食管鱗狀細(xì)胞癌類器官的應(yīng)用

劉卓健， 周 博， 段芳齡

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 鄭州大學(xué)消化疾病研究所，河南 鄭州 450014

食管癌是一種高度惡性的腫瘤，在我國，尤其是河南、河北、廣東以及江蘇等省份，發(fā)病率明顯較高。據(jù)2019年中國腫瘤登記年報(bào)統(tǒng)計(jì)，全國食管癌的發(fā)病率和死亡率分別排在第6位和第4位。在我國食管癌的組織類型以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC)為主，多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，預(yù)后較差且療效存在明顯的個(gè)體差異。因此，深入了解ESCC的發(fā)病機(jī)制，為ESCC患者提供精準(zhǔn)診療，仍是臨床治療工作的重中之重。

類器官是利用體外3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在三維環(huán)境中培養(yǎng)后得到的多細(xì)胞團(tuán)，具有近似源器官的結(jié)構(gòu)和功能[1]。腫瘤類器官主要來自胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，利用細(xì)胞因子來引導(dǎo)細(xì)胞分裂和定向分化。細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)組成干細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，是類器官更新和分化的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過人為調(diào)控培養(yǎng)系統(tǒng)的成分，由細(xì)胞自主的分化為特定結(jié)構(gòu)，完成類器官自組裝過程。該培養(yǎng)方法不僅能夠?qū)崿F(xiàn)體外長時(shí)間增殖，還具有多次傳代后仍能保持基因組特征和異質(zhì)性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。因此，類器官技術(shù)在構(gòu)建疾病模型、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究、藥物篩選和個(gè)體化治療研究、干細(xì)胞研究等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前為止，人類已經(jīng)在一系列惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞，繼而成功建立人前列腺癌、胃癌、胰腺導(dǎo)管癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等腫瘤類器官的培養(yǎng)方法[2]。由于ESCC干細(xì)胞缺乏特異性的表面標(biāo)志物，導(dǎo)致有關(guān)ESCC類器官的研究才剛剛起步。直到2018年，Kijima等[3]才從ESCC患者組織中定向誘導(dǎo)并鑒定成功為ESCC類器官。本文就ESCC類器官技術(shù)的構(gòu)建和應(yīng)用作一概述。

1 ESCC類器官技術(shù)的成功構(gòu)建

早在2009年，Hans Clevers和其實(shí)驗(yàn)室的博士后Sato用來源于小鼠腸道的成體干細(xì)胞培育出首個(gè)腸道類器官，隨后基于這種腸道干細(xì)胞建立起一種新的體外培養(yǎng)方式[4]，即小腸類器官培養(yǎng)，通過在基質(zhì)膠中加入特殊的生長因子，模擬體內(nèi)環(huán)境，最終形成具有腸上皮各種類型細(xì)胞及腸腔形態(tài)的類器官，既保留了腸上皮細(xì)胞原始分化的能力，又能對(duì)其進(jìn)行長期體外培養(yǎng)。這是干細(xì)胞及類器官領(lǐng)域的一大技術(shù)進(jìn)步，是一個(gè)里程碑事件。

采用三維培養(yǎng)系統(tǒng)，以基底膜提取物(basement membrane extract，BME)作為細(xì)胞外基質(zhì)，加入Wnt3a、R-spondin-1、Noggin、EGF、FGF10、SB202190、A83-01、B27、煙酰胺等因子進(jìn)行培養(yǎng)，構(gòu)建食管腺癌類器官。從患者活檢組織中，Kijima已成功建立ESCC類器官的方法[3]。他們用組織消化液對(duì)ESCC活檢組織進(jìn)行消化，37 ℃，45 min孵育。每毫升組織消化液中主要包括6.25 mg/ml中性蛋白酶Ⅰ(Dispase Ⅰ)，5 mg/ml膠原酶(Collagenase)，10 mmol/L ROCK 抑制劑和0.5 mg/ml兩性霉素B(fungizone)。孵育后重懸細(xì)胞并離心，再用質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰酶(含EDTA)消化液孵育(37 ℃，10 min)后，用含250 mg/L大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean trypsin inhibitor)的PBS溶液中和胰酶消化。細(xì)胞懸液用70 μm細(xì)胞篩進(jìn)行過濾后，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。DMEM/F12完全培養(yǎng)基中主要包含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，HEPES。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用50 μl Matrigel包含2×104個(gè)細(xì)胞均勻鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板板內(nèi)底部，待凝固后，再添加500 μl類器官培養(yǎng)基。類器官培養(yǎng)基主要包含DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1×N2，1×B27，0.1 mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)，50 ng/ml重組人EGF，2% Noggin/R-Spondin-1，100 ng/ml重組人Wnt3a，500 nmol/L A83-01，10 nmol/L SB202190，10 nmol/L 胃泌素(Gastrin)、10 nmol/L 煙酰胺(Nicotinamide)和10 mmol/L Y27632。常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)10～14 d，期間需用倒置相差顯微鏡定時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)、數(shù)量和直徑；用臺(tái)盼藍(lán)染色以確定細(xì)胞活力；用含有Dispase Ⅰ的Matrigel將細(xì)胞球消化，固定后進(jìn)行組織學(xué)檢查鑒定，觀察第14天50 mm的細(xì)胞球的總量。

