心血管系統(tǒng)中的生物鐘和細(xì)胞周期

穆樂(lè) 李光華

750004 銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系

自2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了在生物晝夜節(jié)律分子機(jī)制方面做出杰出貢獻(xiàn)的3位科學(xué)家后，激發(fā)了很多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家們探索生物鐘(circadian clocks)的興趣。生物鐘存在于機(jī)體的器官、組織乃至細(xì)胞中，可以直接調(diào)控心血管機(jī)能，包括血壓高低、心率快慢、血管內(nèi)皮功能等。細(xì)胞周期作為體內(nèi)的振蕩器，對(duì)于心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)的存活也至關(guān)重要。生物鐘與細(xì)胞周期之間相互聯(lián)系，前者在不同水平上參與細(xì)胞的增殖和凋亡，而細(xì)胞周期進(jìn)程中關(guān)鍵周期蛋白的節(jié)律性表達(dá)與部分鐘基因密切聯(lián)系。因此，揭示生物鐘基因與細(xì)胞周期之間的相互關(guān)聯(lián)，將為心血管疾病預(yù)防與治療提供新的思路。

1 生物鐘在機(jī)體功能調(diào)控中的作用

1.1 生物鐘系統(tǒng)

生物鐘是通過(guò)參與生理、生化、行為過(guò)程而設(shè)定并調(diào)控機(jī)體晝夜周期的內(nèi)在自主時(shí)鐘控制系統(tǒng)，是維持機(jī)體節(jié)律性活動(dòng)的基本單位。但產(chǎn)生和維持生物節(jié)律的根本原因是存在于生物各級(jí)水平的鐘基因及其編碼的蛋白質(zhì)，它們彼此相互作用，構(gòu)成一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路，以維持近似24 h的周期節(jié)律振蕩，實(shí)現(xiàn)有序、協(xié)同、高效的生命活動(dòng)，從而適應(yīng)外界環(huán)境的變化。從細(xì)胞層面來(lái)看，轉(zhuǎn)錄-翻譯環(huán)路分子機(jī)制的過(guò)程如下[1]：Clock與Bmal1的基因表達(dá)產(chǎn)物是具有bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，二者可形成異源二聚體CLOCK/BMAL1，與靶基因啟動(dòng)子中的E-box的CACGTG序列結(jié)合，從而誘導(dǎo)Per和Cry基因的轉(zhuǎn)錄，并在細(xì)胞質(zhì)中翻譯成對(duì)應(yīng)的PER和CRY蛋白，當(dāng)胞漿里的PER和CRY蛋白積累達(dá)到高峰后，會(huì)形成穩(wěn)定的PER和CRY蛋白復(fù)合物重新進(jìn)入細(xì)胞核，抑制CLOCK和BMAL1的異源二聚化，形成主要的負(fù)反饋回路；同時(shí)CLOCK/BMAL1可以促進(jìn)Rev-Erbα的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而Rev-Erbα可以抑制Bmal1的活化和mPer與mCry的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)CRY進(jìn)入核內(nèi)又可抑制mPer、mCry與Rev-Erbα的轉(zhuǎn)錄，由此解除抑制的Bmal1的轉(zhuǎn)錄。另一方面，BMAL1/CLOCK通過(guò)微小RNA的作用結(jié)合于Bmal1的3’非翻譯區(qū)，形成Bmal1自身的負(fù)反饋表達(dá)調(diào)控。由于鐘基因的反饋調(diào)節(jié)，生物體的生理活動(dòng)得以優(yōu)化并表現(xiàn)出明顯的生物節(jié)律性。研究發(fā)現(xiàn)，在帕金森動(dòng)物模型中Bmal1、Per1、Per2和Cry1表達(dá)的相應(yīng)蛋白減少[2]；Bray等[3]發(fā)現(xiàn)，Clock基因突變的小鼠的心肌收縮力、新陳代謝功能都發(fā)生了不同程度的改變。大量研究證實(shí)，生物鐘系統(tǒng)的異常引起一些鐘基因表達(dá)的改變，可以參與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的病理過(guò)程，與疾病的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)防治療緊密關(guān)聯(lián)。

1.2 鐘基因?qū)π难芑顒?dòng)的調(diào)節(jié)

哺乳動(dòng)物的心臟和血管中都存在內(nèi)源性的生物鐘系統(tǒng)。 小鼠心肌組織中約13%的基因呈晝夜節(jié)律性表達(dá)。大鼠的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能也顯示出清晰的晝夜節(jié)律。正常情況下，生物鐘調(diào)控著機(jī)體心血管功能如血壓高低、心率快慢、內(nèi)皮依賴的血管舒縮功能等，且大部分心血管功能表現(xiàn)出夜間低、白晝高、下午達(dá)到峰值的變化特征。越來(lái)越多研究表明，生物鐘在維持正常心血管功能中發(fā)揮重要作用，同時(shí)生物鐘紊亂及鐘基因異常能夠影響動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。

