斑馬魚模型與腦出血遺傳分子機制研究進(jìn)展

王雪琪 郭睿 陳雨麒 劉翼 游潮 王業(yè)啟 田蕊

腦出血是老年人群最為常見的急性進(jìn)行性腦血管病，具有高發(fā)病率、高病死率、高病殘率的臨床特點，同時具有明顯的遺傳傾向［1］。目前對于腦出血的發(fā)病機制尚不十分清楚，一般認(rèn)為與高血壓、腦血管畸形、顱內(nèi)動脈瘤、腦血管淀粉樣變、顱腦創(chuàng)傷或抗血栓藥物等危險因素有關(guān)［2?5］。有研究顯示，影響腦血管和血?腦屏障（BBB）發(fā)育的相關(guān)基因突變?nèi)鏝OTCH3基因突變，可能與腦血管畸形、顱內(nèi)動脈瘤和腦血管淀粉樣變相關(guān)性腦出血密切相關(guān)［6］。血?腦屏障構(gòu)成單元之間共同作用以維持腦組織氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)輸送與能量代謝平衡，并保護(hù)大腦免受毒素與病原體侵害，其構(gòu)成單元發(fā)生病變即可造成腦血管結(jié)構(gòu)或功能障礙。目前針對血?腦屏障的動物實驗大多采用大鼠、小鼠、猴或斑馬魚等作為疾病模型［7］，其中斑馬魚因具備血管結(jié)構(gòu)易觀察、基因和藥物靶點相對保守，并可進(jìn)行高通量表型篩選等優(yōu)勢，有利于對腦出血相關(guān)遺傳因素進(jìn)行全面剖析而成為較為理想的腦血管病遺傳分子學(xué)研究模型生物。本文重點對基于斑馬魚腦出血模型血?腦屏障調(diào)控的遺傳分子學(xué)研究與腦出血致病機制的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，以加深對其發(fā)病機制的理解，并協(xié)助制定相應(yīng)防治策略。

一、血?腦屏障的形成、構(gòu)成單元及其功能

1.血?腦屏障的形成在大部分哺乳動物胚胎期，當(dāng)神經(jīng)周圍血管與神經(jīng)開始相互交聯(lián)時，功能性血?腦屏障即已逐漸形成。Ben?Zvi等［8］采用熒光染料標(biāo)記的方法對小鼠不同胚胎時期血?腦屏障滲漏情況進(jìn)行鑒定，Dextran等熒光染料經(jīng)胚胎小鼠肝臟回流至血管，并最終進(jìn)入血?腦屏障；經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，Dextran滲漏自胚胎13.5天逐漸減少，至15.5天已無滲漏，標(biāo)志著功能完整的血?腦屏障業(yè)已形成，而且此過程是在胚胎發(fā)育期逐漸形成的。動物實驗顯示，斑馬魚胚胎受精后20小時即可在其后腦腹側(cè)觀察到熒光染料標(biāo)志物，此為與血?腦屏障形成密切相關(guān)的神經(jīng)周圍血管?原始后腦通道（PHBC）部位［9］，提示功能性血?腦屏障在斑馬魚胚胎第4天即已基本形成［10］。上述研究結(jié)果表明，功能性血?腦屏障形成于斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，與小鼠模型相比，采用該模型研究血?腦屏障相關(guān)疾病所需周期更短。然而，新近研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚功能性血?腦屏障的形成呈現(xiàn)前后軸特性，經(jīng)窖蛋白（Cav?1）標(biāo)記的囊泡數(shù)目從前腦向后腦逐漸減少，直至胚胎第6天才形成功能完整的血?腦屏障［11］。

