補腎益精湯對弱精癥大鼠精子線粒體功能的影響及其相關(guān)機制研究

王世平，李倩云，崔言秀，呂 濤，徐光玉，王策正

隨著環(huán)境污染、社會壓力增加，男性不育癥的發(fā)病率越來越高，而弱精癥是男性不育癥的重要原因。一直以來，中醫(yī)藥在少弱精子癥的臨床治療中發(fā)揮了重要的作用，但因成分復(fù)雜，其確切的作用機制以及靶點尚不十分清楚。補腎益精湯是著名的中醫(yī)專家亓緒武先生的方劑，在臨床應(yīng)用中療效明確，能夠顯著提高患者精子活力以及配偶受孕率。本研究將探討補腎益精湯對大鼠精子線粒體呼吸功能以及能量代謝的影響，并在精子特異性鈣通道CatSper1層面對其作用機制進行分析。

1 資料與方法

1.1 動物 健康成年清潔級雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量(200±24) g，青島大學(xué)中心實驗室提供，質(zhì)量合格證號：SCXK(魯)20170110。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字法將大鼠分為正常對照組（A組）、雷公藤多苷組（B組）、生理鹽水組（C組）、左卡尼汀組（D組）及補腎益精湯組（E組），每組20只。

1.2 藥物及試劑 補腎益精湯：黃芪40克，當(dāng)歸10克，枸杞子、菟絲子、車前子、五味子、覆盆子、淫羊藿各15克，熟地20克。由泰山醫(yī)學(xué)院附屬萊蕪醫(yī)院中藥房煎制，用0.9%生理鹽水將濃度稀釋成1 g/mL，置于4 ℃冰箱備用。雷公藤多苷由浙江省普洛康裕天然藥物有限公司生產(chǎn)（批號：20170801）。用0.9%生理鹽水將濃度稀釋成1 g/mL，置于4 ℃冰箱備用。左卡尼汀購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司(50 mg/支, 國藥準(zhǔn)字H19990372)，按成人說明書口服劑量，用生理鹽水分別稀釋成50 mg/mL，置于4 ℃冰箱備用。細(xì)胞線粒體分離試劑盒、線粒體呼吸測定試劑盒以及ATP檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，CatSper1和GAPDH基因擴增引物購自上海生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 高速低溫離心機：美國Beckman公司；全自動精子分析儀：北京偉力有限公司；超低溫冷凍冰柜：日本索尼公司；細(xì)胞計數(shù)板：上海益恒實驗儀器有限公司；組織勻漿器：海門天龍實驗器材廠；多功能酶標(biāo)儀M5：美谷分子儀器有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 用藥方法 A組大鼠每日灌胃生理鹽水[1 mL/(kg·d)]，B、C、D、E組每日灌胃雷公藤多苷[20 mg/（kg·d）]，共21 d，處死A、B兩組大鼠，然后C組每日灌胃生理鹽水[1 mL/(kg·d）]，D組每日灌胃左卡尼汀[50 mg/（kg·d）]，E組每日灌胃補腎益精湯[3 g/（kg·d）]，共35 d，處死C、D、E三組大鼠。用藥過程中，B組、E組死亡各1只，D組死亡2只。

1.4.2 精子標(biāo)本的獲取 摘取大鼠附睪置于清潔培養(yǎng)皿中，加入2 mL 37 ℃生理鹽水，用無菌剪刀將附睪剪成碎塊后，移入試管中，用Percoll分離法優(yōu)化精子備用。取同等體積的優(yōu)化精液8 μL放置于載玻片，進行精液常規(guī)精子運動軌跡分析。線粒體的分離、細(xì)胞線粒體呼吸控制率（RCR）測定、ATP含量測定均嚴(yán)格按照所購買的試劑盒說明書嚴(yán)格操作。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)測定CatSper1 RNA含量，操作嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒操作。具體如下：（1）精子總RNA制備。（2）引物設(shè)計。PCR擴增引物由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成。見表1。（3）逆轉(zhuǎn)錄合成。反應(yīng)條件：Cat Sper 1反應(yīng)：依次進行：94 ℃、1 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，36個循環(huán)，72 ℃、10 min。GAPDH 反應(yīng)：94 ℃、1 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、45 s，34個循環(huán)，72 ℃、10 min。（4）電泳及結(jié)果分析：載體：2%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液。PCR產(chǎn)物4.0 μL與10×載體樣緩沖液1.0 μL混勻，點樣，80 V穩(wěn)壓電泳45 min，在凝膠成像儀上觀察、拍照。應(yīng)用 Quantity One軟件進行半定量分析。

表1 基因擴增引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用Pearson相關(guān)分析E組RCR、ATP分別與CatSper1 RNA含量的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠精液參數(shù)比較 與A組比較，B組的精子密度、a+b級百分率及存活率均明顯下降，弱精癥動物模型制作成功。與C組比較，D組、E組的精子三項指標(biāo)均有所提高，且E高于D組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見表2。

表2 各組大鼠精液參數(shù)比較

2.2 各組精子RCR、ATP及CatSper1 RNA含量比較 B組RCR、ATP及CatSper1 RNA均低于A組（P＜0.01）。與C組比較，D組、E組精子RCR、ATP及CatSper1 RNA均有所提高，E組高于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠精子RCR、ATP及CatSper1 RNA含量比較

