相分離影響癌癥發(fā)生發(fā)展的研究進展

顧 湘，賈世翀，葛盛芳，范先群

細胞是生物體基本的結構和功能單位，參與生物體復雜的生命活動。在真核生物中，細胞內形成了不同的區(qū)室，以確保不同的生化反應在各自區(qū)室內獨立、高效且有序地進行。細胞器利用其磷脂雙分子膜在細胞內形成相對獨立的亞細胞結構，發(fā)揮特定的功能。此外，細胞內存在許多無膜區(qū)室，如細胞質中的壓力顆粒(Stress Granules，SG)，細胞核中的核仁、斑點、Cajal小體等。這些無膜區(qū)室，也被稱為“生物分子凝聚體”。研究表明，生物分子凝聚體的組裝通過“液-液相分離”(Liquid-Liquid Phase Separation，LLPS)，通常簡稱為相分離實現[1]。

1 相分離的概念

相分離指在相對均勻的介質中，細胞內的分子因理化性質的差異自發(fā)地聚集或分離，形成相對獨立的無膜區(qū)室[2]。相分離是依賴于多價相互作用的動態(tài)過程，生物凝聚體中的分子因其之間的多價相互作用與外部溶液中的分子解離，在局部形成超過濃度閾值的高度濃縮的“相”，促使生物分子凝聚體中的分子重新排列，并與外部溶液中的分子發(fā)生交換。生物大分子之間的多價相互作用可通過蛋白質的多位點修飾，蛋白質的固有無序區(qū)域(Intrinsically Disordered Regions，IDRs)，RNA的核苷酸重復擴展等來實現[3]。

2 相分離的研究歷史

自從19世紀30年代在神經元細胞核內觀察到第一個無膜區(qū)室——核仁以來[4]，研究者們發(fā)現幾乎所有真核細胞的細胞核、細胞質和細胞膜上都存在類似的結構，并對其成分、位置和功能有了一定的認識，但是對其形成原因和物理性質長期以來知之甚少。一些早期的研究認為，這些生物分子凝聚體是不穩(wěn)定的。2005年，有研究將Cajal小體描述為“漂浮于半流質核質中的半流質球體”[5]，但一直缺乏證據證明其明確的物理性質。2009年，Brangwynne等人[6]在顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲的P顆粒形成過程時發(fā)現P顆粒并非固體顆粒，而是以“液滴”形式存在，且具備以下特點：①在游離狀態(tài)下呈球形(表面張力作用下)，附于細胞核表面時為非球形，類似于液體在固體表面的濕潤狀態(tài)；②剪切力作用下可在其他結構表現為變形、流動、裂變；③相互碰撞后融合并松弛成球形；④光漂白恢復實驗表明其內部分子可流動并與外部溶液中的分子快速交換。他們推測在細胞中存在一種方式，使細胞內的特定分子聚集，維持細胞內部結構處于一定的“秩序”中。隨后，核仁和其他生物分子凝聚體中也發(fā)現存在類似的“液滴”現象[7]。2012年，Kato等[8]分別在體外重構出了與體內生物分子凝聚體類似的蛋白質和RNA液滴，揭示了生物分子凝聚體是一種相分離現象，且可以通過體外重構相分離模擬體內生物分子凝聚體的性質和功能。

3 相分離的生理功能

相分離參與調控細胞代謝。在核苷酸代謝中，胞苷三磷酸(Cytidine Triphosphate，CTP)合成酶是嘧啶合成的關鍵酶，催化尿苷三磷酸(Uridine Triphosphate，UTP)和谷氨酰胺轉化為CTP和谷氨酸。在冷凍電鏡下觀察到，人的CTP合成酶通過相分離形成凝聚體。并且，增加底物UTP和腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)可促進其凝聚，而增加產物CTP和腺苷二磷酸(Adenosine Diphosphate，ADP)則抑制其凝聚[9]。以上研究提示代謝酶的相分離有利于促進其酶活性。此外，在脂肪酸代謝中，乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase，ACC)催化乙酰輔酶A的羧化反應參與脂肪酸合成[10]。當機體處于饑餓狀態(tài)時，ACC會和檸檬酸鹽結合形成ACC-檸檬酸鹽二聚體并組裝成具有更高酶活性的凝聚體，促進脂肪酸的合成。然而，當脂肪酸合成產物過多時，凝聚體內的二聚體則被局限于非活性構象中，抑制其酶的活性[11]。以上研究表示，在不同的環(huán)境中，相分離可通過調節(jié)酶的凝聚，激活或抑制酶的活性，從而調控細胞代謝。

