光聚合水凝膠在軟骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展

施昌勁 姚宇 吳剛 孫平 馮劍穎

關(guān)節(jié)軟骨由于缺乏血管組織的解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其缺損難以達(dá)到自我修復(fù)，是現(xiàn)臨床亟需解決的重要問(wèn)題[1]。軟骨組織工程學(xué)為解決這一難題提供新的治療思路。在眾多軟骨組織工程學(xué)支架材料研發(fā)中，光聚合水凝膠材料日益受到學(xué)者們的關(guān)注。1960年，人們研制出了交聯(lián)聚（羥乙基）甲基丙烯酸酯水凝膠，以此開(kāi)始了水凝膠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[2]。水凝膠是一類(lèi)通過(guò)共價(jià)鍵、范德華力或氫鍵等相互作用而交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，具有優(yōu)良的生物相容性、生物降解性、可調(diào)節(jié)性以及機(jī)械學(xué)性能，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究[3]。光聚合水凝膠為一類(lèi)在可見(jiàn)光或紫外光作用下，光引發(fā)劑釋放自由基與水凝膠預(yù)聚體結(jié)合，觸發(fā)成膠反應(yīng)的水凝膠。因其可調(diào)節(jié)性強(qiáng)、生物相容性好的特點(diǎn)[4]，近年來(lái)成為軟骨組織工程支架材料研究的熱點(diǎn)。

1 光聚合水凝膠的材料

1.1 天然來(lái)源光聚合水凝膠 天然高分子聚合物，如透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、殼聚糖等可良好地包裹軟骨細(xì)胞，有著較高的生物相容性，并可通過(guò)特定表面受體與細(xì)胞相互作用，促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。

1.1.1 透明質(zhì)酸 透明質(zhì)酸廣泛存在于脊椎動(dòng)物上皮和結(jié)締組織中，是一種天然的線性多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖組成，由β-1，3-糖苷鍵和β-1，4-糖苷鍵連接。它能與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化的作用，并存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，維持組織的機(jī)械完整性、穩(wěn)態(tài)、黏彈性和潤(rùn)滑性[5]。

1.1.2 海藻酸鹽 海藻酸鹽是一類(lèi)提取自褐藻類(lèi)的海帶或馬尾藻的一種多糖碳水化合物，以?xún)r(jià)格低、生物相容性好和低免疫原性且容易獲得為特征，廣泛應(yīng)用于各種生物醫(yī)藥領(lǐng)域[6]。

1.1.3 殼聚糖 殼聚糖為甲殼素脫乙酰后獲得，是唯一一種高分子堿性氨基多糖，與細(xì)胞外基質(zhì)中大量存在的氨基多糖在物理化學(xué)性能上非常相似，具有良好的生物相容性和可生物降解性[7]。

1.1.4 其他 硫酸軟骨素[8]、蛋白[9]、纖維素[10]等都是自然界廣泛存在的天然水凝膠來(lái)源。

1.2 人工合成來(lái)源光聚合水凝膠 經(jīng)由人工合成的高分子聚合物諸如聚乙烯醇、聚乙二醇等，具備優(yōu)良的機(jī)械學(xué)性能、可調(diào)節(jié)性，且易于獲得。它們?cè)谔峁└叨人檄h(huán)境的同時(shí)，具有很高的誘捕活細(xì)胞的潛力，可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散，并刺激細(xì)胞遷移、增殖和分化。

1.2.1 聚乙烯醇 聚乙烯醇是一種具有良好生物相容性的水溶性高分子材料，可經(jīng)由聚乙稀醋酸酯的醇解或水解得到。因其具有的良好生物相容性，高水含量以及與組織相似的粘彈性質(zhì)使其在軟骨組織工程、傷口輔料、藥物載體中廣泛應(yīng)用[11]。

1.2.2 聚乙二醇及其衍生物 聚乙二醇是具有線性和分支（多臂或星形）結(jié)構(gòu)的親水性聚合物，以具有兩個(gè)末端羥基基團(tuán)為結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可被功能化為其他官能團(tuán)，以利于水凝膠的形成或與生物分子的結(jié)合。

1.2.3 其他 聚丙烯酸衍生物[12]、聚乳酸（PLA）[13]、聚L-丙交酯-己內(nèi)酯（PLCL）[14]等人工合成水凝膠材料也被廣泛研究與應(yīng)用。

2 光聚合水凝膠的性能

各種環(huán)境響應(yīng)性水凝膠近年來(lái)愈發(fā)受到學(xué)者們的關(guān)注，如溫度響應(yīng)性水凝膠、pH響應(yīng)性水凝膠、磁響應(yīng)性水凝膠以及光聚合性水凝膠。在各種環(huán)境的刺激下，水凝膠可促發(fā)聚合成膠反應(yīng)[15-17]。與其他環(huán)境響應(yīng)性水凝膠相比，光聚合可在生物體中較為苛刻的溫度及pH環(huán)境下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和（光照強(qiáng)度低、照射時(shí)間短、生理溫度下、有機(jī)溶劑水平低等），并通過(guò)利用光源的調(diào)控如光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度等，實(shí)現(xiàn)對(duì)形成水凝膠的時(shí)間及結(jié)構(gòu)特性的精準(zhǔn)調(diào)節(jié)[18-19]。

