LncRNA基因調(diào)節(jié)的炎癥信號通路在早期自然流產(chǎn)中的作用

張敏 徐清華 許鵬宇 李冬秀

早期流產(chǎn)是指在妊娠12周以前發(fā)生腹痛、陰道流血的現(xiàn)象，主要癥狀為陰道流血不多，下腹部疼痛不嚴(yán)重。早期流產(chǎn)時(shí)，絨毛與子宮底蛻膜的聯(lián)系尚不牢固，常先有陰道流血，然后伴有陣發(fā)性下腹疼痛。出血由于絨毛和蛻膜分離，血竇開放引起，而腹痛由于宮腔積血刺激子宮收縮所致。早期流產(chǎn)給家庭和社會經(jīng)濟(jì)帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。早期自然流產(chǎn)屬于早期流產(chǎn)中的一種，往往與遺傳因素有關(guān)，最近有研究表明LncRNA基因與Treg/Th17等表達(dá)失衡有關(guān)[1-3]。而Treg/Th17的失衡又被證實(shí)與早期自然流產(chǎn)有關(guān)[4-7]，由此可推測LncRNA基因調(diào)節(jié)的炎癥信號通路參與了早期自然流產(chǎn)的發(fā)展過程，但目前缺乏相關(guān)研究證實(shí)，為此我們設(shè)計(jì)了本研究。

對象與方法

1.對象：收集我院2013—2017年收治的早期自然流產(chǎn)患者198例作為病例組，同期收集至我院的正常早孕行人工流產(chǎn)婦女50例作為對照組。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)頭臀部長度≥7 mm時(shí)無胎心搏動(dòng)；(2)妊娠囊直徑≥25 mm；(3)無卵黃囊的妊娠囊在11 d或更長時(shí)間后未見胚胎和胎心搏動(dòng)；(4)超聲顯示無卵黃囊的妊娠囊未見胚胎及胎心搏動(dòng)≥2周；(5)孕十二周內(nèi)出現(xiàn)難免流產(chǎn)；(6)年齡18～46歲；(7)同意參與本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷不明確；(2)生殖系統(tǒng)結(jié)核等其他重大病變；(3)外傷等明確誘因?qū)е碌脑缙诹鳟a(chǎn)；(4)惡性腫瘤；(5)既往流產(chǎn)史。對照組為正常早孕行人工流產(chǎn)婦女，年齡為18～46歲之間，均無全身系統(tǒng)性疾病的健康女性。本研究已經(jīng)征得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.檢測方法：TRIzol法提取絨毛組織中RNA，260～280nm處測定光密度值，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，利用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)相應(yīng)內(nèi)參，SYBR法進(jìn)行pPCR，pPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15秒，60℃退火延伸60秒，40循環(huán)。2-△△t法計(jì)算H19 LncRNA相應(yīng)含量。RIPA法提取絨毛組織中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，Western blot法測定ZEB1相對表達(dá)量。取靜脈血5ml，密度梯度離心法分離組織中淋巴細(xì)胞，PBS溶液洗滌3次，加入相對應(yīng)的單克隆抗體，室溫反應(yīng)30min后，利用Epics XL型流式細(xì)胞儀(美國Beckman coulter公司)檢測Treg/Th17表達(dá)量。不同患者的指標(biāo)檢測分批檢測，不同批次之間已經(jīng)由我院檢驗(yàn)科進(jìn)行質(zhì)控。觀察指標(biāo)包括(1)絨毛組織中H19 LncRNA和ZEB1相對表達(dá)量。(2)年齡、孕周、身體體重指數(shù)、停經(jīng)天數(shù)、孕囊直徑。

結(jié)果

1.兩組一般資料比較：兩組年齡、身體體重指數(shù)、孕囊直徑、停經(jīng)天數(shù)和孕周等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.兩組絨毛組織中H19 LncRNA相對表達(dá)量：病例組H19 LncRNA相對表達(dá)量低于對照組，見表2。

表2 兩組絨毛組織中H19 LncRNA相對表達(dá)量

*P<0.05，與對照組相比

3.兩組絨毛組織中ZEB1相對表達(dá)量：病例組ZEB1相對表達(dá)量低于對照組(0.24±0.15 vs.0.45±0.14,P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組絨毛組織中ZEB1相對表達(dá)量

