封閉群比格犬微衛(wèi)星的篩選及初步應(yīng)用?

蔣 輝 李銀銀 李長龍 郭 萌 李方正 王冬冬 杜小燕 陳振文

(1.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部,北京 100069)(2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京 100069)(3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,青島 266109)

比格犬(Beagle)又稱米格魯獵犬或小獵兔犬,原產(chǎn)英國,是獵犬中較小的一種,1880年傳入美國[1],是國際通用的品種犬之一。它具有體型小、性格溫順、反應(yīng)均一、重復(fù)性好、大腦發(fā)達(dá)和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),非常適合用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究,是L想的實(shí)驗(yàn)動物,也是國際公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)用犬。比格犬在急性毒性試驗(yàn)等藥物非臨床研究中的應(yīng)用十分廣泛,而使用比格犬復(fù)制口腔、泌尿系統(tǒng)疾病的動物模型也有報(bào)道[2-3]。此外,比格犬還是用于遺傳學(xué)、微生物學(xué)和生物學(xué)等多個研究領(lǐng)域。2015年,全國比格犬年用量為1.96萬只,占全國實(shí)驗(yàn)犬用量的80%[4]。據(jù)專家估計(jì),2018年我國比格犬的用量已達(dá)到10萬余只。雖然比格犬具有對實(shí)驗(yàn)反應(yīng)均一性、重復(fù)性和可比性良好等特點(diǎn),但由于我國早在八十年代就正式引進(jìn)比格犬,經(jīng)過近30年的繁殖已基本形成適應(yīng)與國內(nèi)飼養(yǎng)環(huán)境的封閉群,受種群、飼養(yǎng)環(huán)境等對多方面因素的影響,其遺傳信息和生物學(xué)特性相比于國外種群也發(fā)生了一定程度的變化。面對多地域、多學(xué)科、大數(shù)量的比格犬市場需求,為了保證比格犬的質(zhì)量,建立比格犬遺傳質(zhì)量檢測方法,進(jìn)而建立其遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已成為比格犬生產(chǎn)質(zhì)量保障體系的當(dāng)務(wù)之急。

微衛(wèi)星(microsatellite)又稱為短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeat,STR),是指由 1～6個堿基組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列,它大量分布于絕大多數(shù)真核生物基因組中 Hearne等[5]和Li等[6]。該序列由核心序列如(CT)n、(TAT)n等[7]和相對保守的側(cè)翼序列組成。根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增結(jié)果能夠反映出不同品系或不同個體的實(shí)驗(yàn)動物的核心序列重復(fù)個數(shù)的差異,即等位基因的不同。微衛(wèi)星DNA的這種特殊結(jié)構(gòu)使其具有多態(tài)性、共顯性等特點(diǎn),可作為分子標(biāo)記應(yīng)用于多種動物遺傳多樣性研究[8-9]、遺傳質(zhì)量控制中[10],其檢測效果優(yōu)于采用生化標(biāo)記檢測法的國家實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14927.1—2008[11]。目前,已有許多科技工作者嘗試使用微衛(wèi)星作為多種實(shí)驗(yàn)動物、實(shí)驗(yàn)用動物選擇遺傳檢測的分子標(biāo)記。我國有關(guān)比格犬的微衛(wèi)星方面的研究相對較少,孫兆增等[12]用24個微衛(wèi)星位點(diǎn)引物在12只比格犬中的研究發(fā)現(xiàn)有7對引物擴(kuò)增結(jié)果具有較好的多態(tài)性和重復(fù)性。閆志峰等[13]用16個微衛(wèi)星座位共檢測到175個等位基因,平均為10.875個,平均多態(tài)信息含量為 0.6768～0.8743,群體雜合度為 0.7505～0.8807。國際動物遺傳學(xué)會(International Society of Animal Genetics,ISAG)在2001—2002年首次驗(yàn)證不同微衛(wèi)星 DNA標(biāo)記在犬親權(quán)鑒定中的有效性及可靠性,并推薦22個位點(diǎn)供不同實(shí)驗(yàn)室參考使用[14]。這些研究為我們選取代表性微衛(wèi)星位點(diǎn)提供了參考。我們選用這些位點(diǎn)以及文獻(xiàn)中其他犬種的微衛(wèi)星位點(diǎn)120個作為候選位點(diǎn)[12-17],進(jìn)行 PCR擴(kuò)增條件的篩選,并在小比格犬群體中進(jìn)行了初步的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