2 ESCC類器官的應(yīng)用

類器官不僅是研究組織及腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的有效工具，還能用于藥物療效和藥物毒理學(xué)性質(zhì)的檢測(cè)，有助于發(fā)展藥敏檢測(cè)和個(gè)體化治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著食管腺癌類器官的深入研究，對(duì)其概述形態(tài)學(xué)、基因組學(xué)和原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)錄圖譜包括驅(qū)動(dòng)基因、點(diǎn)突變、拷貝數(shù)、變異序列和方式以及核型分析已經(jīng)證實(shí)反映原發(fā)性腫瘤克隆結(jié)構(gòu)的多克隆性有了更加清晰的認(rèn)知。

2.1 正常組織的鱗狀上皮異型分化的研究腫瘤從發(fā)生、發(fā)展到惡化、轉(zhuǎn)移及藥物抵抗是一個(gè)多因素、多階段、多步驟和多環(huán)節(jié)相互聯(lián)系的漸進(jìn)過程，而利用類器官技術(shù)建立不同演變階段的腫瘤模型，可以為各階段機(jī)制研究工作提供可用的優(yōu)質(zhì)平臺(tái)。

對(duì)于正常上皮組織而言，上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的極性，即細(xì)胞的兩端在結(jié)構(gòu)和功能上具有明顯的差別。細(xì)胞極性是在多細(xì)胞生物中廣泛存在的重要特征之一，通?？梢酝ㄟ^細(xì)胞形態(tài)即可辨別。上皮細(xì)胞的一面朝向身體表面或有腔器官的腔面，稱頂端(游離面)；與頂端相對(duì)的另一面朝向深部的結(jié)締組織，稱基底端(基底面)。上皮細(xì)胞的頂端和基底端的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的差別保證了充分發(fā)揮其外分泌、吸收、屏障等生理功能。同時(shí)，細(xì)胞極性的形成是在誘導(dǎo)劑刺激下，由細(xì)胞骨架、緊密連接、橋粒等介導(dǎo)并重新排列，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或分子呈不對(duì)稱分布。食管腺癌類器官模型讓研究者們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞極性中斷現(xiàn)象[5]。

以食管腺癌類器官構(gòu)建為例，細(xì)胞來源于食管腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本。食管黏膜上皮為未角化復(fù)層扁平鱗狀上皮，其中基底層由具有增生能力的處于不同分化階段的未成熟細(xì)胞組成，各細(xì)胞層之間形成分化梯度[6]。正常食管黏膜依靠表層細(xì)胞的分化、基底細(xì)胞的分裂以及分化梯度之間相互平衡維持上皮細(xì)胞組織的穩(wěn)態(tài)。但化學(xué)致癌物、輻射、酸、生長因子、炎性細(xì)胞等諸多因素均可以打破這一精細(xì)平衡，導(dǎo)致上皮細(xì)胞發(fā)生惡性分化，包括成熟細(xì)胞的反分化、未成熟細(xì)胞的異常分化和抑制正常細(xì)胞的分化。正常鱗狀細(xì)胞分化異常是ESCC發(fā)生的重要機(jī)制之一[7]。鱗狀上皮非典型增生為ESCC常見的組織學(xué)癌前病變，小鼠ESCC類器官模型與細(xì)胞譜系追蹤技術(shù)相結(jié)合，表明ESCC的癌前細(xì)胞來源于基底角質(zhì)層[8]；該模型與蛋白質(zhì)分析技術(shù)相結(jié)合，能夠確認(rèn)影響癌前細(xì)胞與侵襲相關(guān)的表皮生長因子受體(EGFR)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)[9]。

