微塑料對黑麥草吸收和累積水體中環(huán)丙沙星的影響

單 寧， 祖木熱提·艾比布， 米麗班·霍加艾合買提， 努扎艾提·艾比布*

1.新疆師范大學化學化工學院， 新疆 烏魯木齊 830054

2.昌吉職業(yè)技術學院， 新疆 昌吉 831100

塑料制品被廣泛應用于日常生活中，在帶來便利的同時也引起了一系列環(huán)境問題. 塑料垃圾經過長時間的風化、裂解可以形成粒徑很小的塑料顆粒，2004年Thompson等[1]首次提出了“微塑料”(microplastics， MPs)的概念. 一般粒徑小于5 mm的塑料顆粒被稱為微塑料[2]. 世界各地的海洋、沉積物、河道及土壤等環(huán)境中均已檢測出微塑料的存在[3-8]. 近年來，國內外開展的微塑料對水生生物的生態(tài)毒理性研究表明，水生生物攝取微塑料后會產生氧化應激、減少攝食、降低存活率和生殖抑制等現(xiàn)象[9]. 有研究表明，微塑料會抑制藻類的光合作用[10-11]，也會對黑麥草體內葉綠素b有明顯的抑制作用[12]. 與此同時，微塑料比表面積大，較容易富集環(huán)境污染物. 已有研究[13-14]表明，微塑料可作有機氯農藥、多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴等疏水性有機污染物的載體. LI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，水環(huán)境中的聚酰胺塑料顆粒可作為抗生素的載體.

抗生素作為一種新型環(huán)境污染物也是當前的研究熱點之一，已有研究者在土壤及水環(huán)境中檢測出不同種類的抗生素[16-17]. 相關研究發(fā)現(xiàn)，抗生素對植物生長表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，同時會導致微生物產生抗生素耐藥基因[18-19]. 作為環(huán)境中頻繁出現(xiàn)的兩種新興污染物，微塑料很可能作為抗生素類污染物的載體，影響其環(huán)境行為和毒性效應. 研究[20]表明，吸附有磺胺甲惡唑的微塑料會導致白符跳蟲內臟產生抗生素耐藥基因，同時也會影響其腸道內微生物群落的種類.

迄今為止，微塑料與抗生素復合污染物的研究主要集中于吸附機制和特性方面，微塑料對抗生素的生物有效性、植物體內吸收積累及生態(tài)毒理作用的影響尚不明確. 黑麥草作為一年或多年生的優(yōu)質牧草，有根系發(fā)達、生物量大、在逆境生存能力極強等優(yōu)點[21-22]，可作為復合人工濕地栽培植物用于凈化污水. 因此，該研究以黑麥草為受試植物，以環(huán)丙沙星和聚苯乙烯微塑料為研究對象，探究微塑料對植物去除抗生素效率的影響、微塑料-抗生素復合污染對植物的生理毒性和微塑料對黑麥草體內積累和去除水中環(huán)丙沙星的影響，以期為植物修復微塑料-環(huán)丙沙星復合污染物提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑麥草種子購自邳州市奇緣花卉種植園；聚苯乙烯微塑料(500 nm)購自南京捷納思新材料有限公司；環(huán)丙沙星(純度98%)購自上海麥克林生化科技有限公司；95%乙醇購自阿拉丁試劑有限公司，甲酸(純度88%)購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)購自美國西格瑪奧德里奇有限公司，乙腈(色譜純)購自阿拉丁試劑有限公司.

1.2 植物的培養(yǎng)

將黑麥草種子在15%的次氯酸鈉溶液中浸泡15 min，用去離子水沖洗3次后均勻撒在提前消毒過的托盤中的醫(yī)用紗布上，用蒸餾水浸泡并放入25 ℃的培養(yǎng)箱，在黑暗條件下發(fā)芽3 d. 將發(fā)芽的黑麥草從培養(yǎng)箱內移出來在室溫(23±2)℃下繼續(xù)培養(yǎng). 待黑麥草長至約12 cm時，將其移到150 mL含有12 濃度Hoagland營養(yǎng)液的錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng).

