氧化對(duì)羊肉肌原纖維蛋白分子與理化特性的影響

張海璐，黃 翔，楊 燃，安鳳平，陸健康*，黃 群,*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350001；3.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

紅肉、家禽和魚(yú)類肌肉的主要蛋白質(zhì)是肌原纖維蛋白，約占總蛋白質(zhì)的50%～55%[1]。肉制品在加工及貯藏過(guò)程中不可避免地受到環(huán)境影響，使肌原纖維蛋白和基質(zhì)蛋白都受到氧化的影響，引起肌原纖維蛋白分子結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致肉制品的理化特性如持水性、氨基酸的改變[1-2]。與脂肪氧化反應(yīng)類似，蛋白氧化也是由自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所引起，主要由起始、傳遞、終止3 個(gè)階段組成[3-4]。加工中各類不規(guī)范操作引入的金屬離子、與帶輻射物質(zhì)接觸或加入氧化酶等因素都可能促進(jìn)蛋白氧化的發(fā)生[5-7]。目前已有大量關(guān)于蛋白氧化的研究報(bào)道，將羊肉進(jìn)行羥自由基氧化后研究其糜流變與凝膠特性，羊肉出現(xiàn)持水性下降、凝膠特性降低等現(xiàn)象，說(shuō)明蛋白氧化使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[8]。Xiong Youling L.等[9]研究了3 個(gè)不相同的氧化體系對(duì)豬肉肌原纖維蛋白分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵的影響。Sante-Lhoutellier等[10]報(bào)道了氨基酸氧化、蛋白質(zhì)聚集以及蛋白質(zhì)氧化與蛋白水解之間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的氧化會(huì)誘導(dǎo)各種氨基酸的修飾并將其轉(zhuǎn)化為羰基衍生物。本研究主要針對(duì)羊肉中肌原纖維蛋白，采用體外模擬不同程度的氧化，探究不同氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白分子與理化特性的影響，以期為羊肉及其制品的加工和貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊后腿肉（8 月齡白山羊）購(gòu)自福州市山野農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

溴酚藍(lán)、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三氯化鐵、抗壞血酸、過(guò)氧化氫 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH） 北京索萊寶科技有限公司；N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED） 上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1780紫外分光光度計(jì)、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀島津儀器（蘇州）有限公司；F-4600熒光分光光度計(jì)、LA8080氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司；3000粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；JY600E電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

新鮮羊后腿肉于0～4 ℃預(yù)冷1 h，剔除多余脂肪和結(jié)締組織，將羊肉分割成大小、厚薄均等的肉塊（1 cm×1 cm×1 cm），用流水進(jìn)行清洗，紙巾吸干表面水分后置于4 ℃冰箱中臨時(shí)保存。將處理后羊肉打漿6 次（每次30 s）后，打漿后肉糜密封并于4 ℃冷藏備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白的提取參照孫金輝等[11]的方法并稍作修改。稱取適量羊肉糜，按肉糜質(zhì)量加入4 倍體積的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），高速勻漿1 min后，冷凍離心（3 000×g、15 min，后同），取殘?jiān)僦貜?fù)提取兩次。將殘?jiān)c4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液混合，高速勻漿30 s后冷凍離心；所得殘?jiān)貜?fù)前述處理兩次，將所獲殘?jiān)c4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液混合，用蒸煮過(guò)的4 層紗布過(guò)濾；調(diào)節(jié)pH值至6.2，冷凍離心所得肌原纖維蛋白于4 ℃冷藏，一周內(nèi)用完。

1.3.3 肌原纖維蛋白氧化處理

肌原纖維蛋白氧化處理參考Li Shugang等[12]的方法并適當(dāng)修改。將提取的肌原纖維蛋白均分成6 份，置于Fenton氧化體系（1.0 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸和10 mmol/L H2O2）中，使其最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，密封避光于4 ℃恒溫水浴中分別氧化1、2、3、4、5 h，獲得不同氧化時(shí)間的氧化蛋白質(zhì)，以未經(jīng)氧化的肌原纖維蛋白為對(duì)照。將肌原纖維蛋白樣品一部分置于-80 ℃后凍干處理，用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和氨基酸含量的測(cè)定；另一部分置于4 ℃冷藏，用于測(cè)定其他指標(biāo)。