小型比格犬樣本30個,非同窩,性別不限。中型和大型比格犬樣本各6個。所有樣本均隨機(jī)選取自青島博隆實(shí)驗(yàn)動物有限公司的群體。靜脈抽取血液樣本5 m L于抗凝采血管中,保存于4℃冰箱備用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)動物倫L委員會審查(批準(zhǔn)號AEEI-2019-022)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 比格犬血液樣本基因組DNA的提取與檢測:使用血液基因組 DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司),按照說明書進(jìn)行比格犬血液樣本基因組DNA的提取。

1.2.2 比格犬的微衛(wèi)星位點(diǎn)檢索與選擇:本研究從已發(fā)表的文獻(xiàn)中篩選犬微衛(wèi)星位點(diǎn),根據(jù)國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5,7-11],選取120個犬微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),包括23個已知比格犬的微衛(wèi)星位點(diǎn)和用于其他多種犬遺傳檢測的微衛(wèi)星位點(diǎn)97個。

1.2.3 普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的初篩:由文獻(xiàn)中獲取微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR引物序列,退火溫度、擴(kuò)增效果不好時進(jìn)行退火溫度的梯度優(yōu)化。選取小型、中型和大型比格犬各6只犬的基因組DNA進(jìn)行混合,制備6個DNA池,每個DNA池中包含3種型體的樣本各一個。PCR采用20μL反應(yīng)體系,其中50～100 ng/μL基因組 DNA池樣品2μL,上、下游引物(10μmol/μL)各 1μL,10×PCR buffer 2μL,dNTP Mg2+plus(100μmol/L)4μL,Taq酶(5 U/μL)0.2μL,補(bǔ)充 9.8μL的雙蒸水(ddH2O)。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 m in;94℃變性45 s,退火1 min(120個位點(diǎn)53～60℃不同溫度,溫度具體參考于文獻(xiàn)),72℃延伸1 m in;循環(huán)35次;72℃繼續(xù)延伸10 min;擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳初步檢測PCR產(chǎn)物,凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和分析。篩選能夠成功擴(kuò)增的位點(diǎn),無非特異性的雜帶,產(chǎn)物條帶較為集中,位點(diǎn)來源較均勻分布于犬39對染色體上。

1.2.4 熒光引物擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行STR掃描:根據(jù)普通引物篩選,對有陽性擴(kuò)增的73個微衛(wèi)星位點(diǎn)重新合成熒光標(biāo)記引物(上海生工有限公司合成),分別于上游引物 5′端標(biāo)記為 FAM、HEX、TAMRA。73個微衛(wèi)星位點(diǎn)引物及熒光標(biāo)記、退火溫度等信息見表1。

表1 73個比格犬微衛(wèi)星位點(diǎn)名稱、熒光標(biāo)記、染色體位置及退火溫度Table 1 Fluorescent marked primers,names,location and annealing temperature of 73 microsatellite loci of Beagle dogs

FH2752 FAM 10 6 58 VWFX TAMRA11 - 58 FH3972 HEX11 7 54 FH3591 FAM 11 12 56 PEZ4 TAMRA12 - 58 FHC2010 HEX12 - 58 FH2532 FAM 12 37 58 REN286L19 TAMRA13 29 58 REN239K24 HEX13 3 55 FH2895 FAM13 3 58 FH2885 TAMRA14 9 55 REN208M 20 FAM 14 12 58 REN73F08 TAMRA15 10 55 REN286P03 FAM 15 13 58 REN164B05 TAMRA16 11 55 FH2050 FAM16 30 58 FH2626 TAMRA17 23 56 FH2263 FAM17 9 54 C13.758 FAM18 13 55 FH2060 FAM19 14 58 C14.866 FAM 20 14 55 REN144M 10 FAM 21 15 58 REN85N14 FAM 22 16 58 CPH17 FAM 23 17 58 C17.402 FAM 24 17 58 REN181K04 FAM 25 23 58 FH3083 FAM 26 24 55 C27.436 FAM 27 27 55 FH3082 FAM 28 29 55 FH3632 FAM 29 30 57 FH3060 FAM 30 34 55 REN112C08 FAM 31 35 55 REN106I07 FAM 32 36 55 FH2708 FAM 33 37 55 PEZ3 TAMRA34 19 57.8 PEZ1 HEX34 7 57.8 FH2611 FAM34 - 58.2 FH2132 TAMRA35 2 56.1 PEZ8 HEX35 17 57.8 PEZ15 FAM35 16 57.8 PEZ5 FAM 36 - 57.8 FH2010 FAM 37 24 58.2 FH2054 FAM 38 12 58.2 FH2079 FAM39 - 56.1

