海底沉積物生物氣演化特征及氣源影響因素分析

劉煜，李清，林小云，孔赟，肖七林

1. 長江大學非常規(guī)油氣湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430100

2. 長江大學油氣資源與勘探技術(shù)教育部重點實驗室，武漢 430100

3. 長江大學地球科學學院，武漢 430100

4. 中國地質(zhì)調(diào)查局青島海洋地質(zhì)研究所，青島 266071

5. 長江大學資源與環(huán)境學院，武漢 430100

天然氣水合物作為具有巨大潛力的清潔新型能源，其主要分布于陸地永久凍土區(qū)和海洋大陸陸坡、陸隆或海臺區(qū)等溫壓適宜的地區(qū)[1-2]。天然氣水合物的形成與分解受到諸多因素的影響，而形成天然氣水合物的氣源受微生物作用尤為顯著。天然氣水合物是由甲烷形成，且甲烷多為微生物成因氣[3]，近些年來，國內(nèi)外學者在煤層氣增產(chǎn)以及沉積物生物氣模擬實驗研究上取得了一定的研究成果，多以沉積物或煤樣作為生氣基質(zhì)研究影響因素，其中包括生物群落結(jié)構(gòu)，不同溫度、pH 值、鹽度、微量元素、碳酸鹽含量等[2-14]。但是以海洋沉積物為實驗樣品，并且探討以碳源和氮源為主的微生物生長因素的研究較少。本文利用某海域3 個海底沉積物樣品進行了不同生氣條件下的沉積物微生物演化模擬，根據(jù)實驗結(jié)果作為依據(jù)，探討海底沉積物微生物甲烷產(chǎn)氣率的影響因素，為我國海洋天然氣水合物生物氣源評價體系提供依據(jù)。

1 模擬實驗方案

微生物演化生烴模擬實驗是在實驗室條件下盡可能地模擬一個接近自然形成生物氣的環(huán)境條件，通過人為因素使其生氣基質(zhì)在此環(huán)境內(nèi)按照人工選定的微生物的作用而生氣[15-20]。本次實驗主要利用某海域3 個海底沉積物樣品進行了不同溫度、碳源、碳源濃度、氮源和地層鹽度條件下的沉積物微生物演化模擬，探討溫度、有機質(zhì)、酸堿度和鹽度對生物氣生成的影響。

1.1 樣品采集

某海域處于西太平洋活動大陸的邊緣，經(jīng)歷晚中新世抬升剝蝕、上新世拉張斷陷和第四紀海底擴張3 個主要的構(gòu)造演化階段，產(chǎn)生了一定規(guī)模的沖斷斷層與褶皺，發(fā)育了較豐富的斷裂系統(tǒng)。沉積地層主要為第四系、上新統(tǒng)和中新統(tǒng)，沉積層的最大厚度大于12 km，地層分布呈現(xiàn)出由西向東、由北往南逐漸變新、變厚的特征。較厚的沉積地層既為提供充足的氣源奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，也提供了良好的儲層條件。海底表層沉積物的有機碳含量相對較高，有機碳在水深大于500 m 的主要海域變化范圍為1%～1.25%。

本次實驗樣品選自3 個不同深度。海底沉積物從采集到運送至實驗室全程冷藏保存至約-20 ℃，全程密封隔氧。將采集的海底沉積物放入帶塞的廣口瓶中，封閉瓶口（整個過程應(yīng)盡量少接觸空氣）。樣品的基礎(chǔ)信息見表1。

1.2 培養(yǎng)基配置

為使產(chǎn)甲烷菌迅速成為優(yōu)勢種群，本次實驗選用產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)基，具體配置如下：每 1 000 mL 無菌無氧水中加入 K2HPO40.4 g、MgCl22.0 g、KH2PO40.4 g、酵母浸入液 1.0 g、NH4Cl 1.0 g、刃天青 0.01 g、乙酸鈉 2.0 g、KCl 0.2 g、NaCl 2.0 g、微量元素溶液10.0 mL，pH 為 7.0。

