SRY陰性46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征1例報道

洪志丹 周春 張元珍 劉松梅 彭建紅 劉環(huán)宇

46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征是一種非常罕見的疾病，我國的發(fā)病率約1/20 000～25 000[1]，但其發(fā)病機制不清楚。本文對1例SRY陰性的46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征患者進行系列檢查，包含精液分析、血清生殖激素測定、染色體核型分析、SRY基因及Y染色體微缺失檢測、外周血全外顯子測序，分析其遺傳學變化與臨床表現(xiàn)的相關性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，且患者知情同意。

臨床資料

患者，社會性別男性，28歲，已婚，與現(xiàn)配偶同居6年未避孕未育，于2016年3月就診。體檢：身高177 cm，體重85 kg，男性外觀；陰莖長度6 cm(疲軟狀態(tài))，陰囊外觀正常，可觸及雙側(cè)睪丸，體積均約2 ml，質(zhì)地中，有觸痛。生殖系統(tǒng)超聲檢查提示雙側(cè)睪丸發(fā)育不良。因外生殖器異常于幼時行尿道下裂成形術、隱睪下降移位術及剖腹探查術，術中未見子宮及附件等女性內(nèi)生殖器組織，術后多次復查無異常發(fā)現(xiàn)。父母體健，非近親婚配，系獨生子女，家族中無類似病史。

常規(guī)精液分析結果：精液量1.6～2.2 ml。多次精液常規(guī)鏡檢均未見精子。血清生殖激素檢測結果：FSH 33.78 mIU/ml(正常范圍：1.27-19.26 mIU/ml)，LH 23.51 mIU/ml(正常范圍：1.24-8.26 mIU/ml)；E229 pg/ml(正常范圍：20-47 pg/ml)，T 1.66 ng/ml(正常范圍：0.75-7.8 ng/ml)，PRL 11.09 ng/ml(正常范圍：2.64-13.13 ng/ml)?；颊逨SH、LH均升高，提示高促性腺激素性腺功能不全。染色體核型及Y染色體微缺失分析結果：通過染色體G顯帶法及染色體非整倍體基因拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)兩種方法所測染色體核型均為46,XX，CNVs檢查未發(fā)現(xiàn)其他異常。PCR-探針法檢測SRY基因及Y染色體微缺失，結果顯示Y染色體AZFa(sY84、sY86)、AZFb(sY127、sY134)、AZFc(sY254、sY255)6個位點均缺失，SRY基因陰性。

全外顯子測序結果：患者目標區(qū)域平均測序深度為97目，目標區(qū)域覆蓋度達到94.55%，其中測序深度達到20中以上的區(qū)域占芯片捕獲區(qū)域的92.86%，芯片對目標區(qū)域覆蓋良好。外周血全外顯子變異全局總覽見圖1。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在9號染色體上DMRT1(chr9：841647-969090)基因發(fā)生了突變，具體為堿基T突變?yōu)锳 (chr9：841971)，導致其所編碼的氨基酸由S(絲氨酸)變?yōu)榱薚(蘇氨酸)。WNT4基因的剪切區(qū)發(fā)生了突變(chr1:22453975)，堿基C突變?yōu)镚。

圖1 變異全局

從最外層到最內(nèi)層依次是：(1)第一圈為染色體名稱。(2)第二圈為SNP密度(1Mb，曲線)，并對密度進行了歸一化。(3)第三圈為測序深度，并進行歸一化，小于0.25綠色，大于0.75紅色，其他灰色。(4)第四圈為不同類型的SV，深綠色代表插入，深藍色代表缺失，深紅色代表擴增(淺綠，淺藍，淺紅為對應的背景色)；(5)第五圈為InDel：藍色為插入，黃色為缺失。

討論

46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征由1964年由Delachapella[2]首次報道，發(fā)病率極低，約90%的患者Y染色體性別決定基因(sex-determining region on the Y chromosome，SRY)為陽性，僅10%左右為SRY陰性[3]，其關鍵特征為“性腺性別與染色體性別不相符”，但目前對此病的了解十分有限。兒童患者常因外生殖器發(fā)育異常如尿道下裂、隱睪和生殖器畸形等就診，而成年男性患者多因不育、性腺功能減退、乳房發(fā)育等就診[4.5]。本病例出生時曾因尿道下裂行手術治療，當時未作染色體等檢查，婚后因不育行精液檢查發(fā)現(xiàn)無精子癥，進而行染色體核型分析從而確診。因此，對于外生殖器發(fā)育異常者進行染色體分析在本病的診斷中具有重要的臨床意義。