光聚合水凝膠通常由預(yù)聚體及光引發(fā)劑兩大部分組成，其光聚合反應(yīng)一般分為自由基鏈?zhǔn)骄酆吓c生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)兩種[20]。大部分光聚合水凝膠采用自由基鏈?zhǔn)骄酆戏绞剑錂C(jī)制為光引發(fā)劑吸收光子并裂解形成自由基，自由基粒子與預(yù)聚體中的乙烯基鍵發(fā)生反應(yīng)，發(fā)生鏈增長(zhǎng)，形成化學(xué)交聯(lián)[21]。生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是在溫和的條件下進(jìn)行，具有更快的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、更高的效率和選擇性[22]，但由于反應(yīng)中含硫醇小分子的保質(zhì)期較短（幾小時(shí)至幾天），使得其實(shí)際應(yīng)用受到限制與挑戰(zhàn)[23]。

光引發(fā)劑是光聚合水凝膠的重要組成部分，影響光聚合水凝膠的性能，在光聚合的效率和成膠特性上起到關(guān)鍵作用。目前常用的光引發(fā)劑主要有自由基光引發(fā)劑和陽(yáng)離子光引發(fā)劑兩大類(lèi)[24]。自由基光引發(fā)劑如I2959由于其具備的良好的生物相容性，為目前應(yīng)用最廣泛的光引發(fā)劑[25]。相比之下，陽(yáng)離子光引發(fā)劑可產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有害的質(zhì)子酸，極大地限制了其應(yīng)用[26]。引發(fā)聚合反應(yīng)的光源可采用365 nm的紫外光和450～550 nm的可見(jiàn)光[27]。

光聚合水凝膠具備優(yōu)良的生物相容性與生物降解性，是組織工程中的理想選擇材料[28]。其含水量較高，機(jī)械學(xué)性能與生物組織類(lèi)似，模擬細(xì)胞外基質(zhì)的滲透性與支持功能，利于氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸。天然來(lái)源光聚合水凝膠可被人溶菌酶生物降解并產(chǎn)生生物相容性的副產(chǎn)物，較人工合成來(lái)源光聚合水凝膠具有更好的生物相容性。而人工合成來(lái)源光聚合水凝膠的組分可調(diào)節(jié)，理化性能與生物降解代謝時(shí)間可根據(jù)組織部位、需求而優(yōu)化，應(yīng)用范圍和前景也更廣泛[29]。

此外，光聚合水凝膠有著如下特性：成膠的時(shí)機(jī)易于控制；可通過(guò)精確調(diào)節(jié)光照劑量實(shí)現(xiàn)水凝膠的功能調(diào)節(jié)；較小的反應(yīng)熱；成膠固化迅速（可從不到1 s至幾分鐘）；在光照作用下，水凝膠可原位成膠，形成的幾何形狀易于控制[30]。光聚合水凝膠可直接與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3等細(xì)胞因子結(jié)合，將細(xì)胞因子信號(hào)傳遞作用于包封在水凝膠基質(zhì)中或者周?chē)募?xì)胞團(tuán)。在一些細(xì)胞療法中，光聚合水凝膠可作為支架為細(xì)胞提供支持作用，并促進(jìn)代謝產(chǎn)物的適當(dāng)擴(kuò)散以及保護(hù)其免受自身免疫性炎癥的影響[31]。

3 光聚合水凝膠在軟骨組織工程中的應(yīng)用

3.1 搭載細(xì)胞支架材料

3.1.1 搭載多能干細(xì)胞促進(jìn)軟骨修復(fù) 光聚合水凝膠具有高含水量、良好生物降解性和生物相容性、網(wǎng)狀空隙結(jié)構(gòu)的特性，利于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化。在軟骨組織工程中，常搭載諸如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[32-33]、脂肪間充質(zhì)多能干細(xì)胞[34]等多能干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)軟骨組織的再生修復(fù)。Pascual-Garrido等[32]利用聚乙二醇和基質(zhì)金屬蛋白酶2制備了模擬軟骨環(huán)境水凝膠。體內(nèi)體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，此新型水凝膠通過(guò)搭載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在兔關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)術(shù)區(qū)原位光聚合，并促進(jìn)兔軟骨修復(fù)。Lin等[33]研究表明，可見(jiàn)光活化甲基丙烯酸明膠水凝膠搭載人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)了兔全層關(guān)節(jié)軟骨缺損軟骨單元的再生。