相分離參與調節(jié)信號轉導。LAT-Grb2-SOS可通過相分離在膜表面形成凝聚體，延長SOS在膜上的停留時間，從而增強SOS對Ras的激活作用，調控T細胞活化[12]。突觸后致密區(qū)(Postsynaptic Density，PSD)是緊貼于突觸后膜的蛋白質密集區(qū)，它使受體靠近神經遞質釋放區(qū)域，確保突觸間信號的傳遞。Zeng等[13]通過體外重建證明了4個主要的PSD支架蛋白，PSD-95、GKAP、Shank和Homer可以在生理濃度通過相分離形成凝聚體，并且這些凝聚體可以促進肌動蛋白聚集及阻止抑制性突觸后蛋白的進入，由此推測相分離參與調控突觸信號傳導。

相分離參與調控基因表達。異染色質通過異染色質蛋白1(Heterochromatin Protein 1，HP1)壓縮染色質和聚集配體，從而介導基因沉默。研究發(fā)現，HP1通過相分離形成凝聚體，將包裝緊密的染色體封閉在凝聚體中，阻止其表達，從而使目的基因沉默[14]。此外，通過相分離形成的細胞內無膜區(qū)室核糖核蛋白(Ribonucleoprotein，RNP)可以通過調控mRNA的定位控制蛋白質翻譯的產量[15]。

相分離參與調控蛋白質穩(wěn)態(tài)。細胞核中的脅迫敏感蛋白在脅迫條件下發(fā)生錯誤折疊，由核質彌散狀態(tài)聚集至核仁中，與核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin1，NPM1)通過相分離結合，降低移動速度從而避免錯誤折疊蛋白的不可逆聚集。同時，分子伴侶Hsp70進入核仁與NPM1結合，修復錯誤折疊蛋白，使其在脅迫條件消失后重新回到核質發(fā)揮功能。然而，當脅迫時間過長或分子存在致病結構時，核仁將無法幫助錯誤折疊蛋白恢復功能[16]。以上研究提示核仁可以通過相分離，修復折疊紊亂蛋白，成為相分離蛋白質控中心。

4 相分離與癌癥

相分離參與調控細胞代謝、信號轉導、基因表達和蛋白質穩(wěn)態(tài)等多種生物體生理功能，對于維持機體內穩(wěn)態(tài)意義重大。最近，相分離與癌癥之間的關系引起了廣泛關注。基因組不穩(wěn)定性導致的細胞異常增殖分化是癌癥的重要發(fā)病機制。相分離參與了機體維持基因組穩(wěn)定的多個過程，參與了與癌基因和抑癌基因相關的多種調控，因此，相分離與基因組不穩(wěn)定性所導致的癌癥密切相關。