配備過程如下：將產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)基所需化學用品分別用電子分析天平稱取規(guī)定克數(shù)后按比例加入1 000 mL 水兌入三角瓶制成產(chǎn)甲烷菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。配備完畢后分裝于厭氧瓶后用立式高壓滅菌鍋進行高溫滅菌（121 ℃，20 min），為后續(xù)的富集培養(yǎng)及傳統(tǒng)培養(yǎng)做準備。

1.3 微生物演化模擬實驗方案

分別稱取 5.0 g 海底沉積物于 150 mL 厭氧玻璃瓶中，加入經(jīng)滅菌的產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)基100 mL，根據(jù)不同影響因素（表2），分別開展了溫度、pH、碳源、碳源濃度、氮源和地層鹽度6 組模擬實驗，其中，溫度組設(shè)定了8 個溫階；pH 值設(shè)計7 組，通過向培養(yǎng)基中添加無菌無氧 1 mol/L 的 HCl 和 NaOH 溶液來調(diào)節(jié)pH 值；分別選用1 g/L 的碳酸鈉、甲醇、乙酸、葡萄糖、乳糖和石油醚作為6 個碳源實驗組；碳源濃度選用5 個乙酸濃度作為實驗組；氮源組分別選用1 g/L 的硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨和酵母膏5 個實驗組；地層鹽度設(shè)計 4 個不同NaCl 濃度實驗組。在每個實驗組加入試劑后通入氮氣5 min 確保厭氧瓶為厭氧環(huán)境后于55 ℃溫度條件下（溫度實驗組用額外水浴培養(yǎng)箱控制溫度）分別培養(yǎng)4 w、8 w，定期用氣相色譜儀專用針管抽取不同對照樣各250 μL，然后注入氣相色譜儀進行檢測，選取在標準甲烷進樣后出現(xiàn)最高峰的時間段時出現(xiàn)的峰面積進行記錄。

表1 實驗用樣品基礎(chǔ)信息表Table 1 Basic information of experiment samples

表2 不同控制因素實驗設(shè)計表Table 2 Experimental design upon different control factors

2 結(jié)果與討論

在海洋沉積物中，影響CH4厭氧氧化的因子很多，包括微生物、表層水合物氧的存在、有機質(zhì)含量、CH4供應(yīng)率、硫酸鹽可獲得性、溫度、水壓、沉積物孔隙度和礦物組成等。微生物演化生烴模擬實驗是在實驗室盡可能的模擬一個接近自然形成生物氣的環(huán)境條件，結(jié)合當前國內(nèi)外CH4厭氧氧化的研究成果，本文主要以溫度、pH 值、鹽度的環(huán)境因素和碳源、碳源濃度、氮源的微生物成長因素兩個方面進行設(shè)計的實驗。

2.1 溫度對海底沉積物演化生烴效果的影響

在溫度作為影響因素的條件下，培養(yǎng)4 w 和8 w之后，產(chǎn)甲烷率均呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，當溫度高于45 ℃時，樣品的產(chǎn)甲烷率有明顯的提升，溫度達到 55 ℃時產(chǎn)甲烷率最大，其中培養(yǎng)4 w 后的C3H 樣品最高，達到了 3.5 μg/g。當溫度高于 65 ℃，樣品的產(chǎn)甲烷率有明顯的下降（圖1）。

圖1 不同溫度下的實驗樣品產(chǎn)氣量Fig.1 Gas production of the experimental samples at different temperatures

溫度是影響產(chǎn)甲烷菌生存的首要因素，適宜的溫度條件不但可以促進產(chǎn)甲烷菌的生長，而且有利于產(chǎn)甲烷菌的繁殖。但是過高的溫度或者過低的溫度均會在一定程度上抑制產(chǎn)甲烷菌的生長和繁殖[21]。研究者們通常利用溫度來劃分產(chǎn)甲烷菌的類型。此外，由于海底沉積物中有大量硫酸還原菌，當硫酸鹽還原菌活動極為明顯時，會產(chǎn)生大量硫化氫，并且抑制產(chǎn)甲烷菌的活動。實驗結(jié)果顯示，實驗采用的產(chǎn)甲烷菌生氣高峰為55 ℃，為嗜熱產(chǎn)甲烷菌[22]。在硫酸鹽還原菌活動相對明顯的35～45 ℃時，甲烷產(chǎn)氣率被抑制。硫酸鹽被還原完畢后，產(chǎn)甲烷菌才開始活動產(chǎn)氣，在55～65 ℃甲烷的生成量開始有顯著的提升，隨后進入高溫階段后（75 ℃以上），因為溫度過高導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌活動下降，產(chǎn)氣率呈現(xiàn)下滑趨勢。實驗結(jié)果表明了較低或者高溫都不利于生物成因氣的生成，這與前人的研究結(jié)果相似[16,23-24]。