2.血?腦屏障構(gòu)成單元與功能血?腦屏障系分隔中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周血液循環(huán)系統(tǒng)的多細(xì)胞血管結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)層特化的內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、中間層的周細(xì)胞（pericyte）、外層的星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte）和基膜（BM）［12］。血?腦屏障構(gòu)成單元在維持其功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，若內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生結(jié)構(gòu)或功能變異，則可導(dǎo)致其完整性和通透性改變［13］，進(jìn)而影響腦內(nèi)物質(zhì)與能量代謝平衡，在危險因素的作用下極易誘發(fā)腦出血。內(nèi)皮細(xì)胞對維持血?腦屏障的完整性至關(guān)重要。血?腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞具有特化的緊密連接，分別由咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）、緊密連接黏附分子（JAMs）和三細(xì)胞緊密連接蛋白（Tricellulins）所組成，上述蛋白富集于血?腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞，維持血?腦屏障完整性。既往研究表明，盡管Ocln基因敲除小鼠緊密連接發(fā)育正常，但Ocln基因缺失可影響緊密連接蛋白ZO?1的定位［12］。斑馬魚Cldn5有兩個同源基因——Cldn5a和Cldn5b，Cldn5b基因于受精后48小時特異性表達(dá)于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，而Cldn5a基因廣泛表達(dá)于脈絡(luò)叢室管膜細(xì)胞［9］。針對Cldn5基因敲除斑馬魚的最新研究發(fā)現(xiàn)，Cldn5基因還具有自噬激活功能，可通過調(diào)節(jié)自噬而保護(hù)血?腦屏障的完整性，為血?腦屏障功能紊亂導(dǎo)致的腦血管病提供潛在的治療策略［14］。周細(xì)胞是包覆神經(jīng)鞘側(cè)毛細(xì)血管上的一類壁細(xì)胞，位于內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞之間，在血?腦屏障信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血小板源性生長因子?β（PDGF?β），招募表達(dá)Pdgfrb基因編碼的血小板源性生長因子受體?β（PDGFR?β）的周細(xì)胞，從而促進(jìn)周細(xì)胞包覆在內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè)，從而調(diào)控血?腦屏障的完整性［15］。Ando等［16］通過轉(zhuǎn)基因魚的 方法對斑馬 魚胚胎Pdgfrb基因進(jìn)行標(biāo)記，觀察到斑馬魚胚胎于受精60小時即出現(xiàn)周細(xì)胞與腦血管的交聯(lián)。與哺乳動物類似，敲除該基因可以造成周細(xì)胞損傷，此時血?腦屏障則難以發(fā)揮其“屏障”作用［17］。另外，由Foxf2基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子Foxf2同樣表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周細(xì)胞，可刺激Pdgfrb基因表達(dá)、激活轉(zhuǎn)化生長因子?β（TGF?β）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，F(xiàn)oxf2基因表達(dá)缺乏時，TGF?β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，進(jìn)而影響血?腦屏障結(jié)構(gòu)與功能的完整性，使通透性增加，血?腦屏障滲漏［12］。斑馬 魚fox2a、fox2b、pdgfrβ和notch3基因具有相似的表達(dá)譜，fox2b突變可導(dǎo)致周細(xì)胞數(shù)目減少，以及周細(xì)胞和平滑肌的分子標(biāo)記基因acta2表達(dá)下調(diào)［18］。星形膠質(zhì)細(xì)胞覆蓋于毛細(xì)血管之上，構(gòu)成神經(jīng)血管單元的最外層，對維持血?腦屏障結(jié)構(gòu)完整、發(fā)揮正常功能至關(guān)重要。其上的終足（end?feet）能夠輔助星形膠質(zhì)細(xì)胞接觸腦血管外的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的音猬因子（shh），可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin和Claudins的表達(dá)，從而維持血?腦屏障完整性和神經(jīng)系統(tǒng)的免疫平衡［19］。Lamc1基因編碼的層粘連蛋白能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)，并促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白4（AQP4）表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞層粘連蛋白缺失致AQP4表達(dá)下降，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低，血?腦屏障完整性受損［20］。然而，根據(jù)Gleiser等［21］2016年公布的研究結(jié)果，并未在免疫標(biāo)記斑馬魚AQP4后觀察到“極化”現(xiàn)象，提示與其他哺乳動物不同，斑馬魚模型星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)AQP4，斑馬魚星形膠質(zhì)細(xì)胞如何與神經(jīng)血管單元進(jìn)行信息交流和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)尚不明確，有待進(jìn)一步研究證實?；な且活惥S持血?腦屏障神經(jīng)血管單元結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞外基質(zhì)，主要由Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白和其他糖蛋白所組成，是細(xì)胞間進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要樞紐，能夠觸發(fā)細(xì)胞遷移、增殖和存活信號級聯(lián)反應(yīng)。研究顯示，整合蛋白（Integrin）可介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)驅(qū)動的調(diào)控WNT信號和TGF?β信號，敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中的Itgav基因可誘發(fā)小鼠模型的腦出血表型，提示Itgav基因?qū)S持血?腦屏障功能發(fā)揮重要作用［22］。Hübner等［23］對WNT信號缺失斑馬魚胚胎進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)WNT信號缺失斑馬魚胚胎可于發(fā)育后期發(fā)生腦出血，表明WNT信號對血?腦屏障的發(fā)育至關(guān)重要。

