L-半胱氨酸對(duì)葡萄交鏈孢霉腐病的抑制作用

康慧芳，喬勇進(jìn)*，劉晨霞，張 怡，孫大鵬

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.上海農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工工程技術(shù)研究中心，上海 201403）

葡萄是一種高營(yíng)養(yǎng)水果，果實(shí)富含大量的糖、有機(jī)酸、維生素、各種礦物質(zhì)以及人體所需的氨基酸等，集食療、醫(yī)用、美容和商業(yè)價(jià)值于一身[1]，深受廣大消費(fèi)者的青睞。然而葡萄是不耐貯藏的水果之一，果實(shí)皮薄、汁多、肉軟，采后極易受病原微生物侵染[2]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，交鏈孢霉腐病是最為突出的采后病害之一，其主要致病菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata），其對(duì)生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖快，嚴(yán)重影響寄主的質(zhì)膜透性、酶活性、激素平衡及其他生理代謝過(guò)程，從而造成果實(shí)大量腐爛[3-4]。

目前，已有許多研究者將L-半胱氨酸應(yīng)用于葡萄交鏈孢霉腐病的防治，例如那他霉素可以抑制葡萄采后交鏈孢菌引起的腐爛變質(zhì)[5]；二氧化硫可以抑制交鏈孢菌的孢子萌發(fā)、菌落生長(zhǎng)及其所引起的葡萄腐爛率[6]；臭氧處理可導(dǎo)致互隔交鏈孢菌菌絲的干癟萎縮和孢子凹陷褶皺，導(dǎo)致其致病力減弱[7]；芽孢桿菌發(fā)酵液產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體亦能明顯抑制鏈格孢菌的生長(zhǎng)[8]；L-谷氨酸對(duì)番茄果實(shí)的交鏈孢霉腐病也有防治作用[9]。但現(xiàn)階段仍然需要尋找更安全、更有效、更經(jīng)濟(jì)、更便捷的新型殺菌劑替代品來(lái)控制由交鏈孢霉腐病引起的采后果實(shí)爛果現(xiàn)象。

L-半胱氨酸是組成體蛋白質(zhì)的氨基酸中唯一一種含有巰基的親水性氨基酸[10]，也是一種還原劑，能夠通過(guò)改變蛋白質(zhì)分子之間和內(nèi)部的二硫鍵減弱蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)伸展開(kāi)，具有多種藥理功效[11]，包括抗氧化和抗炎作用，在生物化學(xué)、醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等行業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用[12]，國(guó)內(nèi)外需求量也逐年增長(zhǎng)。Kyung等研究表明S-甲基-L-半胱氨酸亞砜能夠有效清除蕓苔屬蔬菜中的氧自由基，具有殺菌作用[13]。Zhou Xiran等認(rèn)為L(zhǎng)-半胱氨酸是一種非競(jìng)爭(zhēng)性的有效抑制劑，能夠有效抑制黃果梨多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性，防止梨汁加工過(guò)程中的酶褐變反應(yīng)[14]。廖春麗等研究表明，L-半胱氨酸對(duì)馬鈴薯、蘋(píng)果和甘薯PPO活性抑制作用明顯，且隨著L-半胱氨酸濃度增大，酶活力降低幅度越大[15]。Hamza等研究表明L-半胱氨酸對(duì)氧化組織損傷具有保護(hù)作用，能夠提高脂質(zhì)的水平，增加酶的抗氧化活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度[16]。但關(guān)于L-半胱氨酸應(yīng)用于葡萄交鏈孢霉腐病的研究還鮮有報(bào)道。本研究旨在探討L-半胱氨酸處理對(duì)離體鏈格孢菌的抑制作用及抑菌機(jī)理，并在葡萄果實(shí)上接種驗(yàn)證，為L(zhǎng)-半胱氨酸處理在葡萄貯藏保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

葡萄鏈格孢菌來(lái)源于華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，于PDA培養(yǎng)基中4 ℃冰箱保存。

‘巨峰’葡萄購(gòu)自上海市奉賢區(qū)嘉園路87號(hào)水果店，挑選色澤、大小一致，且無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)，購(gòu)買(mǎi)當(dāng)天裝在水果泡沫箱中運(yùn)回（4.0±0.5）℃的冷庫(kù)中預(yù)冷并貯藏保存。