3.1.2 搭載軟骨細(xì)胞促進(jìn)軟骨修復(fù) 自體軟骨細(xì)胞移植已被廣泛用于臨床軟骨缺損的治療，然而提高移植軟骨細(xì)胞在缺損區(qū)的存活率仍是挑戰(zhàn)。許多研究表明，軟骨細(xì)胞在光聚合水凝膠中可以很好增殖，表達(dá)軟骨相關(guān)的蛋白或基因，并保持細(xì)胞的形態(tài)和表型[35-37]。

Balaji等[35]通過(guò)硫醇-烯反應(yīng)生成了聚乙二醇-明膠光聚合水凝膠，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)包封軟骨細(xì)胞14 d后，該水凝膠培養(yǎng)體系中出現(xiàn)明顯的水凝膠降解伴隨高質(zhì)量的軟骨形成與軟骨細(xì)胞的擴(kuò)散以及糖胺聚糖增多、廣泛軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)沉積，提示這種新型水凝膠在軟骨修復(fù)應(yīng)用上具備較大的潛力。Qi等[37]制備了一種絲膠基甲基丙烯酰光聚合水凝膠，即使在缺乏營(yíng)養(yǎng)的情況下，也能促進(jìn)附著軟骨細(xì)胞的增殖，同時(shí)體內(nèi)植入載軟骨細(xì)胞的絲膠基甲基丙烯酰光聚合水凝膠可在8周后有效地形成人工軟骨。

3.2 無(wú)細(xì)胞支架材料 雖然搭載細(xì)胞的光聚合水凝膠在軟骨組織工程上的研究與應(yīng)用已取得了較大的進(jìn)展，然而由于細(xì)胞提取成本高、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等原因，近年來(lái)無(wú)細(xì)胞支架材料在軟骨組織工程中逐漸成為研究熱點(diǎn)。Dua等[38]證實(shí)，羥基磷灰石增強(qiáng)下未搭載細(xì)胞的聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）水凝膠有效促進(jìn)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)。Levingstone等[39]制備了一種新型無(wú)細(xì)胞多層仿生膠原基水凝膠支架，通過(guò)分層誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞爬入吸附，在12個(gè)月后完善地修復(fù)了兔關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損，表明該無(wú)細(xì)胞支架材料存在較大臨床應(yīng)用潛力。

3.3 藥物及生長(zhǎng)因子的釋放載體 軟骨組織的生長(zhǎng)和發(fā)育需要依賴(lài)各種生物活性分子的調(diào)節(jié)。在生物活性分子的作用下，周?chē)浌羌?xì)胞得以聚集、增殖、分化，形成新生組織。生物活性分子可以包括生長(zhǎng)因子、黏附蛋白、多肽等[18]，對(duì)生長(zhǎng)因子的調(diào)控與釋放在軟骨組織工程中至關(guān)重要。Sharma等[40]證實(shí)，在含有透明質(zhì)酸和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3的水凝膠中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了高質(zhì)量的軟骨，透明質(zhì)酸與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3結(jié)合可提高蛋白多糖的生成，減少Ⅰ型膠原的產(chǎn)生。Shao等[41]制備了馬來(lái)酰殼聚糖復(fù)合甲基丙烯酸絲素納米顆粒光聚合水凝膠，并搭載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，可有效促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與小鼠成骨細(xì)胞的黏附與增殖。水凝膠和細(xì)胞因子的組合還有待進(jìn)一步探索。

4 挑戰(zhàn)與展望

目前在光聚合水凝膠臨床推廣上仍需解決幾個(gè)難題。（1）光源的有害暴露。光聚合過(guò)程中的紫外線可對(duì)周?chē)M織細(xì)胞DNA造成氧化損傷，以及加速周?chē)M織老化、增加致癌的風(fēng)險(xiǎn)等[18]。臨床傾向于采用波長(zhǎng)為450～550 nm的可見(jiàn)光作為替代光源[27]。（2）自由基的產(chǎn)生。在自由基鏈?zhǔn)骄酆现?，自由基可引發(fā)水凝膠鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，但也可與細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞成分中的雙鍵相互作用，從而威脅細(xì)胞活力、新陳代謝和DNA的完整性[42]，進(jìn)而增加腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。（3）光引發(fā)劑的內(nèi)在毒性。因此，光引發(fā)劑的選擇、聚合方式的優(yōu)化，依舊需要持續(xù)的探索。

光聚合水凝膠由于其優(yōu)良的生物相容性、物理結(jié)構(gòu)特征、生物降解性，可作為軟骨組織工程學(xué)支架材料的開(kāi)發(fā)方向。其有原位光照交聯(lián)、材料性能的精準(zhǔn)時(shí)間空間調(diào)控的特性，具有廣闊的應(yīng)用前景。研究制備仿生、天然的光聚合水凝膠材料，提高臨床應(yīng)用流程的安全性將是學(xué)者們今后研究的熱點(diǎn)和方向。