動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)室模型研究進(jìn)展

竇曼曼，宋曉南，陳 盈綜述，邢英琦審校

心腦血管疾病在人群中的發(fā)病率越來越高，而動(dòng)脈粥樣硬化是血管疾病發(fā)生的重要發(fā)病基礎(chǔ)[1]，所以研究其發(fā)病機(jī)制及其影響因素就顯得尤為重要[2]。對(duì)于科研工作者來說，成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型是實(shí)驗(yàn)開始的基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化的模型主要包括動(dòng)物模型和細(xì)胞模型[3]。動(dòng)物模型主要使用老鼠、兔子、狗、豬和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物如猴子等造模。細(xì)胞模型主要使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、淋巴細(xì)胞等造模，模擬動(dòng)脈硬化形成的過程。本文針對(duì)這兩類模型目前的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型

1.1 兔子 兔子由于對(duì)膽固醇飲食敏感，高脂喂養(yǎng)后可以快速形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，而且在實(shí)驗(yàn)中易操作，所以在動(dòng)脈粥樣硬化模型中是一個(gè)比較成熟的模型動(dòng)物[4]。在兔子的動(dòng)脈粥樣硬化模型中，新西蘭大白兔是最常用的一個(gè)物種。選擇兔子作為動(dòng)脈粥樣硬化模型時(shí)需要考慮的因素主要有：(1)在兔子動(dòng)脈粥樣硬化模型中，由于其僅能形成早期脂質(zhì)條紋，不能形成纖維斑塊，這與人體內(nèi)可形成的纖維斑塊有一定差異；(2)其肝脂肪酶活性低，容易形成肝脂肪沉積，導(dǎo)致肝損傷[5]；(3)動(dòng)脈粥樣硬化形成的周期較長(zhǎng)，兔子在該造模周期中可能會(huì)發(fā)生不可控的情況；(4)兔子和人生理結(jié)構(gòu)還是有一定的解剖差異，以至于用兔子作為動(dòng)脈粥樣硬化模型研究出來的結(jié)論可能在人身上并不適用，所以選擇兔子造模的時(shí)候也要考慮到這一點(diǎn)[6]。用兔子制造動(dòng)脈粥樣硬化模型有很多方法，包括高脂飼料喂養(yǎng)法、炎癥免疫法、內(nèi)皮損傷法、基因工程法等[7]?，F(xiàn)在就幾種常用的造模方式進(jìn)行介紹。

1.1.1 內(nèi)皮損傷法造模 在上述各種方法中，高脂喂養(yǎng)造成的動(dòng)物高脂血癥是引起動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)，各種方法導(dǎo)致內(nèi)膜損傷，加快了動(dòng)脈粥樣硬化的形成，節(jié)省了造模所需要的時(shí)間，由此建立的模型病變過程與人類動(dòng)脈粥樣硬化的演變過程相似，所以是目前實(shí)驗(yàn)中常用到的造模方式。內(nèi)皮損傷的方法主要包括神經(jīng)損傷、內(nèi)皮干燥、球囊損傷等?，F(xiàn)在研究中我們常使用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷的方法，該方法可以制備很成熟的動(dòng)脈粥樣硬化模型，現(xiàn)將該方法的技術(shù)操作要點(diǎn)介紹如下。