人類性別決定的關鍵因素尚未完全闡明，大多數(shù)學者認為Y染色體及其中的睪丸決定因子在人類性別決定中扮演關鍵的角色，但其發(fā)病機制并不完全清楚。研究表明，Y染色體易位或是Y染色體缺失伴SRY基因易位是導致本病的最主要原因[6]。但在本研究中，G顯帶核型分析及CNVs分析并未發(fā)現(xiàn)與Y染色體可能相關的標記染色體及DNA序列，且SRY基因、AZFa、b、c均缺失，基本可排除因Y染色體易位或SRY基因易位的致病原因。早期研究中，Mcelreavey K等推測[7]，由于促使睪丸發(fā)育的基因調(diào)控機制發(fā)生了隱性突變，致使在無SRY基因存在時睪丸也能發(fā)育，此類患者可能為常染色體隱性突變所致，或是常染色體、X染色體上存在未知的性分化決定基因。亦有可能其SRY基因局限于睪丸組織內(nèi)，而外周血DNA分析檢測不出致性反轉(zhuǎn)的基因變異[8]，該假設有待于進一步證實。

隨著細胞分子生物學研究技術的不斷進步，調(diào)控人類性別發(fā)育的基因逐步被發(fā)現(xiàn)，目前已知的有SOX基因家族、DMRT基因、WNT4及RSP1基因等[9]。

性反轉(zhuǎn)相關的報道中較多的為SOX基因家族異常，而對DMRT及WNT4基因異常的報道罕見。DMRT基因簇定位于9p24.3，包括DMRT1、DMRT2、DMRT3基因[10]。DMRT1基因位于9(chr9：841647-969090)，它具有一個保守的DNA結合motif(具有特殊功能的蛋白質(zhì)分子超二級結構)，對性腺的發(fā)育和配子的形成扮演了決定性的作用。同時，DMRT1編碼了一個男性獨有的轉(zhuǎn)錄因子，在所有脊椎動物中起到調(diào)控睪丸分化的作用，該基因突變，可導致生殖細胞無法進行有絲分裂和生殖細胞的分化，影響精原細胞的產(chǎn)生，無法產(chǎn)生精子[9]。WNT4基因為WNT基因家族的一員，位于1p36.12，是一類前卵巢基因/抗睪丸基因，在性腺分化的過程中，其過量表達會抑制睪丸的分化，促進卵巢的分化[11.12]。本病例因不育就診，檢查時發(fā)現(xiàn)無精子癥，進一步檢查發(fā)現(xiàn)高促性腺激素性腺功能不全、染色體核型與社會性別不符，不同于常見的生精功能障礙。

本病例高通量全外顯子測序結果顯示，SOX5、SOX8和SOX10基因的外顯子區(qū)域發(fā)生了單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)突變，但是屬于同義突變，其編碼的氨基酸序列并未發(fā)生改變。而DMRT1基因外顯子區(qū)域發(fā)生了SNP的非同義突變，致使其轉(zhuǎn)錄的氨基酸發(fā)生了變化，此結果證實了DMRT1基因突變導致無精子癥。在傳統(tǒng)的觀念中，認為無精子癥是由于Y染色體的缺失致AZF缺失，導致生精障礙/無精子癥，此研究證實AZF缺失并非唯一導致無精子癥的原因。本病例發(fā)現(xiàn)WNT4基因剪切區(qū)的SNP突變，是導致了該基因失活、基因過量表達還是基因表達量降低，通過現(xiàn)有的方法無法明確。但結合患者的臨床表現(xiàn)、實驗室檢查結果以及分子生物學檢測結果，我們推測，該基因剪切區(qū)的突變，導致患者WNT4基因表達量降低或是WNT4基因失活的可能性較大，因此患者性腺分化為睪丸組織。

在檢測結果中，沒有發(fā)現(xiàn)其他性別分化相關基因的重要有義突變，也未發(fā)現(xiàn)SRY基因片段的存在。基于現(xiàn)有的研究結果可以明確，該患者在沒有Y染色體及性別決定相關基因的前提下，因WNT4剪切區(qū)的SNP突變可能導致其編碼產(chǎn)物表達水平的降低或引起WNT4基因失活，導致性腺分化為睪丸組織。同時，其無精子癥的原因是由于AZF缺失、DMRT1外顯子區(qū)域的非同義突變雙重作用導致其精原細胞無法分化產(chǎn)生精子。

對于臨床診斷的性反轉(zhuǎn)病例，進行基因診斷來明確致病原因有重要的意義。本研究采用高通量全外顯子測序技術對46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征進行基因診斷及發(fā)現(xiàn)DMRT1基因突變均為國內(nèi)首次報道。

綜上所述，SRY陰性的46,XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征是罕見的導致男性不育的疾病。本病例通過臨床、實驗室及分子技術檢測方法，在成功找到突變基因后推測了其發(fā)生性反轉(zhuǎn)的可能機制。隨著不育癥發(fā)病率的增高，對于無精子癥患者建議常規(guī)行生殖激素測定、染色體核型、Y染色體微缺失檢測，必要時作CNVs及全外顯子測序，尤其兒童期如發(fā)現(xiàn)外生殖器異常應及時行染色體核型分析，避免誤診漏診。對于該類有生育要求的患者，因其伴發(fā)的睪丸原發(fā)性生精障礙患者生育仍是一個難題，可采用供精助孕獲得后代。但由于現(xiàn)有方法的局限性，無法確定WNT4基因剪切區(qū)的突變對基因表達的具體影響，還需進一步的研究。