈，包埋于OCT（optim alcutting temperature，一種冷凍切片常用包埋劑）中，行冷凍組織切片分析。

1.4 病變動脈段組織學(xué)觀察

組織學(xué)染色采用標(biāo)準(zhǔn)的生物素-鏈霉親和素過氧化物酶法［10］，血管平滑肌細(xì)胞及Elastin 染色顯示血管壁平滑肌細(xì)胞及彈力纖維層降解情況。平滑肌細(xì)胞的消耗和彈力纖維層降解從輕度到重度分為4 個級別（Ⅰ～Ⅳ）進(jìn)行評價AAA。Ⅰ級：彈力纖維層破壞和血管平滑肌細(xì)胞減少等損傷僅局限于1層彈力纖維層；Ⅱ級：損傷涉及兩層或全部，但僅限于1/4 血管；Ⅲ級：損傷涉及所有彈力纖維層，但僅限于1/2 血管以下；Ⅳ級：損傷涉及所有彈力纖維層并延伸至3/4 血管以上。巨噬細(xì)胞染色陽性細(xì)胞數(shù)量反映血管壁炎性反應(yīng)程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。術(shù)前和術(shù)后兩組14 d 腹主動脈直徑數(shù)據(jù)比較進(jìn)行方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)過程及動脈直徑擴(kuò)張

C57BL/6J 小鼠開腹后，首先分離腹主動脈及其分支血管，結(jié)扎分支血管游離出腹主動脈，上下游埋線，結(jié)扎固定灌注PE-10 套管，灌注PPE或PBS，5 min。手術(shù)過程見圖1。

圖1 腹主動脈瘤的誘導(dǎo)及術(shù)后直徑變化Figure 1 Induction of abdominal aortic aneurysm and postoperative diameter changes in mice

術(shù)前和灌注后14 d 測量小鼠腹主動脈直徑，發(fā)現(xiàn)PPE灌注14 d后，小鼠腹主動脈血管直徑從平均（0.53±0.03）mm 擴(kuò)張至（1.20±0.12）mm，達(dá)到基礎(chǔ)血管直徑的2.26倍，即血管直徑擴(kuò)張超過50%以上，形成了AAA（圖1）。由于灌注的機(jī)械張力，PBS溶劑對照組血管直徑也顯示出一定程度的擴(kuò)張，平均直徑達(dá)到（0.78±0.06）mm。

2.2 病變動脈段組織學(xué)表現(xiàn)及特征性分析

組織學(xué)染色結(jié)果（圖2）顯示，相比于正常動脈血管和PBS灌注后的腹主動脈，PPE灌注小鼠腹主動脈均表現(xiàn)出不同程度的病變，包括血管平滑肌細(xì)胞減少、彈力纖維層破壞、外膜巨噬細(xì)胞大量累積，炎性反應(yīng)增加等。病變動脈段組織學(xué)結(jié)果提示，經(jīng)PPE灌注腹主動脈后，C57BL/6J小鼠腹主動脈出現(xiàn)典型的AAA 表型。不同階段的AAA病變特征如圖2所示。

圖2 術(shù)后14 d灌注小鼠腹主動脈病變段組織學(xué)表現(xiàn)Figure 2 Histological characteristics of the abdominal aorta in infused mice on day 14 after operation

本實(shí)驗(yàn)中，20只小鼠腹主動脈PPE灌注均達(dá)到擴(kuò)張50%以上的標(biāo)準(zhǔn)，都誘導(dǎo)成AAA。20只小鼠模型中，Ⅰ級病變1例（1/20）、Ⅱ級病變2例（2/20）、Ⅲ級病變6例（6/20），Ⅳ級病變11例（11/20）。Ⅳ級AAA病變小鼠可見彈力纖維退行性變和斷裂已經(jīng)非常嚴(yán)重，很難見到正常彈力纖維形態(tài)，平滑肌細(xì)胞消失殆盡。而且隨著病變進(jìn)展，巨噬細(xì)胞浸潤增多。由于本模型所用的PPE容易引起急性炎性反應(yīng)，因此即使在早期或動脈瘤較小時，也可見明顯的巨噬細(xì)胞浸潤。雖然PBS灌注組小鼠也因灌注過程的機(jī)械張力，血管呈現(xiàn)一定程度的擴(kuò)張，但其幅度較小，并未引起比較嚴(yán)重的炎性反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞損傷。