4.兩組外周血中Treg/Th17表達(dá)量：與對照組比較，病例組Treg水平顯著降低；Th17顯著增高。見表3。

表3 兩組外周血中Treg/Th17表達(dá)量

*P<0.05，與對照組相比

5.早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織中H19 LncRNA、ZEB1與Th17、Treg的相關(guān)性：Pearson線性相關(guān)性分析：顯示H19 LncRNA、ZEB1與Treg顯著正相關(guān)(r=0.256和0.241，P<0.05)，與Th17顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.243和-0.228，P<0.05)。

討論

自然流產(chǎn)的發(fā)生率高達(dá)15%。發(fā)生在12周以前的流產(chǎn)定義為早期流產(chǎn)，妊娠12周至28周的流產(chǎn)則稱為晚期流產(chǎn)。早期自然流產(chǎn)多數(shù)與遺傳因素有關(guān)，部分患者可反復(fù)早期自然流產(chǎn)。本研究探討了LncRNA基因調(diào)節(jié)的炎癥信號通路在早期自然流產(chǎn)中的作用，結(jié)果顯示與自愿選擇流產(chǎn)的正常孕婦相比，早期自然流產(chǎn)的H19 LncRNA相對表達(dá)量、ZEB1相對表達(dá)量降低，且H19 LncRNA、ZEB1與Treg顯著正相關(guān)，與Th17顯著負(fù)相關(guān)。

目前研究已經(jīng)證實(shí)，早期自然流產(chǎn)的患者存在Th17/Treg的平衡失調(diào)，表現(xiàn)為Th17增高，而Treg降低[8]。Th17/Treg的平衡失調(diào)可以誘導(dǎo)大量的Th1型細(xì)胞因子分泌，對胚胎的著床、植入和胎兒生存尤為不利。Th17是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠分泌白介素17的T 細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要的意義。β 轉(zhuǎn)化生長因子、白介素-6、白介素-23 和白介素-21 在Th17 細(xì)胞的分化形成過程中起著積極的促進(jìn)作用，而γ 干擾素、白介素-4、細(xì)胞因子信號傳送阻抑蛋白3和白介素-2則抑制它的分化。Treg是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞亞群，可分為天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，另外尚有CD8 Treg、NKT細(xì)胞等，與自身免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切，其異常表達(dá)可導(dǎo)致自身免疫性疾病。Treg降低時(shí)常常表現(xiàn)為炎癥擴(kuò)大。本研究中顯示與自愿選擇流產(chǎn)的正常孕婦相比，早期自然流產(chǎn)的Th17增高，而Treg降低，說明早期自然流產(chǎn)的患者體內(nèi)存在慢性炎癥，這種慢性炎癥不利于胚胎的著床、植入，從而誘導(dǎo)流產(chǎn)[5,7,9-12]。由上可見，Th17/Treg的平衡失調(diào)參與了早期自然流產(chǎn)的發(fā)生和發(fā)展過程。

另有研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)異常表達(dá)可以擾亂Th17/Treg的平衡[1-3,13,14]，提示LncRNA可以間接通過影響Th17/Treg的平衡，從而參與了早期自然流產(chǎn)的發(fā)生過程。LncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼 RNA。LncRNA 在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，成為遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。曾有研究初步表明LncRNA的異常表達(dá)可能與早期自然流產(chǎn)有關(guān)[15]。我國學(xué)者胡煉等研究也表明了ZEB1在早期自然流產(chǎn)的患者中低表達(dá)，但與本研究不同的是，該研究中H19 LncRNA在早期自然流產(chǎn)患者中雖有降低趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與研究樣本量不足有關(guān)[16]。此外，上述研究未對LncRNA介導(dǎo)早期自然流產(chǎn)的機(jī)制進(jìn)行探討，本研究發(fā)現(xiàn)H19 LncRNA和ZEB1的低表達(dá)與Treg顯著正相關(guān)，與Th17顯著負(fù)相關(guān)，提示了LncRNA的異?？赡苁峭ㄟ^調(diào)控Th17/Treg的平衡失調(diào)，進(jìn)而參與了早期自然流產(chǎn)的發(fā)生和發(fā)展過程。研究提示或許通過調(diào)節(jié)LncRNA基因的表達(dá)水平，可以減少早期自然流產(chǎn)率，但目前這方面尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究的主要不足是對照組病例數(shù)相對較少，未對其進(jìn)行干預(yù)治療，尚需深入的研究證實(shí)調(diào)節(jié)LncRNA基因表達(dá)水平是否有益于改善孕婦預(yù)后，減少早期流產(chǎn)。

綜上所述，絨毛組織中H19 LncRNA、ZEB1的低表達(dá)與早期自然流產(chǎn)和Th17/Treg免疫失衡有關(guān)。