2.2 pH 對海底沉積物演化生烴效果的影響

不同的pH 值下，海底沉積物的產(chǎn)氣量不同，其中 C1H 樣品在 4 w 和 8 w 均表現(xiàn)為產(chǎn)甲烷率隨著pH 值的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在pH 值為8 時達到產(chǎn)氣量最大；C3H 樣品則在 4 w 和 8 w 均表現(xiàn)為隨著pH 值增大產(chǎn)氣量逐漸減?。籆9H 樣品則表現(xiàn)為對pH 值變化并不敏感，僅在pH 值為5 時有小幅度產(chǎn)氣量的提升（圖2）。

不同微生物消化過程和消化產(chǎn)物所需的pH 值不同[25-27]。pH 值的變化會通過影響微生物表面電荷變化，改變對其營養(yǎng)物的吸收。也會影響到微生物細胞內(nèi)的酶，改變生物化學過程[27]。研究發(fā)現(xiàn)適宜甲烷菌發(fā)育的水體pH 值為5.9～8.8，最佳范圍值為6.8～7.8，若高于或低于該值，甲烷菌的生長繁殖就會受到抑制,甚至會出現(xiàn)甲烷菌中毒。另外，在一些特定的海底地層中，由于淺層地層水pH 值較高，導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌淺層的活動受到抑制，隨著深度的增加，沉積物開始分解出一定的有機酸，使得pH 值降低，產(chǎn)甲烷菌開始活動，從而使產(chǎn)甲烷量得到顯著提升。實驗結(jié)果顯示pH 變化對于產(chǎn)甲烷量有著極為明顯的改變。pH 值為6～8 時CH4產(chǎn)氣量較高，pH 值在過低或過高時下產(chǎn)氣效果較差。結(jié)果表明海洋微生物產(chǎn)氣的最適宜條件為中性偏堿性，酸性和堿性條件均不利于海洋微生物產(chǎn)氣。pH 為4 時，仍能有較為明顯的甲烷產(chǎn)出，表明可能有嗜酸產(chǎn)甲烷菌的存在。當pH＞8 時，因為幾乎所有產(chǎn)甲烷菌都是通過使CO2+H2還原成甲烷：

此時的CO2溶解度接近為0，但是仍然有甲烷的產(chǎn)出，推斷可能有Methanosarcina甲烷菌依靠乙酸存在[25]。

2.3 碳源對海底沉積物演化生烴效果的影響

在碳源作為影響因素的條件下，培養(yǎng)4 w 和8 w之后，均顯示有機碳源條件下，樣品的產(chǎn)甲烷率有明顯的提升，尤其是培養(yǎng)4 w 后的C3H 樣品的乙酸和乳糖實驗組，產(chǎn)甲烷率均達到了4.9 μg/g（圖3）。

碳源不但是構(gòu)成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中碳素的主要來源，而且是微生物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)來源。豐富的有機質(zhì)和適宜的有機質(zhì)類型是形成生物氣的物質(zhì)基礎(chǔ)，有機質(zhì)類型及其性質(zhì)決定了被微生物利用的難易程度。在生物甲烷氣形成過程中，碳源還是生物氣的重要物源。實驗結(jié)果顯示，加入碳源后，海洋微生物的產(chǎn)甲烷率均有一定的提升。其中有機碳源最為明顯，而有機碳源中的乳糖（雙糖）為最適宜碳源。根據(jù)生物氣形成機制（圖4）[28]，可以推斷出該地區(qū)存在氫解產(chǎn)甲烷菌和酸解產(chǎn)甲烷菌。根據(jù)前文溫度實驗結(jié)果推測，在碳源被氧化成二氧化碳后進入產(chǎn)甲烷代謝時需要在溫度合適的情況下才會進行其代謝任務(wù)，而且海底沉積物中分離出的微生物極有可能具備分解礦化異源有機污染物的潛力[29]。實驗結(jié)果也顯示出碳源的加入有利于加速產(chǎn)甲烷代謝。