L-半胱氨酸、乙酸、無(wú)水乙酸鈉、領(lǐng)苯二酚、過(guò)氧化氫、愈創(chuàng)木酚、吐溫-80、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose ager，PDA）培養(yǎng)基、無(wú)水乙醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 美國(guó)安馬西亞公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 日本托米公司；CA-1480超凈工作臺(tái) 上海上凈凈化設(shè)備有限公司；D37520 Osterode高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Biofuge公司；水浴鍋 上海一恒科技有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；打漿機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化儀器有限公司；倒置顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備

將在冰箱保存的鏈格孢菌取出，于25 ℃ PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用含0.05%吐溫-80的無(wú)菌水沖洗平板洗下孢子，并用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整至濃度為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)處理

1.3.2.1 離體實(shí)驗(yàn)

將PDA經(jīng)滅菌后冷卻至45 ℃左右，加入量的L-半胱氨酸混勻，制成L-半胱氨酸質(zhì)量濃度為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 g/L和3.0 g/L的PDA培養(yǎng)基，以不加入任何藥劑的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照組。每組處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，平板凝固后，移液槍取20 μL菌懸液滴在PDA培養(yǎng)基中央，室溫條件下放置4 h后放入25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測(cè)定一組數(shù)據(jù)，直至對(duì)照組菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

1.3.2.2 活體接種實(shí)驗(yàn)

選擇外觀整齊、無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷的葡萄果實(shí)，先用自來(lái)水將果面沖洗干凈，然后用體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，接著用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液浸泡1 min，再用無(wú)菌水沖洗3 次，晾干后用無(wú)菌剪刀剪下葡萄果實(shí)（保留果梗）。無(wú)菌接種針在葡萄赤道部刺深約3 mm，滴入10 μL菌懸液，室溫（25±1）℃條件下放置4 h后，以離體菌菌落生長(zhǎng)的研究結(jié)果為依據(jù)，選取質(zhì)量濃度分別為1.6、2.0、2.4、2.8 g/L的無(wú)菌L-半胱氨酸溶液用移液槍攝入10 μL至上述針刺部位，并于室溫（25±1）℃條件下放置4 h，之后放置在25 ℃培養(yǎng)箱中貯藏。每3 d測(cè)定葡萄果實(shí)病斑直徑和病斑率，直至病原菌布滿果面，其他指標(biāo)在貯藏結(jié)束時(shí)測(cè)定。每個(gè)處理組取50 粒葡萄，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1L-半胱氨酸對(duì)離體鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用

用十字交叉法統(tǒng)計(jì)每天鏈格孢菌的菌落直徑，并計(jì)算第6天的菌落生長(zhǎng)抑制率，具體計(jì)算見(jiàn)公式（1）。

1.3.3.2 鏈格孢菌菌絲形態(tài)的觀察

分別在含不同質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基上滴20 μL濃度為1.0×106個(gè)/mL的鏈格孢菌菌懸液，以不加任何藥劑為對(duì)照處理。室溫下放置2 h待菌懸液晾干，然后放置在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用無(wú)菌刀在中央位置取2 cm×2 cm×2 cm的培養(yǎng)基小塊，制成玻片在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每一個(gè)玻片取不同的7 個(gè)視野觀察并拍照，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3.3 鏈格孢菌芽管伸長(zhǎng)抑制率的測(cè)定

按1.3.3.2節(jié)相同方法取2 cm×2 cm×2 cm的培養(yǎng)基小塊，在倒置顯微鏡下觀察并用顯微鏡上的測(cè)量尺測(cè)量每一組芽管的長(zhǎng)度并記錄。芽管伸長(zhǎng)抑制率計(jì)算見(jiàn)公式（2）。

1.3.3.4 鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制率的測(cè)定

將1.0×106個(gè)/mL鏈格孢菌菌懸液接種到L-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d后，用直徑為0.6 cm的打孔器在培養(yǎng)皿邊緣取3 個(gè)菌碟，無(wú)菌水洗下孢子并用托馬計(jì)數(shù)池進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組處理重復(fù)3 次，通過(guò)公式（3）計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