由此可見，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)血管單元共同維持血?腦屏障結(jié)構(gòu)完整性并維持其正常生理功能，不同組織結(jié)構(gòu)之間相互影響、相互作用。血?腦屏障以及相關(guān)神經(jīng)血管單元受多種遺傳因子的調(diào)節(jié)，其中任何基因的異常表達(dá)都會影響血管的屏障作用，在危險因素的作用下誘發(fā)腦出血。通過明確導(dǎo)致腦出血的突變基因，有望篩選出與腦出血預(yù)后相關(guān)的藥物靶點，并對遺傳學(xué)高危人群進(jìn)行一級預(yù)防，延緩發(fā)病時間，降低死亡率。

二、斑馬魚腦出血模型

1.模型構(gòu)建及其行為學(xué)分析目前主要采用基因編輯法和化學(xué)法構(gòu)建斑馬魚腦出血模型。（1）基因編輯法：通過對與血?腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性相關(guān)基因的改造，構(gòu)建腦出血模型［17］。（2）化學(xué)法：對斑馬魚胚胎進(jìn)行水浴孵育并使其吸收他汀類藥物，誘發(fā)斑馬魚幼體腦出血或增加其發(fā)生腦出血的概率，如膽固醇代謝通路抑制劑3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）［24］。對腦損傷斑馬魚的運動行為分析發(fā)現(xiàn)，其異常游動模式與腦損傷程度呈強相關(guān)，以旋轉(zhuǎn)（rotating）或繞動（circling）為主［25］。運動行為記錄顯示，腦損傷斑馬魚幼體10分鐘累計運動距離明顯短于正常斑馬魚幼體，且腦損傷程度與運動距離呈負(fù)相關(guān)，通過記錄斑馬魚運動距離、速度和游動模式等行為，可初步判斷其幼體腦損傷情況［26?27］，隨著激光共聚焦實時成像技術(shù)用于成年斑馬魚模型腦出血后神經(jīng)行為學(xué)的研究，期待構(gòu)建新型模型，加強行為學(xué)觀察分析。