用熒光引物對小型比格犬的30個樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系等條件同普通引物實(shí)驗(yàn)過程。然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步檢測熒光引物PCR產(chǎn)物,合格后送天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行STR掃描。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法:掃描結(jié)果由Gene Marker V2.2.0軟件分析30個樣本在73個比格犬微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增片斷大小。每個位點(diǎn)的等位基因根據(jù)擴(kuò)增片斷大小從大到小順序排列記錄為 a、b、c、d、e等,每個樣本的基因型即可記錄為aa、ab、ac、ad等形式。

2 結(jié)果

2.1 比格犬血液基因組DNA的提取

經(jīng)血液基因組DNA提取試劑盒提取比格犬血液樣本基因組DNA,經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測得濃度,所有樣品的A260/A280值均在 1.8～2.0。將 DNA原液稀釋成50～100 ng/μL備用。經(jīng) 0.8%瓊脂糖電泳檢測顯示完整性良好。核酸蛋白分析儀檢測典型的電泳圖如圖1所示。結(jié)果表明,基因組DNA比較完整,可用于下一步PCR分析。

圖1 比格犬基因組DNA 0.8%瓊脂糖電泳結(jié)果注:M為50 bp marker,1～10:為動物編號Fig.1 The results of 0.8% electrophoresis of genome DNA from Beagle dogsNote:M:50 bp marker,1-10:number of animals

2.2 比格犬的微衛(wèi)星位點(diǎn)檢索與選擇

通過檢索相關(guān)文獻(xiàn),查找到候選的120個犬微衛(wèi)星位點(diǎn),使用來自大、中、小三個比格犬群體的DNA樣本池進(jìn)行普通PCR引物擴(kuò)增,經(jīng)電泳檢測其擴(kuò)增情況及在3個群體中多態(tài)性狀況。結(jié)果在120個犬微衛(wèi)星位點(diǎn)有101個能夠成功擴(kuò)增,獲得陽性條帶。其中部分微衛(wèi)星位點(diǎn)電泳圖如2所示。選擇在3個群體中多態(tài)性高的(即電泳檢測條帶較粗,或者有明顯多條主要條帶),并且在犬39對染色體上較均勻覆蓋的位點(diǎn)(保證每對染色體上含有兩個位點(diǎn)),最終獲得73個微衛(wèi)星位點(diǎn),進(jìn)行后續(xù)熒光引物標(biāo)記分組。

2.3 小型比格犬73個微衛(wèi)星位點(diǎn)STR掃描分析

運(yùn)用所選的73個微衛(wèi)星位點(diǎn)對小型比格犬30個樣本進(jìn)行STR掃描分析和基因分型,統(tǒng)計(jì)分析30個樣本中73個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)和片段大小范圍,有64個微衛(wèi)星位點(diǎn)成功分型,檢出率較高,結(jié)果詳見表2,說明這些位點(diǎn)可以用于比格犬群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。

圖2 10個微衛(wèi)星位點(diǎn)在比格犬DNA池中擴(kuò)增PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果注:M為50 bp marker,1～10為位點(diǎn)編號Fig.2 The results of electrophoresis of 10 microsatellite loci from Beagle dogsNote:M:50 bp marker,1-10:the number of loci

表2 64個比格犬微衛(wèi)星位點(diǎn)名稱、檢測到的等位基因數(shù)及等位基因范圍Table 2 Numbers of alleles and allele size range of 64 microsatellite loci of Beagle dogs