2.2 干細(xì)胞相關(guān)研究類器官是指由具有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞進(jìn)行體外三維培養(yǎng)后形成的細(xì)胞團(tuán)，該細(xì)胞團(tuán)不僅能夠進(jìn)行長期傳代培養(yǎng)，其具有自我更新和自我組裝的能力，并表現(xiàn)出穩(wěn)定的表型和遺傳學(xué)特性，顯示出與來源組織相似的結(jié)構(gòu)和功能[1,10]。類器官培養(yǎng)依賴于胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有多胚層分化能力，體外培養(yǎng)時(shí)能夠無限增殖和多向分化[11]；而誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在刺激物的誘導(dǎo)下，也具有多向分化能力。ESCC干細(xì)胞與ESCC早期復(fù)發(fā)有著密切的關(guān)聯(lián)，這類細(xì)胞表面具有CD44高表達(dá)的特點(diǎn)[12]。因此，類器官可以作為食管與ESCC干細(xì)胞研究的重要平臺(tái)，進(jìn)而推動(dòng)食管上皮干細(xì)胞增殖分化及ESCC發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究。

2.3 類器官技術(shù)與其他新技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用深入探索腫瘤發(fā)生機(jī)制目前，研究者們已經(jīng)對(duì)食管腺癌類器官進(jìn)行全基因組測(cè)序和分析、染色體多重核型分析、RNA序列測(cè)序等工作，并對(duì)食管腺癌類器官的基因組信息、轉(zhuǎn)錄圖譜、驅(qū)動(dòng)基因序列和位置、點(diǎn)突變序列和位置、拷貝數(shù)改變和核型多克隆性等諸多方面進(jìn)行了注釋。表明類器官培養(yǎng)技術(shù)能為研究腫瘤發(fā)生機(jī)制方面提供豐富的數(shù)據(jù)和資源信息[5]。雖然目前對(duì)于ESCC類器官與測(cè)序技術(shù)聯(lián)合使用鮮有報(bào)道。但對(duì)臨床368例ESCC患者組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，通過對(duì)其基因特征和腫瘤相關(guān)信號(hào)途經(jīng)分析，能夠成功將癌細(xì)胞與其他異質(zhì)性細(xì)胞區(qū)分[13]。未來，我們期待ESCC類器官能夠與測(cè)序技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，為其發(fā)病機(jī)制探索提供更多的數(shù)據(jù)和信息。在ESCC的動(dòng)物模型方面，已出現(xiàn)p27敲除小鼠[14]。研究者們利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了基因突變小鼠結(jié)腸癌類器官[15]，這種基于類器官培養(yǎng)技術(shù)和基因編輯技術(shù)聯(lián)合使用可以用于小鼠類器官模型構(gòu)建，期待這一技術(shù)在ESCC類器官培養(yǎng)中發(fā)揮作用。

2.4 ESCC高度異質(zhì)性與個(gè)體化治療ESCC的高度異質(zhì)性不僅表現(xiàn)在不同患者之間，還表現(xiàn)在同一患者不同病灶之間，甚至同一病灶的不同時(shí)間。而ESCC類器官具有體外多次傳代后基因組仍然保持穩(wěn)定的明顯優(yōu)勢(shì)，能夠幫助我們更深入地了解其異質(zhì)性。研究者們對(duì)ESCC臨床樣本進(jìn)行基因組分析后顯示，ESCC的異質(zhì)性以瘤間和瘤內(nèi)兩種形式呈現(xiàn)，瘤間異質(zhì)性指的是不同患者的腫瘤表型和分子差異，瘤內(nèi)異質(zhì)性是指同一腫瘤內(nèi)的生物變異[16]。ESCC的異質(zhì)性主要表現(xiàn)在基因組和表觀基因組層面?；蚪M層面主要是體細(xì)胞突變、拷貝數(shù)改變、染色質(zhì)重排等[17]；而表觀基因組表現(xiàn)在微環(huán)境變化和修飾變化等方面[18]。Kijima等[3]成功從臨床患者活檢組織中構(gòu)建了ESCC類器官的系統(tǒng)，然而，鑒于腫瘤微環(huán)境的重要性，對(duì)ESCC類器官系統(tǒng)仍需繼續(xù)優(yōu)化相關(guān)分化因子、基底細(xì)胞和免疫細(xì)胞等成分，才能夠真實(shí)地再現(xiàn)ESCC整體的異質(zhì)性[8]。