圖2 不同 pH 值下的實驗樣品產(chǎn)氣量Fig.2 Gas production of experimental samples at different pH

圖3 不同碳源下的實驗樣品產(chǎn)氣量Fig.3 Gas production of the experimental samples with different carbon sources

圖4 生物甲烷形成途徑示意圖[28]Fig.4 Biogenic methane formation chart

2.4 碳源濃度對海底沉積物演化生烴效果的影響

在碳源濃度作為影響因素的條件下，培養(yǎng)4 w和 8 w 之后，C1H 和 C3H 樣品隨著碳源濃度的增加產(chǎn)甲烷率均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且乙酸濃度達到2.0 mL/L 時，樣品的產(chǎn)甲烷率達到峰值，而埋藏深度更深的C9H 樣品則表現(xiàn)為產(chǎn)甲烷率隨乙酸濃度增長（圖 5）。

雖然如前文所述，碳源的加入有利于加速產(chǎn)甲烷菌的代謝，但是過高的碳源會導(dǎo)致微生物生長旺盛，結(jié)果使微生物對培養(yǎng)基中的各類營養(yǎng)因素需求加大，從而導(dǎo)致產(chǎn)氣率下降。實驗結(jié)果顯示，C1H和C3H 微生物充足，導(dǎo)致在高碳源濃度（5.0 mL/L）時，生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)不足，產(chǎn)氣量出現(xiàn)下降趨勢。而C9H 樣品由于埋藏深度較深，有活力的微生物較少，使其在高碳源濃度下生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)滿足需求，導(dǎo)致實驗結(jié)果仍呈現(xiàn)出產(chǎn)氣量增加的趨勢。以乙酸作為碳源，增加碳源濃度的結(jié)果也證明了前文所述的酸解產(chǎn)甲烷菌和Methanosarcina甲烷菌靠乙酸存在。

2.5 氮源對海底沉積物演化生烴效果的影響

在氮源作為影響因素的條件下，培養(yǎng)4 w 和8 w之后，均顯示有機氮源條件下，樣品的產(chǎn)甲烷率有明顯的提升，尤其是培養(yǎng)8 w 后的C1H 樣品的蛋白胨實驗組，產(chǎn)甲烷率均達到 3.2 μg/g（圖 6）。

圖5 不同碳源濃度下的實驗樣品產(chǎn)氣量Fig.5 Gas production of the experimental samples at different carbon source concentrations

圖6 不同氮源下的實驗樣品產(chǎn)氣量Fig.6 Gas production of the experimental samples with different nitrogen source

氮是微生物細胞壁、蛋白質(zhì)和核酸等重要物質(zhì)的原料。適量的氮源加入會增加微生物的生長，導(dǎo)致產(chǎn)氣量的增加。并且在淺層生物化學作用階段，碳水化合物的消耗速度大于蛋白質(zhì)，木質(zhì)素在厭氧條件下不易分解，脂類也較穩(wěn)定。因此，甲烷菌的養(yǎng)分在陸源沉積物中主要是纖維素、半纖維素、糖類、淀粉及果膠等有機化合物，在海相沉積物中主要是蛋白質(zhì)。實驗結(jié)果表明，加入有機氮源后，海洋微生物的產(chǎn)甲烷率均有一定的提升。其中蛋白胨最為明顯，也證實了實驗所用海底沉積物中微生物的主要養(yǎng)分是蛋白質(zhì)。

2.6 鹽度對海底沉積物演化生烴效果的影響

在鹽度作為影響因素的條件下，培養(yǎng)4 w 和8 w之后，3 個樣品均顯示在不同濃度的地層鹽度條件下，樣品的產(chǎn)甲烷率并無明顯波動，只有C1H 樣品在低鹽度時甲烷產(chǎn)氣率有一定幅度的降低（圖7）。