REN73F08 6 197～205 C09.173 5 103～111 FH2313 5 181～189 PEZ2 5 111～135 REN314H10 5 168～174 FH2752 5 204～220 FH2895 5 354～371 REN208M 20 5 316～331 FH2062 4 131～140 FH2890 4 191～198 FH2326 4 258～272 REN106I06 4 241～256 REN107H05 4 155～181 FH2885 4 199～212 REN164B05 4 224～229 FH2060 4 218～223 FH2708 4 200～207 C10.781 3 180～188 FH3393 3 98～100 REN285I23 3 236～240 FHC2010 3 233～245 FH2532 3 83～107 FH2050 3 248～258 REN181K04 3 217～232 REN112C08 3 219～224 FH2783 2 192～196 REN286L19 2 218～220 FH3060 2 193～196 FH3069 1 160 PEZ4 1 133 FH3632 1 230

2.4 小型比格犬群體遺傳變異分析

我們進(jìn)一步選取等位基因數(shù)目≥4的比格犬微衛(wèi)星位點(diǎn),共49個。對小型比格犬群體遺傳結(jié)構(gòu)特征分析(表3)結(jié)果表明,49個微衛(wèi)星位點(diǎn)在小型比格犬中共檢測到413個等位基因,平均每個微衛(wèi)星位點(diǎn)有8.4個。其中等位基因數(shù)最多的是FH 3083位點(diǎn),有25個等位基因,最少的是FH2062、FH2890、FH2326、REN106I06、FH2885、REN164B05、FH 2060和FH2708,這8個微衛(wèi)星位點(diǎn)都只有4個等位基因型。檢測出不同位點(diǎn)的擴(kuò)增片段大小范圍不同,表明這些位點(diǎn)在該群體中的多態(tài)性具有差異。

群體的雜合度由不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率計(jì)算所得,不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的群體雜合度各不相同。在FH3083該微衛(wèi)星位點(diǎn)上檢測的平均雜合度顯示為最高(0.9367),而在FH 2062位點(diǎn)檢測到的平均雜合度顯示為最低(0.3361)。最終所選的49個微衛(wèi)星位點(diǎn)的整體平均雜合度達(dá)到0.7375。

表3 小型比格犬封閉群49個微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因數(shù)、平均雜合度和多態(tài)性信息含量Table 3 Number of allele,average heterozygosity and polymorphism in formation content(PIC)of 49 microsatellite loci in miniatu re Beagle dogs

小型比格犬群體中在所選的49個微衛(wèi)星位點(diǎn)中,高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC>0.5)有46個,中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.25

利用Popgen 1.32,計(jì)算小型比格犬49個微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的P值。結(jié)果有12個微衛(wèi)星位點(diǎn)非常顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡(P<0.01),其中3個微衛(wèi)星位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡(0.010.05),各微衛(wèi)星位點(diǎn)的P值見表3中所示。這提示我們下一步還需要對這些位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化,以便建立適用于比格犬遺傳質(zhì)量控制的微衛(wèi)星位點(diǎn)體系。

3 討論

微衛(wèi)星DNA作為第二代分子遺傳標(biāo)記,其多態(tài)性高是其突出的特點(diǎn),在基因組范圍分布廣,能夠穩(wěn)定遺傳,在分析生物群體內(nèi)的遺傳變異和不同群體間遺傳關(guān)系及個體的鑒別研究等方面均存在重要的意義和影響。微衛(wèi)星位點(diǎn)的選取就成為比格犬遺傳質(zhì)量檢測的關(guān)鍵。孫兆曾等[12]采用12只比格犬選取了13個位點(diǎn)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn) VWFX、SPY、PEZ6、CHRl.X、PEZ8、PEZl和 FHC2132擴(kuò)增重復(fù)性和多態(tài)性都較好。本次實(shí)驗(yàn)也對以上7個位點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)測試,發(fā) 現(xiàn) 只 有 VWFX、SPY、PEZ8、PEZl和FHC2132。而 PEZ6、CHRl.X則因等位基因數(shù)小于4而未被選擇。入選的5個位點(diǎn)的平均雜合度0.78,說明群體雜合性較好。閆志峰等(2004)[13]對三地120只比格犬選取40位點(diǎn)進(jìn)行篩選,最終選取16個位點(diǎn)進(jìn)行分析,本次實(shí)驗(yàn)也對上述位點(diǎn)進(jìn)行了小型比格犬群體中的檢測分析,結(jié)果顯示在本次實(shí)驗(yàn)中僅有9個位點(diǎn)(9/16)獲得比較好的結(jié)果,其中一個位點(diǎn)因等位基因數(shù)過少為入選進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。通過對比選擇的位點(diǎn),本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動物群體的不同,同一位點(diǎn)的多態(tài)性上存在較大的變化。因此,如何選擇位點(diǎn)代表比格犬甚至某種實(shí)驗(yàn)動物來進(jìn)行遺傳檢測應(yīng)當(dāng)進(jìn)行更多驗(yàn)證和分析。