1.3.4 羰基、總巰基、二聚酪氨酸含量及表面疏水性測(cè)定

羰基含量參照李德海等[13]的2,4-二硝基苯肼反應(yīng)方法測(cè)定。

總巰基含量測(cè)定參照Wang Yu等[14]的方法，計(jì)算時(shí)摩爾消光系數(shù)為13 600 L/（mol·cm）。

二聚酪氨酸含量測(cè)定參照李玲等[15]的方法并稍作修改。肌原纖維蛋白用磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 6.0）稀釋至1 mg/mL，5 000×g冷凍離心3 min，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定上清液的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)325 nm、發(fā)射波長(zhǎng)420 nm），并以熒光強(qiáng)度表征二聚絡(luò)氨酸含量。

表面疏水性測(cè)定參照Chelh等[16]的方法，肌原纖維蛋白用磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）稀釋至5 mg/mL，取1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液0.2 mL添加到1 mL 5 mg/mL蛋白溶液中，混勻后，離心15 min（4 ℃、5 000×g），取上清液稀釋10 倍，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處的吸光度，對(duì)照組為無(wú)蛋白溶液添加的磷酸鹽緩沖液。表面疏水性使用溴酚藍(lán)結(jié)合量表示，具體按下式計(jì)算。

1.3.5 紫外吸收光譜測(cè)定

將樣品用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋至1 mg/mL后，置于UV-1780紫外分光光度計(jì)中測(cè)定紫外吸收光譜，設(shè)置掃描波長(zhǎng)范圍為240～340 nm，掃描速率為2 nm/min。

1.3.6 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定參照Cao Yungang等[17]的方法并略作修改。用磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.7）將肌原纖維蛋白稀釋至0.1 mg/mL后，置于F-4600熒光分光光度計(jì)中測(cè)定溶液的內(nèi)源熒光光譜，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)300～400 nm，電壓為600 V。

1.3.7 FTIR光譜測(cè)定

取適量?jī)龈蓸悠放c溴化鉀按質(zhì)量比1∶100充分混均，用瑪瑙研缽碾磨，制成溴化鉀壓片。置于FTIR儀中，設(shè)置波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4.0 cm-1，掃描次數(shù)為32，并使用PeakFit 4.12軟件對(duì)圖譜酰胺I帶1 600～1 700 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.3.8 Zeta電位測(cè)定

Zeta電位測(cè)定參照Cai Luyun等[18]的方法并略作修改。肌原纖維蛋白溶于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.7）中得到質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL的溶液，用0.22 μm的醋酸膜（水系）進(jìn)行過(guò)濾，采用Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀測(cè)定樣品的Zeta電位，使用35 mW固態(tài)激光器（λ＝660 nm）在25 ℃下測(cè)定，并將蒸餾水作為溶劑，每組樣品平行測(cè)定5 次。

1.3.9 粒徑測(cè)定

粒徑測(cè)定參照Feng Meiqin等[19]的方法利用粒度儀進(jìn)行測(cè)定。使用蒸餾水作為分散劑，所有測(cè)定設(shè)5 次平行，折射率為1.46，吸收系數(shù)為0.01，并且顆粒為非球形。D（v, 0.1）、D（v, 0.5）、D（v, 0.9）分別為10%、50%、90%的顆粒小于該尺寸的顆粒尺寸。

1.3.10 蛋白組成測(cè)定

采用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白組成分析，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，分別取肌原纖維蛋白10 μg，放入4×上樣緩沖液，沸水浴5 min；先80 V恒壓使溴酚藍(lán)移動(dòng)至濃縮膠與分離膠分界處，再換電壓至120 V，恒壓至溴酚藍(lán)移動(dòng)至膠底。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)G-250染色、掃描，掃描模式為256灰階透視掃描，分辨率為200 dpi。

1.3.11 氨基酸含量測(cè)定

取0.5 g樣品于水解管中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)50% HCl溶液，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱110 ℃水解22～24 h。取出冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中定容。從比色管中取1 mL溶液，85 ℃水浴吹干，加蒸餾水1 mL，氮?dú)獯蹈伞＜尤?0 mL 0.02 mol/L HCl溶液，搖勻，取500 μL加入250 μL 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈、250 μL 1 mol/L三乙胺乙腈，衍生1 h后，加入2 mL正己烷，振蕩、靜置分層。取下層液過(guò)0.45 μm有機(jī)膜后用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。通過(guò)DPS 7.55軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響