環(huán)丙沙星作為第二代氟喹諾酮類抗生素，在水體中檢出濃度達到幾百ngL，在生產污水中可達30 mgL[23]. 試驗共設置8個處理組: ①不添加污染物的空白對照，記為T1；②添加50.0 mgL MPs，記為T2；③添加0.1 mgL CIP，記為T3；④添加50.0 mgL MPs和0.1 mgL CIP，記為T4；⑤添加1.0 mgL CIP，記為T5；⑥添加50.0 mgL MPs和1.0 mgL CIP，記為T6；⑦添加2.0 mgL CIP，記為T7；⑧添加50.0 mgL MPs和2.0 mgL CIP，記為T8.

表1 12濃度Hoagland營養(yǎng)液配方

Table 1 The concentration of 12 Hoagland nutrient solution

表1 12濃度Hoagland營養(yǎng)液配方

試劑化學式濃度∕(g∕L)Ca(NO3)2·4H2O94.500KNO360.700NH4H2PO411.500MgSO4·7H2O49.300MnSO4·H2O0.082ZnSO4·7H2O0.011CuSO4·5H2O0.011Na2MoO4·2H2O0.030H3BO30.143FeSO4·7H2O1.390Na2·EDTA1.865

1.3 測定方法

1.3.1生物量測定

在試驗開始的第0天和第16天，分別測定黑麥草的鮮質量、根長和葉長，計算所得差值分別為黑麥草的鮮質量凈增長量、根長凈增長量和葉長凈增長量，比較培養(yǎng)周期內黑麥草在微塑料、CIP和MPs-CIP復合污染作用下生物量凈增長量之間的差異性.

1.3.2葉綠素含量測定

葉綠素含量參考《植物生理生化實驗原理和技術》中的測定方法[24]，用95%乙醇提取黑麥草葉片中的葉綠素，用雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司)測定萃取液的吸光度，計算葉綠素a、b的含量.

1.3.3環(huán)丙沙星提取

底物中環(huán)丙沙星含量測定：在試驗開始的第0天和第16天分別用玻璃棒將水樣攪勻后取2.0 mL，過0.45 μm的過濾膜，4 ℃保存，待測.

黑麥草體內環(huán)丙沙星的提取：分別剪去等量鮮質量(0.5 g)的植物新鮮樣品，用液氮迅速冷凍，并將樣品碾碎成粉末. 將粉末狀植物樣品與8.0 mL萃取液(0.5%甲酸與甲醇的體積比為1∶1)混勻，劇烈振蕩10 min后置于振蕩器搖動24 h，離心收集上清液，旋轉蒸發(fā)至2 mL左右，再用氮氣吹至干燥，最后溶解于1 mL的甲醇，過0.22 μm的有機濾膜得濾液，4 ℃下保存，待測[25].

營養(yǎng)液和從黑麥草體內提取的CIP均用高效液相色譜法(Agilent 1260，安捷倫科技有限公司，美國)進行定量分析. 測試時參考Panja等[26]的方法，部分條件做出調整，具體測試條件：選用Agilent ZORBAX C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相是體積比為20∶80的乙腈和甲酸(0.1%)混合液，進樣體積為20 μL，流速為0.8 mLmin，柱溫30 ℃，檢測波長278 nm，柱壓 8 800 kPa左右.

1.4 數(shù)據處理

數(shù)據均用Microsoft Excel 2019和SPSS Statistics 20軟件進行整理和分析，試驗數(shù)據以平均值±標準方差(SD)表示，運用SPSS Statistics 20軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)對不同污染物處理對黑麥草生物量、葉綠素含量及其吸收累積差異性進行統(tǒng)計分析，并進行LSD顯著性檢驗，采用Origin 2019軟件進行繪圖.