鹽度是控制微生物生成甲烷的一個重要條件，張祥等[5]通過生物氣模擬實驗結(jié)果表明，產(chǎn)甲烷量與Cl-濃度存在正相關(guān)性，但是由于產(chǎn)甲烷菌個數(shù)與鹽度大體上呈消長關(guān)系，過高的鹽度條件下，產(chǎn)甲烷菌總量會隨鹽度的增高而逐漸減少，從而導(dǎo)致產(chǎn)甲烷率下降[30]。并且由于鉀、鈉離子是生物活動必要的元素，其濃度過大或者過低時，產(chǎn)甲烷菌細胞內(nèi)與外界水介質(zhì)由于濃度差形成滲透膜，從而引發(fā)由于產(chǎn)甲烷菌與外界水介質(zhì)隔離導(dǎo)致的產(chǎn)甲烷菌活性下降。本次實驗的鹽度設(shè)計是為測試微生物的耐鹽度以及不同鹽度條件下產(chǎn)甲烷效果。實驗結(jié)果顯示，實驗所選用的鹽度條件下，產(chǎn)氣率的變化浮動不大。有文獻指出[31]，當鹽度大于25 g/L時，產(chǎn)甲烷率會有明顯的下降，本次實驗結(jié)果為以后的25 g/L 鹽度實驗作有利的鋪墊。

圖7 不同鹽度濃度下的實驗樣品產(chǎn)氣量Fig.7 Gas production of the experimental samples at different salinity concentration

3 海底沉積物微生物演化生烴影響因素的地質(zhì)意義

某海域具有相對較高的熱流值，相應(yīng)的地溫梯度也很高，分布不均勻，變化較大，且高值點和低值點緊鄰分布。本次實驗借鑒前人的研究方法[32]，根據(jù)不同溫度微生物演化及產(chǎn)氣率具有階段性的特征，將其生物氣生成演化過程劃分成3 個階段：生物生氣早期階段、生物生氣高峰期階段、生物生氣晚期階段（圖 8）。

3.1 生物生氣早期階段

此階段處于喜氧帶底部至溫度達到30 ℃之間。由于產(chǎn)甲烷菌是厭氧菌，因此當環(huán)境進入缺氧環(huán)境時，生物成因氣便開始產(chǎn)生。在海水至海底表層喜氧帶，由于存在大量的氧氣，沉積有機質(zhì)會率先被喜氧微生物進行降解。當有機質(zhì)埋藏至一定深度時，由于游離氧被消耗殆盡，環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬醐h(huán)境。但是由于在厭氧環(huán)境下，硫酸鹽還原菌攝取H2和乙酸的能力強于產(chǎn)甲烷菌，所以率先進入碳酸鹽還原帶，在此期間產(chǎn)甲烷菌的活動受抑制，只能生成少量的甲烷，只有當硫酸鹽耗盡之后，才有顯著數(shù)量的甲烷存在[33]。隨后進入碳酸鹽還原帶，但由于地溫過低，使其產(chǎn)甲烷菌活性較低，生物氣生成量較少。根據(jù)某海域?qū)嶒灁?shù)據(jù)及采樣點的地溫梯度，分析認為，采樣點所在區(qū)域的生物氣開始生成的深度范圍可以從沉積物表層延伸至約100～200 m，該階段溫度小于 20～30 ℃，產(chǎn)氣量較低。