圖1 氧化時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of oxidation time on carbonyl group content

羰基含量是廣為使用的衡量蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)，蛋白質(zhì)骨架側(cè)鏈帶有的部分氨基酸在氧化時(shí)易被轉(zhuǎn)化成羰基基團(tuán)[20]。由圖1可知，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羰基含量顯著增加（P＜0.05），氧化5 h的肌原纖維蛋白羰基含量比對(duì)照組增加了10.03 倍。這與李學(xué)鵬等[21]研究的經(jīng)羥自由基不同氧化時(shí)間處理的六線魚(yú)肌原纖維蛋白羰基含量的結(jié)果一致。

2.2 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

巰基在蛋白質(zhì)中有兩種存在形式：一種存在于蛋白質(zhì)表面；另一種是包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，總巰基包括以上兩種形式[22]。由圖2可知，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，總巰基含量顯著降低（P＜0.05），并在5 h時(shí)達(dá)到5.09 μmol/g，說(shuō)明羊肉的肌原纖維蛋白的氧化程度隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)。有報(bào)道認(rèn)為總巰基含量的減少代表二硫鍵的生成[23]。

圖2 氧化時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig.2 Effect of oxidation time on total sulfhydryl group content

2.3 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響

圖3 氧化時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.3 Effect of oxidation time on tyrosine dimer content

二聚酪氨酸含量也是衡量蛋白質(zhì)是否發(fā)生氧化的指標(biāo)，主要在于氧化的發(fā)生使酪氨酸殘基發(fā)生不同程度的聚合，從而形成二聚酪氨酸[15]。由圖3可知，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，二聚酪氨酸含量呈上升趨勢(shì)；與對(duì)照組相比，氧化樣品的二聚酪氨酸含量顯著增加（P＜0.05），而2、3 h處理組之間聚酪氨酸含量差異不顯著（P＞0.05）；4 h后繼續(xù)上升。蛋白氧化后二聚酪氨酸含量的增加也可能蛋白氧化后通過(guò)部分共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的作用發(fā)生了聚集[24]。

2.4 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖4 氧化時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.4 Effect of oxidation time on protein surface hydrophobicity

蛋白質(zhì)表面的疏水性結(jié)構(gòu)對(duì)其功能性質(zhì)存在較大作用，一般通過(guò)蛋白與溴酚藍(lán)的結(jié)合量判斷其在氧化過(guò)程中的變性程度[21,25]。由圖4可知，對(duì)照組溴酚藍(lán)的結(jié)合量為82.00 μg，氧化時(shí)間為1、2、3、4 h和5 h時(shí)，結(jié)合量分別為84.08、86.38、88.14、93.58 μg和101.22 μg；隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，溴酚藍(lán)的結(jié)合量呈顯著增加趨勢(shì)（P＜0.05），說(shuō)明氧化使肌原纖維蛋白的表面疏水性顯著增強(qiáng)。這可能是由于氧化改變部分疏水性氨基酸結(jié)構(gòu)，使更多疏水性基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)表面，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)與溴酚藍(lán)的結(jié)合，使得表面疏水性呈增加趨勢(shì)[25-26]。

2.5 氧化對(duì)羊肉肌原纖維蛋白紫外吸收光譜的影響

圖5 氧化時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白紫外吸收光譜的影響Fig.5 Effect of oxidation time on ultraviolet and visible absorption spectra of myofibrillar protein

蛋白質(zhì)中含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，能夠引起紫外光的吸收，因此紫外吸收光譜常用于反映蛋白質(zhì)在氧化過(guò)程中的結(jié)構(gòu)[27]。由圖5可知，經(jīng)不同時(shí)間氧化后的肌原纖維蛋白的紫外吸收光譜相似，均在280 nm波長(zhǎng)左右出現(xiàn)峰的拐點(diǎn)，說(shuō)明氧化不會(huì)改變肌原纖維蛋白整體圖譜趨勢(shì)。但隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，峰位出現(xiàn)輕微藍(lán)移，可以表明在氧化體系下，不同氧化時(shí)間使肌原纖維蛋白質(zhì)中的部分氨基酸基團(tuán)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度改變，并且從而使吸收的紫外光譜產(chǎn)生差異，并對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.6 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