3 討論

PPE灌注法誘導(dǎo)AAA，需要穿刺血管、阻斷血流，整個手術(shù)操作過程相對復(fù)雜，用時長。有研究者提出了一種基于血管外膜彈性蛋白酶浸泡PPE法可以誘導(dǎo)建立AAA，盡管此模型在技術(shù)簡便性方面顯示出優(yōu)勢，但造模后期存在自我修復(fù)現(xiàn)象，說明該造模方法并不穩(wěn)定，而且動脈直徑擴(kuò)張較小，需要很高濃度的PPE才能促進(jìn)血管擴(kuò)張［11］。本研究采用的PPE 灌注法手術(shù)過程雖然比較復(fù)雜，但造模成功率高，穩(wěn)定性好，且具有良好的定向性，能夠定位到具體血管部位。PPE模型的優(yōu)點(diǎn)是可以精確定位（例如可以將病變定位到腎下腹主動脈段）、模擬人類AAA的主要病理學(xué)特征，且病變比較典型。PPE灌注誘導(dǎo)AAA在不同實(shí)驗(yàn)室使用的PPE濃度稍有區(qū)別，手術(shù)成功率也稍有差異。影響PPE模型廣泛推廣和應(yīng)用的瓶頸在于手術(shù)過程較難，術(shù)者需要較高的外科學(xué)基礎(chǔ)和較長時間的訓(xùn)練。通常手術(shù)過程中PPE灌注需要中斷下肢血循環(huán)，在再次開放血流時，灌注段的PPE會隨血流進(jìn)入下肢，這加劇了缺血再灌注損傷，容易引起血栓，嚴(yán)重時會導(dǎo)致小鼠下肢癱瘓，造成手術(shù)失敗，這也是影響PPE模型廣泛應(yīng)用的一個關(guān)鍵因素。在本研究中，通過對現(xiàn)有造模方法進(jìn)行優(yōu)化，縮短了手術(shù)時間，減少了PPE引起的血栓形成和術(shù)后動物死亡風(fēng)險(xiǎn)。另外，缺少影像設(shè)備輔助，也是限制PPE模型推廣的一個因素。本實(shí)驗(yàn)通過手術(shù)顯微鏡下攝影計(jì)算，基本解決了這一問題；雖然不能動態(tài)觀察活體動物術(shù)后血管直徑變化，但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。

本實(shí)驗(yàn)通過分離腎下腹主動脈至髂總動脈段，阻斷血流，并向腹主動脈腔內(nèi)灌注1.5 U/mL彈性蛋白酶溶液5 min，術(shù)后14 d 取材，發(fā)現(xiàn)PPE處理后小鼠血管直徑擴(kuò)張可超過50%，達(dá)到AAA 診斷標(biāo)準(zhǔn)。病變動脈段組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，動脈壁的彈力纖維層斷裂，平滑肌細(xì)胞凋亡，以及炎性細(xì)胞浸潤增多等典型的AAA 特征。本實(shí)驗(yàn)分析了20 例小鼠模型的AAA 病變組織，用PPE建模后，大多數(shù)可達(dá)到AAA病變Ⅲ到Ⅳ級。小鼠腹主動脈PPE灌注節(jié)段，彈力纖維破壞較重且典型，血管中外膜巨噬細(xì)胞浸潤明顯，平滑肌細(xì)胞標(biāo)志逐漸變?nèi)跸В交〖?xì)胞逐漸消失殆盡。而在溶劑對照組，機(jī)械張力雖然可以誘導(dǎo)一定程度的血管擴(kuò)張，但其血管直徑變化較小，組織學(xué)改變不明顯。PPE 灌注模型最初在Wistar 大鼠體內(nèi)建立，PPE 灌注后通常分為2 個階段：第一階段即PPE灌注后0～7 d，特征性表現(xiàn)為中度主動脈擴(kuò)張和急性炎癥，涉及的細(xì)胞有內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；第二階段即PPE 灌注后8～14 d，在第14 天左右形成動脈瘤，可以觀察到彈力纖維層斷裂、炎性細(xì)胞入侵增加，以及T細(xì)胞和單核細(xì)胞的募集增加、局部基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加［12］。PPE模型的血管膨脹是機(jī)械性和藥物作用的疊加，通常PPE灌注小鼠腹主動脈2周后，血管直徑擴(kuò)張至初始的50%以上后，逐漸進(jìn)入平臺期［13］。PPE灌注后不久，由于大量的彈性蛋白和彈力纖維降解，一般2周后血管壁呈纖維化狀態(tài)，動脈瘤直徑大小逐漸趨于穩(wěn)定［14］。外源PPE 灌注本身并不誘發(fā)AAA，但彈性蛋白酶灌注會觸發(fā)內(nèi)源性機(jī)制，如通過白細(xì)胞清除降解的細(xì)胞外基質(zhì)、平滑肌細(xì)胞消耗以及內(nèi)皮損傷等。近年來，PPE誘導(dǎo)的AAA模型已越來越多地被用于AAA干預(yù)的藥理學(xué)研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)室建立了一種行之有效的小鼠AAA 建模方法，同時提出和總結(jié)了對AAA 組織學(xué)評價的方法體系，這將有助于研究AAA 的發(fā)生、發(fā)展及其干預(yù)對策。