2 結果與討論

2.1 微塑料對黑麥草吸收去除環(huán)丙沙星的影響

黑麥草生物量大、根系發(fā)達，具有修復受污染土壤和水體的潛力[27-28]. 如圖1所示，黑麥草具有吸收去除水溶液中CIP的能力，且微塑料的存在會對黑麥草吸收CIP具有一定的促進作用，但微塑料對黑麥草吸收CIP的促進作用會隨著CIP濃度的增加而減少. 當CIP濃度為0.1 mgL時，投加50.0 mgL的微塑料后，黑麥草對CIP的吸收去除率達到100%. 與單一CIP處理組相比，投加微塑料后，黑麥草對0.1、1.0和2.0 mgL的CIP吸收去除能力分別增加了45.0%、5.0%、3.1%，這可能與底物中微塑料對CIP的吸附量有關. 不同處理組之間黑麥草對CIP的去除率存在顯著差異(見圖1)，黑麥草對0.1 mgL CIP和50.0 mgL MPs-0.1 mgL CIP處理組中CIP的去除率存在顯著差異(P<0.05)，但對高濃度CIP(1.0、2.0 mgL)處理組之間差異并不顯著(P>0.05). 由此可見，當CIP濃度較低時，微塑料可以促進黑麥草對底物中CIP的去除，但對黑麥草去除高濃度的CIP并無顯著影響. 由于聚苯乙烯微塑料表面存在—COOH基團，可形成氫鍵，并帶負電荷，因此可通過靜電引力、π-π作用將CIP吸附其表面[29-30]. 微塑料可作為CIP的載體將更多的CIP帶入植物體內，從而促進黑麥草對CIP的吸收及體內的積累. SUN等[31]的研究也證實了植物能吸收并在體內轉運環(huán)境中小粒徑的微塑料. Hodson等[32]研究表明，微塑料可以作為接觸載體來提高鋅的生物有效性.

注： 不同字母表示處理組之間在0.05水平上存在顯著性差異(n=5).

2.2 微塑料對黑麥草體內積累環(huán)丙沙星的影響

試驗結果表明，不同處理組的CIP均能被黑麥草的根系吸收并被轉運至地上部(見圖2). 隨著底物中CIP濃度的增加，黑麥草根部和葉片內CIP的積累量總體呈逐漸增加的趨勢；與單一CIP處理組相比，在MPs-CIP復合污染處理組中黑麥草體內CIP的積累量呈顯著增加趨勢. 由圖2可見，相同CIP濃度下，底物中共存的微塑料對根部CIP的積累并無顯著影響(P>0.05)，但微塑料對葉片內CIP的積累存在顯著促進作用(P<0.05). 這可能是因為黑麥草在根部吸收養(yǎng)分和CIP的同時也吸收了部分表面吸附CIP的微塑料，從而增加了其體內CIP的含量. 已有研究[33]表明，微塑料可以吸附持久性有機污染物(POPs)，并促進這些污染物在生物體內富集. 另外，在單一CIP處理組中，黑麥草根部CIP的積累量均大于葉片，但相同濃度CIP與50.0 mgL微塑料共存時，微塑料會促進根部積累的CIP向地上部轉運，最終葉片中CIP含量大于根部. 當CIP濃度為0.1 mgL時，與單一CIP處理組相比，投加50.0 mgL的微塑料后，黑麥草根部CIP的積累量降低了44.0%，而葉片中CIP的積累量則增加了2.9倍(P<0.05)；當CIP濃度為2.0 mgL時，投加MPs后黑麥草根部CIP的積累量降低了21.2%，而葉片中CIP的積累量增加了3.0倍(P<0.05). 李連禎等[34]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 μm的聚苯乙烯微球可以被生菜(Lactucasativa)吸收，并從根部遷移到地上部進而在莖葉中積累. 因此，進入黑麥草體內的微塑料在向地上部遷移的同時，會將更多的CIP轉移到葉片，從而促進CIP在地上部積累.

注： 不同字母表示處理組之間在0.05水平存在顯著性差異(n=3).