1.3.3.5 葡萄果實(shí)發(fā)病率、質(zhì)量損失率和落果率的測(cè)定

病斑直徑采用十字交叉法測(cè)定，取平均值；病斑直徑若大于0.5 mm則確定為發(fā)病，發(fā)病率計(jì)算見(jiàn)公式（4）。在貯藏前后稱(chēng)果實(shí)質(zhì)量，并按公式（5）計(jì)算果實(shí)的質(zhì)量損失率。統(tǒng)計(jì)果梗的腐爛程度，果梗發(fā)生霉變?yōu)楦癄€，未發(fā)生霉變?yōu)檎?，果梗腐爛率的計(jì)算見(jiàn)公式（6）。另外，果實(shí)在貯藏期會(huì)出現(xiàn)落果現(xiàn)象，即果梗和果實(shí)發(fā)生分離的現(xiàn)象，落果率計(jì)算見(jiàn)公式（7）。

1.3.3.6 抗性酶活力的測(cè)定

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活力測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[17]；PPO活力的測(cè)定采用鄰苯二酚比色法[17]；丙二醛含量、CAT活力、SOD活力采用試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，并用Origin 8.0軟件作圖，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著分析（方差分析），P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-半胱氨酸處理對(duì)鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)的影響

由表1可以看出，與對(duì)照組相比，各質(zhì)量濃度L-半胱氨酸處理對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，且在0～2.8 g/L范圍內(nèi)，隨著L-半胱氨酸質(zhì)量濃度的增加，對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果逐漸增強(qiáng)，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組菌絲生長(zhǎng)抑制率最大，L-半胱氨酸質(zhì)量濃度超過(guò)2.8 g/L后，其對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果減弱。另外，對(duì)照組鏈格孢菌菌絲基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，菌絲顏色較深，偏向暗褐色，且隨著L-半胱氨酸質(zhì)量濃度的增大，鏈格孢菌菌落直徑減小，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的菌餅直徑最小。培養(yǎng)第6天時(shí)，與其他各組比較，2.8 g/LL-半胱氨酸處理組菌落直徑僅為0.25 cm，抑制率最高（95.96%）。由此表明L-半胱氨酸能夠有效抑制鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理的效果最好。

表1 L-半胱氨酸對(duì)鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of L-cysteine on colony growth of Alternaria alternate

2.2 L-半胱氨酸處理對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng)的抑制作用

將鏈格孢菌菌懸液滴入含有不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察，含0.4～1.0 g/LL-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基中可以清晰觀察到鏈格孢菌孢子萌發(fā)且有芽管伸長(zhǎng)現(xiàn)象，而L-半胱氨酸質(zhì)量濃度大于1.0 g/L的PDA培養(yǎng)基中均未明顯觀測(cè)到孢子萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng)。由圖1可知，L-半胱氨酸對(duì)鏈格孢菌的孢子萌發(fā)具有顯著抑制作用，0.4、0.6、0.8 g/L和1.0 g/LL-半胱氨酸處理組的孢子萌發(fā)抑制率分別為6.73%、11.68%、21.64%和37.87%，1.0 g/LL-半胱氨酸處理組孢子萌發(fā)抑制率顯著高于其他處理組（P＜0.05），說(shuō)明高質(zhì)量濃度L-半胱氨酸對(duì)鏈格孢菌的孢子形成抑制率效果顯著。由圖2可知，與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度（0.4～1.0 g/L）的L-半胱氨酸對(duì)鏈格孢菌芽管伸長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。其中，1.0 g/L的L-半胱氨酸處理組芽管長(zhǎng)度僅為16.31 μm，抑制率高達(dá)81.30%，顯著高于其他各組（P＜0.05）。由此可得，L-半胱氨酸質(zhì)量濃度越高，對(duì)鏈格孢菌芽管伸長(zhǎng)的抑制效果越好。

圖1 L-半胱氨酸質(zhì)量濃度對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of L-cysteine on spore germination of A.alternata

圖2 L-半胱氨酸質(zhì)量濃度對(duì)鏈格孢菌芽管伸長(zhǎng)的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of L-cysteine on germ tube elongation of A.alternate

2.3 L-半胱氨酸處理對(duì)鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響

圖3 鏈格孢菌經(jīng)L-半胱氨酸處理后倒置顯微鏡觀察結(jié)果Fig.3 Inverted microscopic observation of A.alternate treated with L-cysteine