球囊損傷法：術(shù)前12 h禁食，不禁水。稱體重，給予25%烏拉坦注射液(4g/kg)耳緣靜脈注射，麻醉成功標(biāo)志：呼吸深慢均勻，四肢癱軟，角膜反射遲鈍。麻醉成功后耳緣靜脈推注肝素鈉200 IU/kg，防止凝血。動(dòng)物仰臥位固定于無菌手術(shù)臺(tái)，電推剪脫毛，常規(guī)外科消毒，鋪巾，沿頸正中線切開頸部皮膚，暴露皮下組織，縱行逐層鈍性分離肌肉、筋膜，分離頸動(dòng)脈血管，保護(hù)伴行的神經(jīng)，區(qū)分頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈以及頸外動(dòng)脈后，應(yīng)用動(dòng)脈夾結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，眼科剪斜向頸外動(dòng)脈剪一“V”型小口，將2.5 mm×15 mm球囊經(jīng)頸外動(dòng)脈送入頸總動(dòng)脈至主動(dòng)脈弓處，給予合適壓力，重復(fù)操作3-4次，隨后抽空球囊，緩慢撤出導(dǎo)管，無菌縫合線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，撤出動(dòng)脈夾恢復(fù)血流。檢查有無出血、滲血，逐層縫合肌肉、皮質(zhì)。應(yīng)用800000 IU青霉素肌肉注射3 d預(yù)防感染。假手術(shù)組僅在解剖出頸總動(dòng)脈后，用無菌縫合線在頸外動(dòng)脈(遠(yuǎn)心端處)打一死結(jié)，不進(jìn)行球囊損傷，青霉素肌肉注射3 d預(yù)防感染[8，9]。

球囊損傷法除了損傷頸動(dòng)脈外，球囊拉傷腹主動(dòng)脈后并高脂喂養(yǎng)也是常用的方法之一[10]。10%水合氯醛腹腔注射(5 ml/kg)麻醉后，鈍性分離出右股動(dòng)脈，注意保護(hù)股神經(jīng)，損傷后容易出現(xiàn)術(shù)肢癱瘓。將球囊導(dǎo)管(大?。?.75 mm×15 mm)套進(jìn)PTCA導(dǎo)絲(0.014)，導(dǎo)絲與球囊頭端并齊，連接壓力泵，插入前球囊表面用肝素鹽水濕潤(rùn)減少阻力，抽負(fù)壓使其變硬，眼科剪在股動(dòng)脈剪一小口，將球囊插入股動(dòng)脈內(nèi)，隨后先推送導(dǎo)絲約20 cm，固定導(dǎo)絲，沿導(dǎo)絲送入球囊導(dǎo)管約15 cm，6～8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓充盈球囊，下拉球囊至阻力明顯增大處即可停止，根據(jù)阻力大小可調(diào)整壓力泵數(shù)值，然后壓力泵恢復(fù)負(fù)壓，重新送入球囊，如此反復(fù)3次。術(shù)后結(jié)扎，逐層逢合傷口[11]。術(shù)后肌肉注射青霉素30萬單位防治感染，連續(xù)3 d[12]。

1.1.2 基因工程法造模 低密度膽固醇(LDL)在血管內(nèi)皮聚集并激活一系列炎癥反應(yīng)引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，LDL在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的始動(dòng)作用。當(dāng)?shù)兔芏饶懝檀际荏w(LDLR)缺失時(shí)會(huì)引起體內(nèi)脂質(zhì)代謝障礙，造成脂質(zhì)聚集，易形成動(dòng)脈粥樣硬化。所以LDLR-/-兔子高脂喂養(yǎng)后易形成動(dòng)脈粥樣硬化，可作為動(dòng)脈粥樣硬化模型的造模動(dòng)物[13]。