在心血管系統(tǒng)中，Bmal1、Per2和Cry發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。Bmal1一旦缺失會(huì)直接影響血壓和心率等基本生理指標(biāo)。小鼠全身敲除Bmal1，其血壓的正常晝夜節(jié)律會(huì)完全消除，同時(shí)引發(fā)低血壓，其機(jī)制可能與兒茶酚胺的產(chǎn)生減少有關(guān)[4]。krlec等[5]利用單核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，Per2和Cry2基因的遺傳變異可能與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)采用無(wú)線電遙測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Bmal1-/-小鼠活動(dòng)節(jié)律完全喪失，表現(xiàn)為持續(xù)性低血壓，推測(cè)可能是一氧化氮信號(hào)解偶聯(lián)、超氧化物增加，使血管內(nèi)皮功能障礙，最終導(dǎo)致了血壓水平異常[6]。Qiao等[7]發(fā)現(xiàn)，Bmal1可通過(guò)雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路調(diào)控自噬，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受高糖毒性。Bhatwadekar等[8]研究顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞缺失Bmal1會(huì)加速視網(wǎng)膜微血管和股動(dòng)脈大血管的損傷。此外，Per2基因在維持血管內(nèi)皮功能中作用更為明顯。Per2基因敲除會(huì)造成小鼠夜間血壓和心率的下降[9]。從健康動(dòng)脈中提取血清檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞的鐘基因Per2、Bmal1和Cry1表達(dá)具有明顯的晝夜節(jié)律性[10]。Per2突變小鼠模型中，小鼠主動(dòng)脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張活性降低，涉及一氧化氮和血管舒張性前列腺素的生成減少，以及環(huán)氧合酶1衍生的血管收縮因子釋放增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[11]。動(dòng)脈粥樣硬化患者與健康人群相比Cry1水平明顯下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠過(guò)表達(dá)Cry1基因，小鼠粥樣斑塊面積減小，血中總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平降低。

隨著對(duì)鐘基因研究的深入關(guān)注，鐘基因在心血管疾病中發(fā)揮的作用逐漸為我們所認(rèn)識(shí)。將生物節(jié)律引入心血管疾病的臨床治療中已經(jīng)顯現(xiàn)出潛在的益處。Winter等[12]最新的研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化病變部位髓系細(xì)胞的募集具有明顯節(jié)律，因此提出了在高峰期給藥抑制髓系細(xì)胞募集從而緩解動(dòng)脈粥樣硬化的策略。阿司匹林的降壓療效具有明顯的時(shí)效性，無(wú)論是高血壓患者還是在高鹽引起的高血壓小鼠模型，臨睡前給予阿司匹林的降壓效果明顯優(yōu)于清晨給藥[13]。王艷君等[14]發(fā)現(xiàn)，辰時(shí)針刺可能通過(guò)提高SHR心臟Clock與Bmal1基因的表達(dá)水平、提高血清褪黑素含量及降低5-羥色胺含量，從而實(shí)現(xiàn)降壓效果。Montaigne等[15]隨機(jī)對(duì)患者的心肌標(biāo)本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)Rev-erbα核受體可能是心臟保護(hù)的潛在藥理靶點(diǎn)。因此，生物鐘對(duì)于心血管疾病的影響不可忽視。我們既要關(guān)注核心鐘基因?qū)τ谛难芄δ艿谋Ｗo(hù)作用，更應(yīng)該利用生物節(jié)律來(lái)治療和預(yù)防心腦血管疾病，從而有助于優(yōu)化心血管疾病的預(yù)防和治療策略。

2 生物鐘與細(xì)胞周期的相互作用

真核生物生命中最基本的兩個(gè)周期是調(diào)節(jié)生命活動(dòng)的生物鐘和驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞周期。一般情況下，細(xì)胞增殖通常表現(xiàn)為24 h的分裂速率，原因在于生物鐘可以直接調(diào)控細(xì)胞周期。最新研究發(fā)現(xiàn)，敲除鐘基因Bmal1或Clock會(huì)抑制Cyclin B1的表達(dá)，阻滯G2-M期的轉(zhuǎn)變，表明生物鐘與細(xì)胞周期之間存在相互作用[16]。越來(lái)越多的研究揭示了生物鐘與細(xì)胞周期的相互作用常作用于細(xì)胞周期檢查點(diǎn)：哺乳動(dòng)物體內(nèi)Per1和Per2基因抑制G1-S期轉(zhuǎn)變，而Bmal1和Clock則參與調(diào)節(jié)G2-M期的轉(zhuǎn)變。