2.模型優(yōu)勢與其他哺乳動物腦出血模型相比，斑馬魚腦出血模型具有以下優(yōu)勢：（1）觀察周期短。斑馬魚胚胎形成后第1天腦血管即開始同步形成，第2天通過傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡可直接觀察到斑馬魚腦出血情況［25］。（2）斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡在腦血管發(fā)育、血?腦屏障形成，以及腦出血研究方面具有獨特的優(yōu)勢。首先，胚胎階段斑 馬 魚 身 體 透 明，可 通 過Tg（flk1：EGFP；gata1：dsred）雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚實時觀察腦血管中紅色熒光標(biāo)記的紅細(xì)胞滲漏至血管外的整個過程［25］。其次，在細(xì)胞水平上，可通過激光共聚焦顯微鏡結(jié)合Tg（flk1：EGFP）、Tg（fli1a：EGFP）、Tg（fli1a：dsRed）、Tg（kdrl：mcherry）［28］等各種轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型觀察腦血管的發(fā)育過程；依據(jù)周細(xì)胞分子標(biāo)志物PDGFR?β構(gòu)建Tg（Pdgfrb：Gal4：UAS：GFP）雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，觀察其腦血管周細(xì)胞發(fā)育過程［16］。再次，可通過 分 子 水 平 的Tg（Glut1b：mCherry）和Tg（Plvap：eGFP）等轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型評價血?腦屏障的形成和成熟過程［29］。在維持血?腦屏障功能完整性方面，可以利用Tg（flk1：EGFP）、Tg（fli1a：EGFP）［28］等轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型實時評價血?腦屏障中Dextran等熒光染料滲漏程度，判斷血?腦屏障完整性。注射DAPI等染料到Tg（flk1：EGFP）等轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型可用于血?腦屏障完整性的定量研究［30］，隨著更多分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，可以對斑馬魚血?腦屏障完整性進(jìn)行定性和定量評價。（3）利用斑馬魚腦出血模型快速篩選腦出血相關(guān)化合物、抑制劑和易感基因。Yu和Li等［25］通過42℃水 浴 斑馬魚胚胎30分 鐘模擬高血壓引起的血管擴張，以篩選腦出血易感基因。（4）斑馬魚腦出血模型血?腦屏障具有保守性，其與人類血?腦屏障結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)遺傳因子之間具有高度保守性，斑馬魚血?腦屏障在結(jié)構(gòu)與分子組成上同小鼠、人類血?腦屏障基本相似，且斑馬魚內(nèi)皮細(xì)胞亦可表達(dá)claudin5b、zo?1、glut1b和plvap等血?腦屏障相關(guān)基因［10］，可為腦出血機制研究提供便利。新近研究顯示，cldn5a基因是斑馬魚的同源基因，在血?腦屏障和脊膜叢（CP）屏障中高保真表達(dá)，表明人類和斑馬魚血?腦屏障、脊膜叢屏障之間存在一定的保守性［9］，且cldn5a基因亦參與維持人類血?腦屏障的完整性。血管內(nèi)皮鈣黏著蛋白（VE?cad）對維持血?腦屏障完整性亦十分重要，可抑制斑馬魚體內(nèi)編碼VE?cad蛋白cdh5同源基因表達(dá)，誘發(fā)斑馬魚胚胎腦出血事件，提示斑馬魚腦血管發(fā)生滲漏［31］。MFSD2A是人和小鼠血?腦屏障中不可或缺的結(jié)構(gòu)，與野生型斑馬魚相比，通過基因編輯技術(shù)敲除斑馬魚mfsd2a基因后，于突變體斑馬魚體內(nèi)注射Dextran染料40分鐘后即可見其血?腦屏障出現(xiàn)明顯的熒光擴散現(xiàn)象［11］，提示其血?腦屏障受損。然而，斑馬魚與其他哺乳動物在血?腦屏障形態(tài)上存在一定差異，構(gòu)成斑馬魚血?腦屏障的星形膠質(zhì)細(xì)胞雖然發(fā)揮重要功能，但并非與哺乳動物一樣可形成明顯的“終足”樣的結(jié)構(gòu)覆蓋整個腦血管表面。

