玉米農(nóng)桿菌轉化方法

司 冰

（河南省種子管理站，河南 鄭州 450046）

玉米作為世界上主要的糧食作物和工業(yè)原料之一，推動其轉基因技術研究與應用，是進行玉米功能基因組研究的有效方法，同時對確保國家糧食安全有重要意義。當前全球商業(yè)化的轉基因植物有107 種，其中，作為主流方法的農(nóng)桿菌轉化和基因槍轉化分別占到了64%和31%，而利用DNA 直接轉移法和電激法的僅有5%[1]。農(nóng)桿菌介導法在玉米遺傳轉化方面占有很大的優(yōu)勢，單拷貝數(shù)、基因沉默比較少、性價比高等。

1 根癌農(nóng)桿菌

根癌農(nóng)桿菌是生活在植物根的表面依靠由根組織滲透出來的營養(yǎng)物質生存的一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌，是一種天然的基因轉化系統(tǒng)。它以雙子葉植物為天然宿主，雙子葉植物中的遺傳轉化已經(jīng)取得了非常好的進展，但是對于玉米這樣的單子葉植物來說，遺傳轉化就沒有那么容易了，其遺傳轉化研究相對雙子葉植物落后。

根癌農(nóng)桿菌攜帶有Ti 質粒，可以誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤，而T-DNA 是根癌農(nóng)桿菌Ti 質粒上的一段DNA序列,可以轉移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中。外源基因就是整合到T-DNA 上，通過T-DNA 的轉移整合到植物基因組中。Ti 質粒因為上述優(yōu)點成為了導入外源基因的有效載體。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方面的研究已經(jīng)日臻完善，發(fā)展成了植物基因工程中不可缺少的工具。因此，農(nóng)桿菌被稱為自然界中的“天然遺傳工程師”[2]。目前，在玉米遺傳轉化中使用的農(nóng)桿菌有3 種類型，不同的類型毒性不同，應根據(jù)受體的不同選擇不同的菌株，產(chǎn)生不同的轉化效率。這3 種類型分別是章魚堿型（以LBA4404 為代表）、胭脂堿型（以C58 菌株為代表）、琥珀堿型（以EHA101 和EHA105為代表）。

2 玉米農(nóng)桿菌轉化的受體

2.1 以幼胚為受體

以前的研究多以胚性愈傷組織為受體材料，但是胚性愈傷組織只有極少數(shù)材料能穩(wěn)定高效誘導出來，其誘導和分化受品種基因型的限制，加上胚性愈傷組織培養(yǎng)條件摸索，周期比較長，無菌操作繁瑣細致等原因，嚴重制約了玉米轉基因的研究進展，因此，玉米幼胚是較有效的轉化受體。

2.2 以愈傷組織為受體

在進行遺傳改良的過程中，通過組織培養(yǎng)獲得高頻率的胚性愈傷組織是轉化進行的前提條件，尤其是利用未成熟的幼胚誘導的愈傷組織。以前的學者將玉米的愈傷組織主要分為2 種類型：Ⅰ型：黃白色、整體結實、較硬、不易分開、生長慢、易發(fā)生器官的分化；Ⅱ型：乳黃色、蓬松、粒狀、生長較快、易產(chǎn)生胚狀體。Ⅱ型是目前玉米轉化的常用受體，具有較高的轉化頻率和再生頻率。但是很多自交系不易形成Ⅱ型愈傷組織，利用Ⅰ型愈傷組織進行農(nóng)桿菌轉化是目前要克服的關鍵問題。

2.3 其他組織為受體

幼胚的供應受到季節(jié)的限制，不利于常年轉基因的進行；愈傷組織誘導操作的繁瑣也限制轉基因的發(fā)展。因此，有研究人員開始開發(fā)新的轉化受體，比如莖尖分生組織、成熟胚及莖尖分生組織誘導的胚性愈傷組織等。

3 影響農(nóng)桿菌轉化效率的因素

3.1 農(nóng)桿菌的選擇

農(nóng)桿菌是進行遺傳轉化的有效工具，農(nóng)桿菌的選擇在很大程度上決定著遺傳轉化效率的高低。選擇合適的農(nóng)桿菌進行轉化是進行轉基因的前提。

3.2 培養(yǎng)基種類的選擇

目前，農(nóng)桿菌侵染玉米的基本培養(yǎng)基主要是N6和MS 2 種，不同的自交系選擇不同的培養(yǎng)基，對每個培養(yǎng)基進行微調可以有效地改善轉化效率。

3.3 受體類型及來源

玉米遺傳轉化成功的一個關鍵因素就是受體材料，不同基因型、不同發(fā)育時期的玉米幼胚及愈傷組織對農(nóng)桿菌侵染的感受性存在著差別，它的感受態(tài)直接關系著轉化成功與否。轉化受體一般要選擇生命力旺盛、易于分化、易于成苗的材料。不同的玉米品種其幼胚生長能力不同，分化愈傷的能力不同，有的玉米品種都不能誘導出愈傷組織。

3.4 共培養(yǎng)條件

侵染效率的高低很大程度上與共培養(yǎng)有關系，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)時間的長短、培養(yǎng)溫度的高低都能影響侵染效率。酚類物質與農(nóng)桿菌Vir 基因活化誘導有關，其中，乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮作用較強，在共培養(yǎng)的過程中加入乙酰丁香酮可以有效地提高轉化效率。

4 展望

世界范圍內轉基因作物已經(jīng)擴展到四大作物（玉米、大豆、棉花和油菜）之外，為全球消費者和食品生產(chǎn)商提供了更多選擇，這些轉基因作物均已上市銷售，包括紫花苜蓿、甜菜、木瓜、南瓜、茄子、馬鈴薯和蘋果。而我國早在2009 年就給轉植酸酶基因玉米品種及抗蟲水稻品種頒發(fā)了安全證書，2019 年又擬批準為192 個植物品種目錄頒發(fā)農(nóng)業(yè)轉基因生物安全證書，其中包括2 種轉基因玉米，即大北農(nóng)生物技術有限公司的 DBN9936 和杭州瑞豐生物科技有限公司與浙江大學的雙抗12-5。轉基因技術作為一項應用型技術，在我國農(nóng)業(yè)領域取得一定技術突破，將給種業(yè)龍頭企業(yè)、種業(yè)股傳遞利好信息。但是目前對于很多優(yōu)良自交系來說，利用農(nóng)桿菌進行遺傳轉化還是比較困難的，尤其是一些當前育種中使用的常規(guī)自交系。而且我國現(xiàn)在有很多特用玉米品種，對這些特用玉米品種進行遺傳改造還有一段路程要走，需要克服這些困難找到適合這些玉米品種的方法來進行遺傳修飾。