4.1 相分離影響DNA修復過程 在人體的細胞中，代謝活動和環(huán)境因素(如紫外線和放射線)造成不計其數的DNA損傷，DNA修復是人體防止基因組損傷和突變的必要過程。相分離參與DNA修復蛋白的凝聚過程，相分離異常導致DNA修復蛋白凝聚體的缺乏會干擾DNA修復，導致受損DNA的不斷堆積和基因組不穩(wěn)定，從而驅動癌癥的發(fā)生和發(fā)展。如DNA修復蛋白Rad52通過相分離在體內或體外凝聚，這個過程依賴于Rad52蛋白的長IDRs。當使用1,6-己二醇或通過截短其IDRs破壞Rad52的相分離時，DNA損傷的敏感性提高，提示Rad52的相分離在DNA修復中有重要意義[17]。此外，p53結合蛋白1(p53-Binding Protein 1,53BP1)凝聚體促進非同源末端連接，在DNA修復中起重要作用。研究表明，在小鼠體內，如發(fā)生相分離異常導致53BP1凝聚體缺乏，會導致基因不穩(wěn)定和輻射敏感性增加，并且與腫瘤的快速進展和預后不良有關[18]。DNA損傷時，DNA修復酶PARP1定位于損傷部位并發(fā)生自發(fā)的聚ADP核糖基化，觸發(fā)FET蛋白家族(包括FUS、EWS、TAF蛋白)相分離，聚集損傷的DNA，促使其連接修復，增加DNA修復效率。

4.2 相分離影響轉錄調控 在癌癥中，DNA轉錄調控往往受到干擾，從而加速了癌癥的進程。超級增強子是增強子集合體，比單個增強子具有更高水平的調控基因轉錄的能力。由于超級增強子能調控癌癥中的關鍵致癌基因，使其達到更高水平的轉錄量，在加速癌癥進程中起著關鍵作用。最近的研究表明，含有IDRs的轉錄因子，轉錄共激活因子和RNA聚合酶Ⅱ在超級增強子的靶基因處相分離形成生物分子凝聚體從而激活這些轉錄調控元件的表達，揭示了超級增強子通過相分離聚集轉錄調控元件[19]。

EWS和FUS蛋白能導致兒童結締組織癌的發(fā)生，包括黏液樣脂肪肉瘤和尤文肉瘤。在這些癌癥中，EWS和FUS蛋白N-末端的IDRs介導相分離并和轉錄因子的DNA結合域(如FLI1和CHOP)連接。研究表明，連接形成的融合蛋白FUS-CHOP和EWS-FLI1可以促進其轉錄活性[20]。

4.3 相分離影響癌基因和抑癌基因的表達 E3泛素連接酶斑點型鋅指結構蛋白(Speckle-typePOZ Protein，SPOP)調節(jié)多種腫瘤相關蛋白的降解，如腫瘤抑制因子PTEN、ERK磷酸酶、Hedgehog途徑轉錄因子Gli2等。SPOP是E3泛素連接酶底物的配體，定位于核斑點處。其突變引起蛋白調節(jié)途徑的失調可導致前列腺癌、子宮內膜癌等多種實體腫瘤[21]。此外，SPOP的底物死亡結構域相關蛋白(Death Domain-associated Protein，DAXX)定位于早幼粒細胞(Promyelocytic leukemia，PML)小體，參與調節(jié)轉錄，細胞信號轉導和凋亡等。DAXX可以通過下調腫瘤抑制因子的轉錄活性，如ETS1、p53和抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進腫瘤生長[22]。盡管SPOP和DAXX分別定位于兩種生物分子凝聚體核斑點和PML小體中，它們共表達時會形成新的生物分子凝聚體SPOP/DAXX小體。癌癥相關的SPOP突變會干擾相分離形成SPOP/DAXX小體，導致PML小體中的DAXX活性增長，進而加速腫瘤生長[23]。

此外，結構不穩(wěn)定的抑癌因子p53會發(fā)生錯義突變，與其同源物p63和p73形成生物分子凝聚體，導致其抑癌功能喪失，促進癌癥的發(fā)生。在高級別漿液性卵巢癌的動物模型中已證實，抑制p53凝聚體的形成，可恢復其調節(jié)靶基因抑制細胞增殖和促進細胞死亡的能力[24]。

4.4 相分離影響PML小體的形成 PML小體是通過相分離組裝的生物分子凝聚體，參與了DNA損傷反應、轉錄、細胞周期調控、凋亡等多種生理過程。同時，PML小體也與多種癌癥相關。在急性早幼粒細胞白血病中，染色體易位導致PML蛋白N-末端和維甲酸受體α(Retinoic Acid Receptor-alpha，RARα)結合，形成PML-RARα，破壞了PML小體，形成了分散的微斑點。PML微斑點缺乏轉錄共激活因子，延遲DNA修復蛋白的凝聚和ATM的激活，導致基因不穩(wěn)定，從而促進癌癥的進展[25]。