1.2 小鼠 鼠因?yàn)樗焖俜敝?，易于操作以及在合理的時(shí)間內(nèi)形成血管硬化并易于監(jiān)測(cè)，已經(jīng)成為主要的物種來研究實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化，[14]。載脂蛋白E(ApoE)是一種有明顯基因多態(tài)性的多功能蛋白，與脂蛋白的代謝有密切聯(lián)系，其缺失和變異都會(huì)引起體內(nèi)代謝失常及功能紊亂，甚至引起一系列疾病和并發(fā)癥。小鼠由于在病理及組織學(xué)形態(tài)上與人類極其相近，高脂膳食喂養(yǎng)的小鼠是研究動(dòng)脈粥樣硬化的常用動(dòng)物模型之一[15]。在具體喂養(yǎng)方法上，對(duì)于普通小鼠，通常給予普通飼料喂養(yǎng)。對(duì)于ApoE-/-小鼠給予西方飲食(21%脂肪+0.15%膽固醇)喂養(yǎng)12 w后，其血脂水平顯著增高，在主動(dòng)脈根部位置，管壁有增厚，斑塊也有明顯增多，表現(xiàn)出典型的動(dòng)脈粥樣硬化病理特征。給予ApoE-/-小鼠高脂飼料(含18%氫化可可脂、0.15%膽固醇、7%酪蛋白、7%蔗糖和3%麥芽糊精)喂養(yǎng)8 w后，通過對(duì)小鼠心臟主動(dòng)脈瓣行蘇木精-伊紅(HE)染色，證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化模型制備成功[16]。高脂喂養(yǎng)后的apoE-/-雄鼠可在多個(gè)血管部位形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，尤其是主動(dòng)脈根部，腹主動(dòng)脈[17]。目前apoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化模型已經(jīng)廣泛用于實(shí)驗(yàn)[18]。apoE-/-小鼠也有一定的局限性。首先，脂質(zhì)代謝不同，小鼠血漿中的膽固醇大部分是VLDL，而不是人體內(nèi)觀察到的LDL。其次，ApoE由于其抗氧化、抗增殖和抗炎作用，被發(fā)現(xiàn)除了介導(dǎo)脂蛋白清除外，還可能具有額外的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)特性。這些問題都限制了apoE-/-小鼠用于實(shí)驗(yàn)研究[19]。

另外，轉(zhuǎn)基因小鼠除了apoE-/-小鼠廣泛用于實(shí)驗(yàn)中外，LDLR-/-小鼠也被用于動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)的模型。LDLR是肝細(xì)胞中的細(xì)胞表面受體，介導(dǎo)apoE的內(nèi)吞作用，清除循環(huán)中膽固醇含量豐富的LDL顆粒，與野生型相比，LDLR-/-小鼠血漿總膽固醇水平增加了2倍[20]。LDLR缺失影響脂蛋白的代謝，由此建立起來的動(dòng)脈粥樣硬化模型可以更大的歸因于脂代謝異常，在實(shí)驗(yàn)研究中模型更穩(wěn)定。

1.3 大鼠 大鼠作為模型動(dòng)物也常被用于動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)。由于大鼠無膽囊的生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，造成大鼠對(duì)膽固醇等脂質(zhì)吸收較少，單純的高脂飼料喂養(yǎng)只能造成大鼠體內(nèi)脂質(zhì)沉積，很難形成典型的動(dòng)脈粥樣硬化。而高脂飲食造模時(shí)間較長(zhǎng)[21]，高脂飲食有肝臟毒性，會(huì)使動(dòng)物消瘦，造模期間有可能發(fā)生繼發(fā)感染，從而影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性[22]。維生素D可以加快大鼠體內(nèi)血鈣吸收，造成內(nèi)膜損傷，所以高脂飼料結(jié)合維生素D能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，一般采用維生素D3或D2。高脂飼料加定期注射維生素D3(6×105IU·kg-1)后8 w能加快形成動(dòng)脈粥樣硬化[23]。高脂飼料結(jié)合維生素D的同時(shí)，加以手術(shù)機(jī)械損傷作用可形成與人類動(dòng)脈粥樣硬化相似的較成熟的病變斑塊。機(jī)械損傷法主要包括球囊損傷法、電擊損傷法和動(dòng)脈鉗夾法[24]。載脂蛋白E(apoE)參與脂蛋白代謝，在大鼠的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用，故與小鼠類似，apoE-/-雄鼠高脂喂養(yǎng)后也能較快地形成動(dòng)脈粥樣硬化[25]。LDLR-/-鼠或apoE-/-和LDLR-/-雙敲除(KO)鼠也被用于動(dòng)脈粥樣硬化中，基因敲除后的大鼠可以引起體內(nèi)高脂血癥，這對(duì)形成動(dòng)脈粥樣硬化極其重要。大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化在頸動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈中均可觀察到[26]。在造模技術(shù)發(fā)展的初始階段，我們經(jīng)常使用大鼠來建造動(dòng)脈粥樣硬化模型，但是隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的成熟，大鼠作為動(dòng)脈粥樣硬化模型的缺點(diǎn)逐漸暴露出來。大鼠的生理結(jié)構(gòu)和人體是有一定差別的，有些在大鼠身上驗(yàn)證的動(dòng)脈粥樣硬化理論在人體中并不適用，而且隨著小鼠在動(dòng)脈粥樣硬化模型中的應(yīng)用越來越成熟，大鼠模型的應(yīng)用越來越少了。