關(guān)于遺傳檢測微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇目前主流選擇方法是根據(jù)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量多少、平均雜合度高低作為主要的選擇依據(jù),本次實(shí)驗(yàn)選擇的位點(diǎn)也是如此。這種選擇方法也取得了較好的結(jié)果。但也存在一定的弊端,例如本次實(shí)驗(yàn)中,同一位點(diǎn)在DNA池中擴(kuò)增時表現(xiàn)為雜合度較高和等位基因數(shù)較多,而在一群體中則擴(kuò)增效果不佳,因此這種只在某個群體中雜合度非常高的位點(diǎn)是否適用于作為檢測該物種的遺傳檢測位點(diǎn)尚存疑問。另外,香農(nóng)指數(shù)作為一個常見的遺傳多樣性參數(shù),在遺傳分析中經(jīng)常被提及[18]。香農(nóng)指數(shù)越大,說明位點(diǎn)在群體中的分布越廣,也說明生物多樣性越高。香農(nóng)指數(shù)來源于信息熵,香農(nóng)指數(shù)越大,表示不確定性大。不確定性越大,表示這個群體中未知的因素越多,也就是多樣性高。在49個位點(diǎn)計(jì)算的小型比格犬群體遺傳參數(shù)中,香農(nóng)指數(shù)為1.6625,遠(yuǎn)高于小鼠(ICR和KM兩個封閉群)的0.47～0.69的數(shù)值[19],也高于另一個微衛(wèi)星位點(diǎn)組合所檢測的KM小鼠封閉群的香農(nóng)指數(shù)(0.9716)[20],這說明我們所選的位點(diǎn)在群體中的分布非常均一,個體偏差較小。我們進(jìn)一步計(jì)算香農(nóng)指數(shù)發(fā)現(xiàn),本次實(shí)驗(yàn)中利用文獻(xiàn)報(bào)道的13個比格犬位點(diǎn)計(jì)算出的小型比格犬群體遺傳香農(nóng)指數(shù)為1.66,與49位點(diǎn)、或者去除這13個位點(diǎn)后其余36個位點(diǎn)計(jì)算的香農(nóng)指數(shù)一致,均為1.66,但是等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)存在一定差別。這表明,從群體遺傳學(xué)的角度看,如果遺傳檢測位點(diǎn)選擇恰當(dāng),個別位點(diǎn)的等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)對群體的雜合性以及香農(nóng)指數(shù)影響不大,等位基因數(shù)的小幅變化對群體雜合度的影響可能有限。綜合本次實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)采用微衛(wèi)星檢測封閉群比格犬的關(guān)鍵是選擇微衛(wèi)星位點(diǎn)。一旦微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇準(zhǔn)確,其系統(tǒng)的雜合性表現(xiàn)將趨于穩(wěn)定,受單個微衛(wèi)星的雜合性變化影響不大。由于國內(nèi)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)動物遺傳檢測時微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇方法不多,思路也不盡相同,是否可以用香農(nóng)指數(shù)作為選擇位點(diǎn)的依據(jù),還有待于我們用所選的49個位點(diǎn)對更多的比格犬群體進(jìn)行分析和反復(fù)驗(yàn)證,這些位點(diǎn)在不同群體遺傳檢測中的通用性也有待進(jìn)一步優(yōu)化。