2.3 Pearson相關(guān)性分析 E組的RCR、ATP含量與CatSper1 RNA均呈正相關(guān)（r=0.912、0.893，P＜0.05），見圖 1。

圖1 E組大鼠ATP、RCR含量與RNA含量的相關(guān)性分析

3 討論

弱精癥是男性不育的重要原因，發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，一直是研究的熱點。雖然國內(nèi)外學(xué)者對其進行了大量的研究，但其確切的原因尚不清晰[1]。在弱精癥的眾多研究中，動物模型起到了重要的作用。其中，雷公藤多苷誘導(dǎo)的弱精癥動物模型因其操作簡便，特異性高，成模時間短，對模型動物傷害較小等特點，應(yīng)用比較廣泛[2-4]。目前，眾多研究者分別在病理學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、內(nèi)分泌機制以及遺傳學(xué)等各個方向分別闡述了雷公藤多苷誘導(dǎo)生精障礙的機制。其誘導(dǎo)的弱精癥大鼠模型也逐步廣泛應(yīng)用于弱精癥的各項研究中[5]。本研究應(yīng)用雷公藤多苷[20 mg/（kg·d）]灌胃大鼠21 d，通過檢測大鼠附睪精子的運動參數(shù)，證實弱精癥模型制備成功。

線粒體是通過三羧酸循環(huán)以及氧化磷酸化合成ATP為精子細(xì)胞提供能量的，其是精子細(xì)胞最重要的細(xì)胞器之一。線粒體的功能狀態(tài)對精子細(xì)胞的運動能力，特別是快速前向運動及前向運動能力起決定性作用[6-7]。精子細(xì)胞作為終末細(xì)胞，在形成過程中丟棄了絕大多數(shù)的細(xì)胞器，只保留了重要的線粒體和高爾基體，因此，線粒體的作用十分突出，不但能為精子提供生存以及運動的能量，還在鈣離子的平衡調(diào)節(jié)、細(xì)胞的程序性死亡過程中發(fā)揮了重要的作用[8]。CatSperl作為精子細(xì)胞特異性鈣通道，目前已經(jīng)被證實是精子細(xì)胞尾部鞭毛鈣離子內(nèi)流的主要通道，在對精子超活化過程中起到?jīng)Q定性作用。CatSperl缺失的精子，其運動力明顯減弱，快速前向運動基本消失，前向運動也被大量抑制，其尾部不能彎曲，缺乏有力地“鞭打”[9]。在本課題的前期研究中，筆者先后對弱精癥大鼠的精子細(xì)胞線粒體的呼吸功能與ATP的含量進行測定，并通過基因敲除技術(shù)將CatSperl基因敲除后發(fā)現(xiàn)，精子細(xì)胞線粒體的呼吸功能與能量代謝與CatSperl存在密切相關(guān)性[10]。

中醫(yī)理論中，精子的物質(zhì)基礎(chǔ)為腎精，精子運動的動力來源為腎氣，弱精子癥主責(zé)為腎精弱氣虛。中藥方劑在腎精弱氣虛的治療實踐中形成并完善了辨證辨病、因癥因病因人施治的一系列理論。補腎益精湯是著名中醫(yī)專家亓緒武先生的方劑：黃芪40克，當(dāng)歸10克，枸杞子、菟絲子、車前子、五味子、覆盆子，淫羊藿各15克，熟地20克。以五子衍宗丸為基礎(chǔ)，增加淫羊藿、黃芪等相關(guān)佐劑，每日1副，30日為一療程，在臨床應(yīng)用過程中效果顯著。五子衍宗丸作為經(jīng)典名方，臨床應(yīng)用中能夠顯著改善患者的精液質(zhì)量。主要表現(xiàn)在提高精子密度、提高精子運動能力，減少精子畸形率，增加配偶的懷孕幾率[11]。黃芪的主要成分為黃芪總多糖（TPA）、黃芪總皂苷（TSA）以及黃芪總酮（TFA），在輔助生殖技術(shù)中應(yīng)用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有抗氧化應(yīng)激作用，并且在精子細(xì)胞鈣離子的調(diào)節(jié)中發(fā)揮一定的作用[12]。淫羊藿的主要成分是淫羊藿苷，在弱精癥的治療方劑中應(yīng)用較多，能直接刺激性腺，促使睪酮分泌增加，增加雄性生殖能力[13]。當(dāng)歸富含天然的植物性荷爾蒙，現(xiàn)代生物研究發(fā)現(xiàn)其也直接消除自由基，抑制氧化反應(yīng)和自由基反應(yīng)等過程中發(fā)揮了重要作用[14]。熟地是六味地黃丸的主要佐劑之一，治療腎陽不足，畏寒肢冷，命門火衰，小便遺瀝，陽痿遺精[15]。

本研究通過制作弱精癥大鼠模型，給予弱精癥大鼠灌胃補腎益精湯，發(fā)現(xiàn)補腎益精湯可以明顯增加精子運動能力以及存活率。通過檢測發(fā)現(xiàn)精子RCR、精子細(xì)胞ATP的含量及CatSperl含量均明顯增加，且CatSperl與RCR、ATP之間呈正相關(guān)。提示補腎益精湯通過提高精子線粒體的呼吸功能和能量代謝進而改善精子質(zhì)量，而精子特異性鈣通道CatSperl可能是其作用靶點之一。