1.4 其他類型的動(dòng)脈粥樣硬化模型 除了兔子，小鼠和大鼠以外，還有一些動(dòng)物被用于動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)中，如狗、豬、猴子等大型動(dòng)物。靈長(zhǎng)類動(dòng)物由于與人類的生理結(jié)構(gòu)比較相似，得出的結(jié)論在人體有較高的適用性，故用靈長(zhǎng)類動(dòng)物比如猴作為動(dòng)脈粥樣硬化模型也是較常用到的[27]。但大型動(dòng)物的缺點(diǎn)是造價(jià)昂貴，體型也較大，不好操作，所以這類動(dòng)物在實(shí)際的動(dòng)脈粥樣硬化造模使用時(shí)會(huì)受到限制。

總之，在動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化造模過程中，會(huì)選用不同的方式，主要目的是通過不同方式造成動(dòng)物動(dòng)脈壁內(nèi)脂質(zhì)沉積，這些方式包括高脂喂養(yǎng)、手術(shù)方式造成的內(nèi)皮損傷、基因敲除等手段。

2 動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞模型

在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，很多時(shí)候會(huì)涉及到細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，例如一些分子機(jī)制可能要在細(xì)胞上進(jìn)行驗(yàn)證，所以了解動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞模型也很重要。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)是動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞模型中常用到的一種細(xì)胞。與動(dòng)物模型類似，在細(xì)胞中加入某種因子可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，形成類似于動(dòng)脈粥樣硬化的過程。如脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子(TNF)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等都是典型的促炎因子[28]，都可以增加細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

LPS是動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)中常用于誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥的一個(gè)試劑。在該模型中，LPS的濃度一般采用10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/mg不等，加入LPS 24 h后通過PCR或者蛋白質(zhì)印記(Western blot)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察到該模型中的炎癥因子如白介素、細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)、血管間黏附因子-1(VCAM-1)等炎癥因子的表達(dá)增加[29]。ox-LDL在誘導(dǎo)HUVEC的炎癥反應(yīng)中常用的濃度10 μg/ml、50 μg/ml/100 μg/ml等濃度孵育24 h[30，31]，會(huì)檢測(cè)到炎癥因子增加。根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化的形成原理，在細(xì)胞中加入這些因子，目的就是加快細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)或者脂質(zhì)沉積等來加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成[32]。TNF-α的常用劑量是10 ng/ml、50 ng/ml培養(yǎng)6 h[33，34]。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，除了可以直接加入一些促炎因子外，還可以引起通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染在基因水平促進(jìn)細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，如siTNF-α[35]。在細(xì)胞動(dòng)脈粥樣硬化模型中，HUVEC是常用的一種細(xì)胞，除此之外，常用的細(xì)胞還有巨噬細(xì)胞(THP-1)[36]、樹突狀細(xì)胞(DC)[37]等，不同的細(xì)胞造模的方式相似，這些細(xì)胞均通過加入外部刺激因素促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，被廣泛用于與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路、藥物效應(yīng)等。

3 小 結(jié)

動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)主要原因是內(nèi)皮損傷和慢性炎癥，在動(dòng)脈粥樣硬化的模型中，我們根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化的形成原因?qū)?dòng)物或者細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而建造我們需要的模型。利用這樣的模型來驗(yàn)證我們提出的跟動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的一系列問題，進(jìn)而解決在臨床中可能遇到的一些問題，例如一些抗動(dòng)脈粥樣硬化通路，為腦卒中等心腦血管疾病的治療提供思路[38]。在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)研究中，成功造模是實(shí)驗(yàn)開始的前提，所以我們要根據(jù)自己想要的模型特點(diǎn)和要研究的課題來選擇合適的模型。