3.2 生物生氣高峰期階段

此階段處于30～80 ℃區(qū)間。伴隨著沉積有機質(zhì)的埋藏深度不斷增加，其溫度也在不斷的上升，當溫度上升至硫酸鹽還原菌不再適宜生存，而環(huán)境條件逐漸適合產(chǎn)甲烷菌群的生存時，可溶有機質(zhì)被淺層的發(fā)酵菌優(yōu)先利用，發(fā)酵分解為還原態(tài)的有機化合物，隨后，在產(chǎn)氫菌與產(chǎn)乙酸菌的作用下分解形成產(chǎn)甲烷菌可利用的最終底物（如：乙酸、二氧化碳、氫等），在產(chǎn)甲烷菌不斷利用移除底物的同時，也促使了有機質(zhì)發(fā)酵水解并產(chǎn)生大量甲烷[16,34-37]，沉積物生物氣生成演化進入生物化學生氣高峰期階段。根據(jù)某海域?qū)嶒灁?shù)據(jù)及采樣點的地溫梯度，分析認為，該類產(chǎn)甲烷菌的最適生長溫度（Topt）為65 ℃，屬于嗜熱產(chǎn)甲烷菌[21]。推測采樣點所在區(qū)域的主生氣帶位于200～500 m，這個階段的溫度大約30～75 ℃，以 55～65 ℃這一溫度段的生氣作用占主導(dǎo)地位，為生氣高峰階段。

圖8 某海域沉積物生物氣生成演化模式圖Fig.8 Biogas generation and evolution model for the study area

3.3 生物生氣晚期階段

此階段在達到80 ℃之后。當?shù)販剡M一步升高之后，如同硫酸鹽還原菌一樣，產(chǎn)甲烷菌也會因過高的溫度而導(dǎo)致其活性降低，伴隨著埋藏深度的進一步增加，能夠被微生物溶解利用的有機質(zhì)在高峰期階段已被大量降解且消耗，加之溫度過高和營養(yǎng)匱乏，產(chǎn)甲烷率開始逐漸降低。并且進入了熱解作用階段，此后的甲烷變?yōu)橛蔁峤庾饔弥鲗?dǎo)的熱解成因氣。根據(jù)某海域?qū)嶒灁?shù)據(jù)及采樣點的地溫梯度，分析認為，當?shù)販剡_到75 ℃以上，產(chǎn)甲烷率有明顯的下降時，有機質(zhì)進入生物化學生氣晚期階段。

實驗結(jié)果表明，溫度為 45～65 ℃、pH 值為 6～8、地層鹽度為1～20 g/L、并且具有充足的碳源和氮源的條件下，海底沉積物微生物最為活躍，產(chǎn)甲烷率最高。這些環(huán)境條件與埋藏深度密切相關(guān)，隨著埋藏深度的增加，會導(dǎo)致溫度的升高，pH 值上升，產(chǎn)生有利于產(chǎn)甲烷菌活動的條件。但埋藏深度的增加并不全是有利的條件，微生物的數(shù)量以及可被微生物發(fā)酵利用形成能夠被產(chǎn)甲烷菌利用的底物有機質(zhì)均會因埋藏深度增加而下降。而且地下水是一個不能忽視的因素，地下水會引起地層的pH值改變、鹽度的增加等環(huán)境的改變。弱堿性、弱徑流的水動力條件應(yīng)當是生物氣生成的有利條件。依據(jù)某海域的采樣點地溫梯度，可以認為采樣點所在區(qū)域的生物氣烴源巖埋藏深度大約為200～500 m，具有弱堿性、弱徑流水動力條件的地區(qū)可以作為重點勘查地區(qū)。

4 結(jié)論

（1）根據(jù)不同溫度微生物演化及產(chǎn)氣率特征，海底沉積物微生物演化生烴主要分為生物生氣早期、生物生氣高峰期和生物生氣晚期，生物生氣早期和生物生氣晚期由于硫酸還原菌和溫度過高兩個因素導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌群活性較低，生物生氣較少；生物生氣高峰期由于溫度適宜，有機質(zhì)充沛，生物生氣達到一個高峰。

（2）沉積物微生物演化模擬實驗結(jié)果認為，不同溫度、pH、碳源、碳源濃度和氮源對微生物生氣有較為明顯的影響，其中溫度為55～65 ℃、pH 為6～8、碳源選取乳糖（雙糖）、碳源濃度 2.0 mL/L 以及蛋白質(zhì)為主要氮源時，產(chǎn)氣率最為顯著。

（3）依據(jù)某海域采樣點地溫梯度，采樣點所在區(qū)域的海底生物氣烴源巖埋藏深度大約為200～500 m，具有弱堿性、弱徑流水動力條件的地區(qū)可以作為重點勘查地區(qū)。