圖6 氧化時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of oxidation time on endogenous fluorescence intensity of myofibrillar protein

內(nèi)源熒光光譜常用來(lái)反映蛋白質(zhì)構(gòu)象。如圖6所示，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且發(fā)生輕微藍(lán)移；氧化5 h時(shí)熒光強(qiáng)度最低，氧化2、3 h時(shí)的熒光強(qiáng)度差異較小。這可能是氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)部發(fā)生能量的轉(zhuǎn)移，部分結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生改變；隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，部分氨基酸熒光被猝滅，從而導(dǎo)致肌原纖維蛋白的熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，這與Cao Yungang等[28]發(fā)現(xiàn)氧化處理后肌原纖維蛋白熒光強(qiáng)度下降的結(jié)論一致。

2.7 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白粒徑的影響

表1 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白粒徑的影響Table 1 Hffect of oxidation time on protein particle size of myofibrillar protein

粒徑反映可溶性蛋白的粒度分布和氧化肌原纖維蛋白的聚集情況[29]。由表1可知，D（v, 0.1）、D（v, 0.5）隨著氧化的前4 h呈上升趨勢(shì)，但5 h時(shí)下降；隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，D（v, 0.9）呈顯著增加趨勢(shì)（P＜0.05）。這可能是較高氧化程度可以促進(jìn)不可溶性組分形成，導(dǎo)致蛋白分子聚集，使蛋白質(zhì)粒徑增大，而蛋白粒徑增大會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)持水性降低、蒸煮損失增加等功能特性劣變[30]。Bao Yulong等[31]在豬肉肌原纖維蛋氧化的研究中也發(fā)現(xiàn)蛋白聚集。

2.8 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白Zeta電位的影響

圖7 氧化時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白Zeta電位的影響Fig.7 Effect of oxidation time on protein Zeta potential of myofibrillar protein

Zeta電位指膠態(tài)分散體中的電動(dòng)勢(shì)，絕對(duì)值高意味著肌原纖維蛋白具有更好的穩(wěn)定性[32]。由圖7可知，Zeta電位絕對(duì)值隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），表明靜電相互作用隨著氧化程度的增加而減弱；對(duì)照組Zeta電位絕對(duì)值為20.53，是氧化5 h樣品的3.4 倍。隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，Zeta電位絕對(duì)值降低，蛋白溶液趨向凝聚狀態(tài)，相互之間的吸引力大于排斥力，肌原纖維蛋白之間的分散狀態(tài)被破壞而產(chǎn)生聚集，導(dǎo)致肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性降低[18]。

2.9 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

一般認(rèn)為研究蛋白質(zhì)的FTIR圖是分析蛋白氧化過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律的有效手段，羊肉肌原纖維蛋白在紅外區(qū)有明顯的特征光譜吸收帶，在1 600～1 700 cm-1范圍的酰胺I帶主要以α-螺旋、β-折疊等空間結(jié)構(gòu)相互作用為主，在不同外界因素影響下，蛋白質(zhì)酰胺I帶對(duì)肽鏈結(jié)構(gòu)變化的反映十分準(zhǔn)確、靈敏[33-34]。

圖8 氧化對(duì)肌原纖維蛋白FTIR圖譜（A）和二級(jí)結(jié)構(gòu)（B）的影響Fig.8 Effect of oxidation time on protein FTIR (A) and secondary structure (B) of myofibrillar protein

由圖8A可知，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉肌原纖維蛋白FTIR圖譜趨勢(shì)相似。由圖8B可知，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，蛋白α-螺旋相對(duì)含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量變化不大，β-折疊相對(duì)含量呈降低趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量則先降低后增加。結(jié)果表明氧化過(guò)程中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)變，氧化使得羊肉肌原纖維蛋白的螺旋、折疊結(jié)構(gòu)之間相互轉(zhuǎn)化，且是有序向無(wú)序的轉(zhuǎn)變。Sun Weizheng等[30]采用FTIR研究氧化后豬肉肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)隨著氧化的發(fā)生，肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.10 肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析

圖9 不同氧化時(shí)間的肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig.9 SDS-PAGE of myofibrillar protein at different oxidation times