將培養(yǎng)24 h的各處理組培養(yǎng)基置于倒置顯微鏡下觀察，質(zhì)量濃度高于1.0 g/L的L-半胱氨酸處理組均未清晰觀察到鏈格孢菌菌絲的形態(tài)，而質(zhì)量濃度低于1.0 g/L的L-半胱氨酸處理組均能不同程度觀察到菌絲形態(tài)的變化。如圖3所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)L-半胱氨酸培養(yǎng)的鏈格孢菌菌絲密集程度下降，且隨著L-半胱氨酸質(zhì)量濃度的增加，菌絲密集程度下降越明顯，經(jīng)0.8、1.0 g/LL-半胱氨酸處理的鏈格孢菌菌絲表面粗糙且出現(xiàn)溝壑。說(shuō)明L-半胱氨酸處理對(duì)鏈格孢菌菌絲造成了損傷，且高質(zhì)量濃度L-半胱氨酸可以更明顯抑制鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)。

2.4 L-半胱氨酸處理對(duì)接種鏈格孢菌后葡萄病害和貯藏品質(zhì)的影響

如圖4所示，貯藏到第15天時(shí)，對(duì)照組果實(shí)表面被一層灰色菌絲覆蓋，病斑直徑顯著大于各處理組（P＜0.05），且能明顯看出病斑邊緣軟化腐爛以及果梗表面有菌絲環(huán)繞的現(xiàn)象，而2.8 g/L處理組果實(shí)感染病害的程度很小，只能看到少量的菌絲出現(xiàn)，且葡萄果實(shí)保持色澤鮮亮，果梗緊緊銜接果實(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)脫落及病害現(xiàn)象。由此說(shuō)明，高質(zhì)量濃度L-半胱氨酸處理能夠有效抑制葡萄交鏈孢霉腐病的感染。

圖4 L-半胱氨酸處理15 d后葡萄交鏈孢霉腐病的發(fā)病情況Fig.4 Morbidity of Alternaria alternata rot at 15 days after L-cysteine treatment

圖5 L-半胱氨酸對(duì)葡萄交鏈孢霉腐病病斑直徑（A）和發(fā)病率（B）的影響Fig.5 Effect of L-cysteine on lesion diameter (A) and incidence (B) of Alternaria alternata

由圖5A可知，葡萄果實(shí)病斑直徑隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速擴(kuò)展，呈逐漸上升的趨勢(shì)。接種鏈格孢菌第3天開(kāi)始，各處理組病斑直徑均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的病斑直徑最小，在第15天時(shí)僅為0.66 cm，顯著低于其他各組（P＜0.05），說(shuō)明質(zhì)量濃度為2.8 g/L的L-半胱氨酸處理的抑制效果最好。

如圖5B所示，巨峰葡萄接種鏈格孢菌后逐漸開(kāi)始染病，接種第3～6天，各L-半胱氨酸處理組的發(fā)病率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），接種第15天，對(duì)照組和1.6、2.0 g/LL-半胱氨酸處理組的發(fā)病率均達(dá)到100%，而質(zhì)量濃度為2.8 g/LL-半胱氨酸處理組僅為75%，顯著低于其他各組（P＜0.05），綜上說(shuō)明質(zhì)量濃度為2.8 g/L的L-半胱氨酸能顯著降低葡萄采后交鏈孢霉腐病的發(fā)病率。

圖6 L-半胱氨酸處理對(duì)葡萄貯藏品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of L-cysteine treatment on storage quality of grapes

由圖6可以看出，不同質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸均能顯著抑制果實(shí)品質(zhì)的下降，且2.8 g/LL-半胱氨酸處理的效果最好，該組的果梗腐爛率、落果率、質(zhì)量損失率分別僅為20.83%、4.2%、2.54%，對(duì)照組果實(shí)質(zhì)量損失率達(dá)到5.25%。

2.5 L-半胱氨酸處理對(duì)接種鏈格孢菌的葡萄果實(shí)中MDA含量的影響

圖7 L-半胱氨酸處理對(duì)葡萄果實(shí)中MDA含量的影響Fig.7 Effect of L-cysteine treatment on MDA content of grape fruit

如圖7所示，接種鏈格孢菌后，葡萄果實(shí)內(nèi)的MDA含量均呈上升趨，這是由于果實(shí)損傷導(dǎo)致。經(jīng)L-半胱氨酸處理的果實(shí)MDA含量均低于對(duì)照組，經(jīng)2.8 g/LL-半胱氨酸處理的葡萄果實(shí)在第15天MDA含量?jī)H為41.39 nmol/g，顯著低于其他處理組（P＜0.05），說(shuō)明高質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸處理能夠有效減緩果實(shí)內(nèi)部自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷。