隨著時(shí)間治療學(xué)的提出，在基礎(chǔ)科研和臨床疾病治療中我們也關(guān)注到了生物鐘和細(xì)胞周期之間的聯(lián)系。Lee等[17]發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞或組織中，中斷晝夜節(jié)律能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白的磷酸化，從而有利于細(xì)胞周期G1/S期的進(jìn)行；在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌患者中發(fā)現(xiàn)，鐘基因Per2、Clock和Cry2會(huì)激活RTK信號(hào)通路[18]。付小娟等[19]發(fā)現(xiàn)，人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC15細(xì)胞沉默Per1基因后，Cyclin D1和Cyclin E表達(dá)顯著增高，激活了CDK2、CDK4或CDK6的活性，同時(shí)p16和p21表達(dá)顯著降低，對(duì)CDK2、CDK4和CDK6活性的抑制能力減弱，從而增強(qiáng)了細(xì)胞G1期的啟動(dòng)能力，促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期加速過(guò)渡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Cao等[20]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Per1基因會(huì)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。沉默Per2基因可以下調(diào)部分生物鐘相關(guān)因子和周期調(diào)控基因的mRNA表達(dá)，并主要通過(guò)抑制Cyclin D1與CDK4的表達(dá)而阻滯細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換。另外，降低Cyclin B1的表達(dá)可以抑制Bmal1的表達(dá)，Bmal1基因過(guò)表達(dá)后Cyclin B1表達(dá)減少及p21表達(dá)增加。血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮是在一氧化氮合酶(NOS)催化下合成的內(nèi)源性硝基血管擴(kuò)張劑，主要修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，eNOS能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染eNOS后的細(xì)胞，eNOS mRNA表達(dá)下降，并通過(guò)cGMP途徑上調(diào)細(xì)胞周期依賴性蛋白酶抑制劑P27和p21的表達(dá)，抑制Rb蛋白磷酸化，使血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯在G0期，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[21]。生物鐘與細(xì)胞周期的相互作用顯而易見。

3 細(xì)胞周期在心血管系統(tǒng)中的調(diào)控作用

3.1 細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程。正常細(xì)胞周期經(jīng)歷了G1-S-G2-M四個(gè)時(shí)相，其中包括G1/S期、G2/M期和中期3個(gè)主要檢查點(diǎn)。細(xì)胞周期的順利推進(jìn)離不開細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs)組成的Cyclins-CDKs-CKIs分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。

G1期是啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)行的關(guān)鍵，有絲分裂信號(hào)誘導(dǎo)Cyclin D1的表達(dá)，Cyclin D1與CDK4或CDK6結(jié)合并激活，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種蛋白質(zhì)、糖類、脂類等，以確保DNA的復(fù)制。Cyclin D蛋白會(huì)在S期降解以確保DNA復(fù)制的高保真性。Cyclin E2與CDk2是調(diào)控細(xì)胞周期G1/S期過(guò)渡的關(guān)鍵物質(zhì)，Cyclin E2可以進(jìn)一步磷酸化Rb蛋白，釋放轉(zhuǎn)錄因子和核苷酸合成所需基因，從而促進(jìn)S期進(jìn)展。Cyclin A2能與CDK2結(jié)合并激活CDK2，Cyclin A2-CDK2復(fù)合物通過(guò)Bora的直接磷酸化刺激PLK1，去除抑制性磷酸化所需的磷酸酶，從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G2期。Cyclin B1與CDK1結(jié)合激活CDK1，CDK1/Cyclin B1復(fù)合體驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從G2期向M期轉(zhuǎn)化。同時(shí)Cyclin B1在G2晚期達(dá)到峰值，完全磷酸化細(xì)胞分裂所需的各種底物[22]。

細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和分裂是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的共同特征。心肌細(xì)胞的增殖調(diào)控是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過(guò)程，中晚期實(shí)驗(yàn)胎鼠若缺乏Cyclin D蛋白，會(huì)死于繼發(fā)性心臟畸形。體外高表達(dá)Cyclin B1/CDK2能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞順利進(jìn)入細(xì)胞周期[23]。因此，特異性抑制Cyclin D或Cyclin B等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)可以抑制心肌細(xì)胞增殖，關(guān)注細(xì)胞周期中的關(guān)鍵蛋白將是開發(fā)心血管疾病治療的新靶點(diǎn)。