由圖9可知，肌原纖維蛋白氧化后結(jié)構(gòu)上的聚集變化，通過(guò)氧化后的羊肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析可知，肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖中依次出現(xiàn)分子質(zhì)量由大到小的肌球蛋白重鏈、α-肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、肌鈣蛋白。蛋白質(zhì)分子發(fā)生降解主要表現(xiàn)為分子質(zhì)量較高處的條帶出現(xiàn)模糊、弱化和擴(kuò)展，較低分子質(zhì)量區(qū)域則呈現(xiàn)出新的條帶或條帶顏色加深[35-36]。

隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，肌球蛋白重聯(lián)處條帶有輕微擴(kuò)散，這表明氧化可能形成蛋白聚集體，由此可假設(shè)，氧化使羊肉中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)改變，可能是蛋白分子的共價(jià)交聯(lián)，如通過(guò)二硫鍵、二酪氨酸等形成交聯(lián)，或分子間通過(guò)碳-碳共價(jià)交聯(lián)等，導(dǎo)致氧化后肌原纖維蛋白產(chǎn)生了分子質(zhì)量較大的聚集體。另外，在100 kDa處條帶逐漸加深，35～40 kDa處條帶呈現(xiàn)擴(kuò)展現(xiàn)象，說(shuō)明氧化對(duì)肌原纖維蛋白的不同部分有相同作用。Xia Minquan等[37]對(duì)不同氧化程度的豬肉纖維蛋白的SDS-PAGE分析表明，豬肌原纖維蛋白經(jīng)不同處理后，低水平的氧化出現(xiàn)肌原纖維蛋白聚集體[37]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似。

2.11 氧化時(shí)間對(duì)羊肉肌原纖維蛋白氨基酸含量的影響

表2 氧化時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白氨基酸含量的影響Table 2 Effect of oxidation time on amino acids contents of myofibrillar protein

蛋白氧化造成側(cè)鏈氨基酸發(fā)生不同程度氧化，從而使氨基酸的種類、比例改變。如表2所示，隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，胱氨酸含量顯著增加（P＜0.05），其他氨基酸含量呈下降趨勢(shì)，氨基酸總量也逐漸下降，不同氨基酸對(duì)氧化時(shí)間的響應(yīng)也不盡相同，這與李銀等[38]的研究結(jié)果吻合。氨基酸總量減少是由于隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)側(cè)鏈的脂肪族氨基酸被氧化形成氫過(guò)氧化物、羰基衍生物，芳香族氨基酸殘基的芳香環(huán)易被氧化，如酪氨酸易被氧化成二酪氨酸；含硫氨基酸如半胱氨酸和蛋氨酸被氧化為二硫化合物、蛋氨酸亞砜化合物。

與對(duì)照組相比，氧化5 h時(shí)天冬氨酸（Asp）、酪氨酸（Tyr）和蛋氨酸（Met）含量顯著降低（P＜0.05），谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），除胱氨酸外的其他氨基酸含量在氧化3 h后顯著降低（P＜0.05）。胱氨酸含量的增加可能是由于兩分子半胱氨酸經(jīng)氧化后生成胱氨酸。酪氨酸易被氧化成二聚酪氨酸而使酪氨酸含量下降、二聚酪氨酸含量上升，這與二聚酪氨酸含量結(jié)果相一致。

3 結(jié) 論

隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉肌原纖維蛋白的羰基含量顯著增加、總巰基含量顯著降低，表明蛋白質(zhì)氧化程度逐漸增加。隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肉肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量、表面疏水性呈顯著上升趨勢(shì)，內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低并出現(xiàn)輕微藍(lán)移。在氧化過(guò)程中，肌原纖維蛋白的粒徑分布向粒徑大的方向偏移，Zeta電位的絕對(duì)值呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。紅外光譜顯示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，α-螺旋相對(duì)含量先增加后降低，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量先降低后增加，β-折疊相對(duì)含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量無(wú)明顯變化。SDS-PAGE結(jié)果表明，氧化引起蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)現(xiàn)象?？偘被岷砍氏陆第厔?shì)，胱氨酸含量隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著上升，其余氨基酸含量呈降低趨勢(shì)，但不同氨基酸對(duì)氧化時(shí)間的響應(yīng)不同。因此，氧化能誘導(dǎo)羊肉肌原纖維蛋白的分子與理化特性發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)羊肉及其制品品質(zhì)產(chǎn)生不良影響，研究結(jié)果可為調(diào)控羊肉品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。