4.5 相分離影響端粒維持機制 在真核生物細胞復制過程中，端粒會不斷地縮短，導致端粒介導的細胞衰老和凋亡。在腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤細胞會通過端粒維持機制避免端?？s短實現持續(xù)復制。大多數腫瘤通過激活端粒酶的方式維持端粒，而有一部分腫瘤，如肉瘤，內分泌腫瘤，膠質母細胞瘤等則通過同源重組維持端粒，這一過程稱為替代端粒延長機制(Alternative Lengthening of Telomeres，ALT)[26]。ALT相關PML小體(ALT-associated PML Bodies，APBs)是觸發(fā)ALT的關鍵機制之一。端粒DNA的損傷誘導端粒蛋白發(fā)生SUMO化修飾，促使端粒在PML小體中聚集，通過相分離形成生物分子凝聚體APBs。APBs通過BLM和Rad52介導的DNA合成過程觸發(fā)ALT[27]。

4.6 相分離影響SG的形成 生物分子凝聚體SG也與癌癥有關。SG蛋白YB1參與調控基因轉錄和翻譯，通過調控SG蛋白G3BP1促進SG的組裝。研究表明，在腫瘤中YB1過表達與腫瘤耐藥性和不良預后有關[28]。并且在小鼠腫瘤種植模型中發(fā)現，敲除YB1或G3BP1可通過減少SG的組裝抑制腫瘤的侵襲和轉移[29]。由此推測，YB1通過促進SG的組裝加速腫瘤進展。

此外，KRAS基因介導Ras/MAPK信號通路控制細胞的增殖分化，其突變會導致許多組織細胞發(fā)生惡變。研究發(fā)現，KRAS突變的腫瘤細胞中，SG組裝明顯增加；若抑制突變細胞中的SG組裝，細胞會對外界的壓力更敏感，提示SG組裝可增加腫瘤對壓力的適應性[30]。

5 總結與展望

多價相互作用介導的相分離驅動人體內多種生物分子凝聚體的組裝，參與調控細胞代謝、信號轉導、基因表達和蛋白質穩(wěn)態(tài)等生理過程，幫助維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定。因此，相分離異常破壞機體內穩(wěn)態(tài)時，會導致疾病的發(fā)生。癌癥是與相分離密切相關的疾病之一，除了相分離異常導致的基因組不穩(wěn)定能促使癌癥的發(fā)展以外，部分相分離驅動形成的生物分子凝聚體本身在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也占有一席之地。相分離與癌癥之間關系的研究，目前主要停留于其組裝形成的生物分子凝聚體在癌癥中的作用，而缺乏相分離的動態(tài)過程在癌癥中的內在機制研究。因此，相分離與癌癥的關系仍需進一步的探索。盡管目前可以通過體外重構相分離模擬體內生物分子凝聚體的性質和功能，但是一方面由于生物分子凝聚體的液體特性和動態(tài)過程，現有的光學顯微技術難以深入觀測相分離的精細結構；另一方面體內的環(huán)境和分子調控機制十分復雜，體外模擬條件無法完全替代。因此，需要發(fā)展新的技術和不斷優(yōu)化體外相分離條件，進一步挖掘相分離的具體過程、精細結構、動態(tài)調控、起始和終止信號。此外，在相分離與癌癥的關系方面，與癌癥表型相關的相分離分子機制仍需深入探索。未來的研究方向可聚焦于相分離的理化功能，如選擇性富集分子，增加分子間相互作用概率和改變分子構象在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，以及尋找調節(jié)相分離的關鍵分子，如激酶和分子伴侶，以便深入挖掘癌癥的致病機制和調控方式，尋找癌癥治療的新靶點。