2.6 L-半胱氨酸處理對(duì)接種鏈格孢菌的葡萄果實(shí)POD和PPO活力的影響

由圖8A可知，各組葡萄在貯藏過(guò)程中POD活力均呈上升趨勢(shì)，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組急劇上升，且總體上顯著高于其他各組（P＜0.05），在接種的第15天達(dá)到1.60 U/g，是對(duì)照組的3.56 倍，說(shuō)明2.8 g/LL-半胱氨酸能夠促使果實(shí)保持較高的POD活力。

由圖8B可知，接種鏈格孢菌后，各組葡萄果實(shí)的PPO活力在前6 d上升較快，基本為直線上升趨勢(shì)，6～9 d略微下降后又逐漸上升，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的PPO活力貯藏期間一直顯著高于其他各組（P＜0.05），在接種第15天為2.00 U/g，是對(duì)照組的1.87 倍；綜上說(shuō)明高質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸能夠更快誘導(dǎo)果實(shí)PPO活力的上升，并促使PPO活力保持在較高水平。

圖8 L-半胱氨酸處理對(duì)葡萄果實(shí)中POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig.8 Effect of L-cysteine treatment on peroxidase (A) and polyphenol oxidase (B) activities of grape fruit

2.7 L-半胱氨酸處理對(duì)接種鏈格孢菌的葡萄果實(shí)CAT和SOD活力的影響

SOD是漿果中普遍存在的抗氧化酶類(lèi)，它能將超氧陰離子歧化為過(guò)氧化氫和氧氣，從而起到清除活性氧、維持活性氧平衡、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用[18-19]。如圖9A所示，接種鏈格孢菌后，各組葡萄果實(shí)SOD活力在貯藏期間均出現(xiàn)了不同程度的升降變化，且都在第6天時(shí)達(dá)到了高峰，但2.8 g/LL-半胱氨酸處理組果實(shí)中的SOD活力始終保持最高水平，第6天時(shí)達(dá)到61.95 U/g，顯著高于其他各組（P＜0.05），貯藏期第15 天時(shí)，L-半胱氨酸處理組的SOD活力達(dá)到48.57 U/g，是對(duì)照組的1.47 倍。綜上說(shuō)明，高質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸能保持葡萄較高的SOD活力。

CAT是果實(shí)后熟衰老中的保護(hù)性酶類(lèi)，它能催化果蔬體內(nèi)積累的H2O2分解，從而減少H2O2對(duì)果蔬組織造成的傷害[20-21]。由圖9B可知，接種鏈格孢菌后，各組葡萄果實(shí)CAT活力前期（0～6 d）均呈先下降后上升的趨勢(shì)，第6天時(shí)，2.8 g/LL-半胱氨酸處理組CAT活力顯著高于其他各組（P＜0.05），達(dá)到0.89 U/g。貯藏6 d后，各組CAT活力開(kāi)始緩慢下降，其中對(duì)照組下降速度最快，而2.8 g/LL-半胱氨酸處理組下降速度相對(duì)較慢，第15天時(shí)，2.8 g/L處理組的CAT活力仍最高（0.59 U/g），是對(duì)照組的3.11 倍。由此表明，質(zhì)量濃度為2.8 g/L的L-半胱氨酸能夠有效促進(jìn)H2O2的清除效率。

圖9 L-半胱氨酸處理對(duì)葡萄果實(shí)SOD（A）和CAT（B）活力的影響Fig.9 Effect of L-cysteine treatment on superoxide dismutase (A) and catalase (B) activities of grape fruit