2.3 微塑料-環(huán)丙沙星復合污染對黑麥草生物量的影響

如圖3所示，單一CIP處理組和MPs-CIP復合污染處理組黑麥草生物量凈增長量隨著CIP濃度的增加而逐漸減小，其中，MPs-CIP復合污染處理組對生物量凈增長量的抑制作用更為顯著. 與單獨投加0.1 mgL、2.0 mgL CIP的處理組相比，50.0 mgL MPs-0.1 mgL CIP、50.0 mgL MPs-2.0 mgL CIP復合污染處理組黑麥草的鮮質量和根長凈增長量分別降低了16.5%、55.5%和53.7%、79.6%(P<0.05)，說明微塑料的存在加重了CIP對黑麥草生長的抑制作用. 單一微塑料的存在也對黑麥草根部生長和鮮質量有顯著抑制作用(見圖3). 與空白對照相比，單一微塑料處理組的黑麥草根部和鮮質量凈增長量分別降低了49.3%和33.8%(P<0.05). 這可能是因為微塑料對黑麥草光合系統(tǒng)產生了損害，阻礙了蛋白質的合成，進而抑制植物生長[35]. Besseling等[36]研究發(fā)現(xiàn)納米微塑料會顯著抑制藻類生長，李貞霞等[37]研究發(fā)現(xiàn)18 μm的聚氯乙烯微塑料明顯抑制了黃瓜(CucumissativusL.)根系的生長. 由此可見，MPs-CIP復合污染處理黑麥草時，微塑料的存在加重了CIP對黑麥草生長的抑制作用. 李瑞杰等[38]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 μm的聚苯乙烯塑料微球能被禾本科作物轉運至木質部，并向地上部轉移. JIANG等[39]報道了微塑料通過影響植物營養(yǎng)元素的運輸，進一步對蠶豆(Viciafaba)的生長產生抑制作用. 由此可見，聚苯乙烯微塑料吸附CIP后部分CIP在根部積累，并抑制根系的生長發(fā)育，從而影響根系對營養(yǎng)物質的吸收，減少營養(yǎng)物質向地上部的運輸；同時，轉運至葉片中的MPs-CIP復合污染也對葉片產生一定的毒害作用，從而導致黑麥草地上部生物量凈增長量的降低.

注： 不同字母表示各處理組在0.05水平存在顯著性差異 (n=5).

2.4 微塑料-環(huán)丙沙星復合污染對黑麥草葉片中葉綠素的影響

葉綠素是植物光合作用的重要活性物質[40]，其含量與植物光合作用速率呈正相關. 在試驗后期，單一CIP處理組和MPs-CIP復合污染處理組的黑麥草葉片均出現(xiàn)白化現(xiàn)象，尤其MPs-CIP復合污染處理組黑麥草的白化現(xiàn)象更為顯著，這可能與黑麥草體內葉綠素含量的變化相關. 如圖4所示，與空白對照相比，單一微塑料污染物處理顯著抑制了黑麥草體內葉綠素a、b含量(P<0.05). 單一CIP處理組和MPs-CIP復合污染處理組黑麥草葉片中葉綠素a、b含量均呈現(xiàn)隨著CIP濃度的增加而逐漸減少的趨勢. 其中，相同CIP濃度下微塑料的存在對葉綠素a、b的抑制作用更為明顯. 50.0 mgL MPs-2.0 mgL CIP復合污染處理組黑麥草葉片內葉綠素a、b的含量最低，分別為21.1和5.8 mgg，與2.0 mgL CIP處理組相比，分別降低了38.5%和44.4%. 有研究[41]發(fā)現(xiàn)，高濃度的CIP可以抑制羊角月牙藻DNA復制，導致葉綠素含量降低；抗生素類污染物可通過抑制植物對微量營養(yǎng)元素的吸收，進而抑制光合作用和葉綠素的合成[42]. JIANG等[43]研究發(fā)現(xiàn)，銀納米顆?？梢燥@著降低水生浮萍(Spirodelapolyrhiza)體內葉綠素含量. 因此，微塑料的存在可能增強了CIP對黑麥草葉綠素合成的抑制作用.

注： 不同字母表示各處理組在0.05水平存在顯著性差異(n=3).

當前，微塑料與其他污染物形成的復合污染的生物毒性和生物有效性的相關研究還處于初步研究階段，該研究初步證實微塑料的存在會影響植物對抗生素的吸收去除并加重植物生長的毒性作用. 但該試驗采用的微塑料能否進入并積累在植物體內，如何影響植物吸收及其體內轉運抗生素的機理等仍有待進一步研究證實.

3 結論

a) 在單一CIP污染物和MPs-CIP復合污染物存在條件下，黑麥草均能吸收去除水體中的CIP，并且微塑料的存在會促進黑麥草對CIP的吸收，但其作用隨著CIP濃度的增加而減少. 投加微塑料后，與單一CIP處理相比，黑麥草對0.1和2.0 mgL CIP的去除率分別增加了45.0%和3.1%.

b) 微塑料可以促進黑麥草根部積累的CIP向地上部轉運. 與單一0.1 mgL CIP處理相比，50.0 mgL MPs-0.1 mgL CIP復合污染處理組黑麥草根部CIP的積累量降低了44.0%，而葉片中CIP的積累量增加了2.9倍.

c) 水體中的微塑料對黑麥草生長有抑制作用，微塑料與CIP共存會進一步加重CIP對黑麥草生長和葉綠素含量的抑制作用.