三、斑馬魚模型與人類腦出血疾病研究進(jìn)展

隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）、候選基因法、第二代測序技術(shù)（NGS）等新技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)明確部分與人類腦出血疾病的相關(guān)基因。通過基因組測序?qū)δX出血患者候選基因進(jìn)行篩選，現(xiàn)已鑒定出THSD1、FOXC1、CECR1等多個腦出血相關(guān)基因［4，6，32］。近期開展的全外顯子組測序（WES）研究顯示，顱內(nèi)動脈瘤破裂導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血患者存在THSD1基 因 突 變［33?34］，這 一 結(jié)論經(jīng)由斑馬魚 腦出血模型及腦出血模型小鼠實驗驗證，證實了THSD1基因通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞焦點粘連的機制維持血?腦 屏障功能完整性［34］，提示THSD1基因功能缺失性突變可導(dǎo)致腦出血。通過對非免疫性胎兒水腫（NIHF）研究發(fā)現(xiàn)，非免疫性胎兒水腫可導(dǎo)致THSD1基因功能失活，進(jìn)一步隨訪發(fā)現(xiàn)，大部分非免疫性胎兒水腫胎兒存在顱內(nèi)血管瘤，以及血管瘤破裂所致腦出血，再一次證明THSD1基因缺失與腦出血相關(guān)疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)［35］。靶向全基因組關(guān)聯(lián)分析和全基因組測序（WGS）結(jié)果顯示，腦小血管?。–SVD）患者的FOXC1基因組序列存在錯義突變、片段重復(fù)和缺失，并經(jīng)斑馬魚腦出血模型所驗證，注射嗎啉基（morpholino）沉默F(xiàn)OXC1基因可誘導(dǎo)斑馬魚腦出血［18］。其機制可能與抑制FOXC1基因使PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能障礙有關(guān)，繼而損害神經(jīng)嵴遷移和壁細(xì)胞的招募，導(dǎo)致血?腦屏障完整性破壞誘發(fā)腦出血。CECR1基因編碼腺苷脫氨酶2（ADA2），其功能缺失性突變與一系列血管病和炎癥表型相關(guān)，其中包括早發(fā)、復(fù)發(fā)性腦卒中和系統(tǒng)性血管病變或血管炎［36］。研究顯示，出血性卒中患者血清ADA2及ADA2特異性酶活性明顯降低，而皮膚、肝臟和大腦活檢結(jié)果提示以內(nèi)皮完整性受損、內(nèi)皮細(xì)胞活化和炎癥為特征的血管病變，表明ADA2含量和活性與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和血管病變密切相關(guān)。敲除ADA2同源物的斑馬魚可出現(xiàn)腦出血和中性粒細(xì)胞減少，而注射未發(fā)生突變的人CECR1 mRNA則可預(yù)防斑馬魚腦出血和血管炎癥。

腦出血的常見病因還包括腦海綿狀血管瘤（CCM），迄 今 為 止 已 發(fā) 現(xiàn)CCM1（KRIT1）、CCM2（MGC4607）和CCM3（PDCD10）3個基因突變與腦海綿狀血管瘤相關(guān)，3個蛋白均可通過腦海綿狀血管畸形蛋白2（CCM2）形成復(fù)合體，并調(diào)節(jié)血管新生、血?腦屏障完整性，以及氧化損傷保護(hù)等一系列血管生物學(xué)進(jìn)程［37］。斑馬魚的CCM同源基因包括ccm1、ccm2、ccm3a、ccm3b，基于斑馬魚、小鼠和人類CCM1/2/3基因功能缺失具有共同的心血管表型，如血管異常增粗或擴張、血?腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞形成與融合明顯受損、心臟異常腫大、心內(nèi)膜墊在房室管形成失敗 等 缺 陷［38］，Otten等［39］以 斑馬魚ccm2突變 體的心臟腫大表型為模型進(jìn)行小分子藥物篩選研究，意外發(fā)現(xiàn)小分子藥物IRM?3能夠明顯緩解小鼠CCM2/3出血模型因CCM2/3突變導(dǎo)致的腦出血。

四、小結(jié)與展望

綜上所述，隨著腦出血發(fā)病低齡化趨勢和死亡率不斷攀升，基于遺傳分子學(xué)角度的腦出血致病機制研究顯得愈發(fā)重要。斑馬魚腦出血模型便于觀察腦血管結(jié)構(gòu)，基因和藥物靶點相對保守，能夠進(jìn)行高通量表型篩選，為腦出血遺傳分子機制的研究提供了便利條件。盡管斑馬魚腦出血模型在腦出血基礎(chǔ)研究中已占據(jù)一席之地，但如何利用全基因組關(guān)聯(lián)分析、候選基因法、第二代測序技術(shù)建立新的轉(zhuǎn)基因斑馬魚腦出血模型，用于探索遺傳因素在腦出血發(fā)病過程中的作用，確定腦出血防治藥物靶點，并進(jìn)行藥物初步篩選和進(jìn)一步評鑒，從而盡早為患者提出有效的疾病預(yù)防策略和治療手段，將成為該領(lǐng)域的熱門研究問題，仍尚待進(jìn)一步探索。

利益沖突無