3.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的信號(hào)通路

血管內(nèi)皮是由單層的內(nèi)皮細(xì)胞緊密相連形成的，其完整性是維持血管穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)，而細(xì)胞周期是保證血管內(nèi)皮完整性的關(guān)鍵。心血管疾病的發(fā)生發(fā)展是復(fù)雜的，研究表明細(xì)胞接受不同因素刺激后，會(huì)激活相關(guān)信號(hào)通路引起Cyclins/CDKs的改變，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖。PI3K/Akt是介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要信號(hào)通路，Akt主要介導(dǎo)細(xì)胞增殖與凋亡，在動(dòng)脈粥樣硬化和血管重構(gòu)中，Akt可以促進(jìn)VSMC的增殖從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[24]。Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)VSMC的增殖和遷移，提示我們可以開發(fā)Wnt通路抑制劑來(lái)干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulating kinase，ERK)在細(xì)胞增殖的過(guò)程中可以刺激細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。使用PI3K或Akt抑制劑可以抑制VSMC的增殖[25]。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)鐘基因Per1、Per2，從而激活RAS/ERK通路，影響Cyclin E的表達(dá)，最終影響VSMCs的增殖[26]。研究表明，ERK通路通過(guò)改變Cyclin D1進(jìn)而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程[27]。信號(hào)通路參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖遷移及影響細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，以此通路作為基點(diǎn)開發(fā)心血管疾病的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

3.3 細(xì)胞周期變化與心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)

心血管疾病仍然是導(dǎo)致全世界人類死亡的主要原因。我們常見的心血管疾病大多表現(xiàn)為血管細(xì)胞和心肌細(xì)胞的過(guò)度增殖，包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和心肌病等。

哺乳動(dòng)物胚胎期的心肌細(xì)胞可以在細(xì)胞周期的G1、S、G2和M期高表達(dá)相應(yīng)的Cyclins，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的快速增殖。心臟再生與心肌細(xì)胞的增殖直接相關(guān)。出生后的心臟體外高表達(dá)相關(guān)的Cyclins，如Cyclin D1和Cyclin A1等增加了細(xì)胞周期活性，能夠造成心肌肥大，若上調(diào)CDK抑制劑p21等可以抑制心肌細(xì)胞的增殖[28]。表達(dá)Cyclin D2轉(zhuǎn)基因的小鼠介導(dǎo)的小鼠心臟再生[29]。Lin等[30]發(fā)現(xiàn)，氧化型低密度脂蛋白可能通過(guò)正向調(diào)控CDK2、CDK4、Cyclin E和Cyclin D等表達(dá)及負(fù)向調(diào)節(jié)p21和p27的表達(dá)，促進(jìn)人類主動(dòng)脈VSMC增殖，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的形成。Tanner 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照血壓正常大鼠，自發(fā)性高血壓大鼠的主動(dòng)脈VSMC在G1期高表達(dá)Cyclin D、Cyclin E和Cyclin A，但CDK2和p21、p27的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，表明自發(fā)性高血壓的VSMC更易增殖。轉(zhuǎn)基因成年小鼠的心肌過(guò)表達(dá)Cyclin D1、Cyclin D2或Cyclin D3會(huì)明顯增加心肌DNA合成[32]?；加行募〔〉膫€(gè)體的CDK9活性增加，CDK9可以使RNA酶Ⅱ的COOH末端區(qū)域(CTD)磷酸化后，直接與核因子相互作用解離出snRNA，因此促進(jìn)了心肌細(xì)胞的肥大和增殖[33]。綜上，當(dāng)心肌或血管受損后，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白中Cyclins和CDKs的表達(dá)上調(diào)而CDKIs(如p21、p27)的表達(dá)下調(diào)，提示開發(fā)有效的細(xì)胞周期抑制劑可以阻滯細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，這為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病提供了可能。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

生物鐘在維護(hù)機(jī)體的生命健康方面發(fā)揮重要作用。鐘基因Per2和Bmal1對(duì)心臟具有保護(hù)作用，相反，如果出現(xiàn)鐘基因的缺失或突變會(huì)造成動(dòng)脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮功能障礙、高血壓等。細(xì)胞周期是維持細(xì)胞功能完整性的關(guān)鍵，細(xì)胞過(guò)度增殖是心血管疾病的明顯特征，而核心鐘基因可以抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。綜上，生物鐘和細(xì)胞周期同是生物體內(nèi)的振蕩器，鐘基因的正常表達(dá)與細(xì)胞周期的正常推進(jìn)可以維持和保護(hù)正常心血管功能，因此關(guān)注鐘基因及開發(fā)細(xì)胞周期抑制劑將會(huì)成為心血管疾病的治療新靶點(diǎn)。

利益沖突：無(wú)