3 討 論

研究不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸對(duì)離體鏈格孢菌的抑制效果，結(jié)果表明L-半胱氨酸的質(zhì)量濃度越大，抑菌效果越好。令陽(yáng)等[22]研究發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸處理可以顯著延緩褐腐菌孢子的萌發(fā)，抑制菌絲體生長(zhǎng)，增加褐腐菌菌絲體胞外電導(dǎo)率和核酸物質(zhì)的釋放量，破壞褐腐菌孢子細(xì)胞膜的完整性。本實(shí)驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定了不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸對(duì)鏈格孢菌的影響，結(jié)果表明，高質(zhì)量濃度L-半胱氨酸能夠顯著抑制鏈格孢菌的菌絲生長(zhǎng)和芽管伸長(zhǎng)，延緩孢子萌發(fā)，培養(yǎng)24 h后，1.0 g/LL-半胱氨酸處理組的芽管長(zhǎng)度僅為16.31 μm，芽管伸長(zhǎng)抑制率高達(dá)81.30%，而質(zhì)量濃度高于1.0 g/L的L-半胱氨酸處理組均未能清晰觀察到鏈格孢菌孢子的萌發(fā)狀態(tài)，且培養(yǎng)到第6天，2.8 g/LL-半胱氨酸組的菌落生長(zhǎng)抑制率高達(dá)95.96%。另外，從菌絲生長(zhǎng)形態(tài)來(lái)看，1.0 g/LL-半胱氨酸處理組的鏈格孢菌菌絲密集程度很小，在顯微鏡下菌絲內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)凝集，菌絲空洞化、發(fā)黑變粗、萎縮，原生質(zhì)體滲漏，而高于1.0 g/LL-半胱氨酸處理組均未觀察到菌絲形態(tài)的變化。綜上表明，相比對(duì)照組，2.8 g/LL-半胱氨酸處理組孢子萌發(fā)的時(shí)間最晚，且培養(yǎng)到第6天，菌落直徑才僅為0.25 cm，由此可得2.8 g/LL-半胱氨酸組能夠有效抑制葡萄鏈格孢菌的離體菌的生長(zhǎng)。

SOD、CAT、POD以及與電子傳遞相關(guān)的PPO在果實(shí)體內(nèi)組成了一個(gè)有效的活性氧自由基清除系統(tǒng)，當(dāng)病原菌侵染漿果后，其能有效維持自由基在植物體內(nèi)產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，保持膜結(jié)構(gòu)的完整性，增強(qiáng)果實(shí)抵抗病害的能力[23-24]?？拙S寶[25]、張恒[26]等研究表明PPO催化多酚類(lèi)化合物氧化形成的相應(yīng)醌類(lèi)物質(zhì)能迅速殺死侵入點(diǎn)周?chē)募?xì)胞，增強(qiáng)組織的抗氧化能力，抑制果實(shí)病變腐爛。本研究表明，經(jīng)L-半胱氨酸處理的葡萄在接種鏈格孢菌后能夠保持較高的PPO活力，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的PPO活力最高，這與Jia Haifeng等[27]研究草莓果實(shí)中PPO基因過(guò)表達(dá)對(duì)真菌感染過(guò)程的影響結(jié)果相似，說(shuō)明高質(zhì)量濃度的半胱氨酸能夠有效抑制葡萄漿果貯藏期間PPO活力的降低。POD作為病原真菌抗氧化防御系統(tǒng)的主要組分，能夠清除來(lái)源于植物體產(chǎn)生的過(guò)氧自由基，增強(qiáng)植物體的抗性能力[28-29]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸處理鏈格孢菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各處理組果實(shí)在貯藏過(guò)程中POD活力上升，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的POD活力最高，說(shuō)明2.8 g/LL-半胱氨酸能夠有效促進(jìn)POD活力的上升。且2.8 g/LL-半胱氨酸處理能夠有效減緩果實(shí)內(nèi)部自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷，貯藏到第15天時(shí)，該處理組果實(shí)MDA含量顯著低于其他處理組（P＜0.05）。另外，CAT作為果實(shí)中的一種防御系統(tǒng)，能有效清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，減緩細(xì)胞衰老[30]，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸溶液處理接種鏈格孢菌后的葡萄，結(jié)果表明2.8 g/LL-半胱氨酸處理組中的CAT活力在貯藏期間均處于最高水平。果實(shí)內(nèi)SOD可減少因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的SOD活力顯著高于其他各組。綜上表明接種鏈格孢菌的果實(shí)經(jīng)2.8 g/LL-半胱氨酸溶液處理后能夠有效增強(qiáng)果實(shí)抗性，抵抗病害發(fā)生。

綜上，L-半胱氨酸處理能有效抑制離體鏈格孢菌的菌落生長(zhǎng)、芽管伸長(zhǎng)以及孢子萌發(fā)，并對(duì)鏈格孢菌菌絲造成損傷，其中對(duì)離體鏈格孢菌抑制效果最好的是質(zhì)量濃度為2.8 g/L。L-半胱氨酸處理能降低接種鏈格孢菌的葡萄的發(fā)病率和病斑直徑，降低果實(shí)MDA的積累，維持了較高的PPO和POD活力，能有效維持活性氧自由基在植物體內(nèi)產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，增強(qiáng)果實(shí)抵抗鏈格孢菌的侵染能力，其中效果最好的質(zhì)量濃度為2.8 g/L。