對(duì)于早中期ESCC患者來說，可以先接受新輔助放化療，再評(píng)估是否接受手術(shù)治療。與單獨(dú)手術(shù)相比，新輔助放化療確實(shí)能夠提高患者的總體生存率。約有25%的患者對(duì)新輔助放化療表現(xiàn)出敏感，但也有約20%的患者對(duì)新輔助放化療不敏感。目前，胰腺癌類器官模型已經(jīng)輔助臨床患者制定個(gè)體化的治療方案[19]。

Banki等[20]將10個(gè)食管腺癌患者來源的類器官對(duì)24種抗癌化合物的藥物敏感性，與臨床體內(nèi)敏感性進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示一致。提示患者來源的腫瘤類器官具有一定的藥物選擇和療效預(yù)測(cè)能力，有望利用該平臺(tái)預(yù)測(cè)不同患者的藥物反應(yīng)并展開個(gè)體化治療[5]。參考食管腺癌類器官的藥物敏感性，ESCC類器官的高通量藥敏實(shí)驗(yàn)也需要注意由于類器官與原發(fā)腫瘤生長的微環(huán)境存在客觀差異可能導(dǎo)致對(duì)藥物敏感性出現(xiàn)偏差以及治療過程中產(chǎn)生的耐藥性等問題，提示在ESCC類器官的培養(yǎng)系統(tǒng)方面仍有很大的優(yōu)化空間。

2.5 類器官技術(shù)與循環(huán)腫瘤細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用提示臨床病程發(fā)展循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是指因自發(fā)或診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的一類腫瘤細(xì)胞[21]。CTCs的絕對(duì)數(shù)量、數(shù)量變化、細(xì)胞表型、擴(kuò)增能力、組學(xué)分析、藥敏測(cè)試等參數(shù)，正與腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、分級(jí)、癌癥預(yù)后、治療方案指導(dǎo)、藥物反應(yīng)監(jiān)測(cè)等臨床工作建立起愈來愈多的聯(lián)系。但CTCs在外周血中存在的數(shù)量極少，捕獲率較低；捕獲后也存在小片段DNA干擾等諸多缺陷，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。目前，研究者們將前列腺患者外周血中的CTCs用類器官技術(shù)加以培養(yǎng)，已經(jīng)成功建立了前列腺腫瘤類器官模型[22]，表明類器官技術(shù)不僅適用于細(xì)胞數(shù)量較大的樣本，同樣也適用于細(xì)胞數(shù)量稀少的CTCs。

研究者們對(duì)90例食管癌患者外周血中的CTCs進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及后期隨訪后發(fā)現(xiàn)，CTCs數(shù)量多的患者生存期明顯短于CTCs數(shù)量少的患者[20]。這表明，CTCs能夠作為食管癌患者術(shù)后的復(fù)查指標(biāo)，其絕對(duì)數(shù)量的多少可在一定程度上提示病情的發(fā)展。CTCs成功用于前列腺腫瘤類器官的建立，提示其他腫瘤，包括ESCC，患者CTCs可作為類器官培養(yǎng)的細(xì)胞來源，為ESCC的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和評(píng)估及精準(zhǔn)治療方面帶來更大的價(jià)值。

目前，食管癌方面，類器官培養(yǎng)技術(shù)以食管腺癌方面的研究較為全面和深入，包括組織病理學(xué)、基因組學(xué)、克隆動(dòng)力學(xué)及中等通量藥敏試驗(yàn)，這對(duì)于今后ESCC類器官的科學(xué)研究和臨床治療具有重要的參考價(jià)值。但以上工作在ESCC類器官方面尚處于起步階段，仍有許多問題有待進(jìn)一步探究，如：ESCC類器官的體外培養(yǎng)環(huán)境與腫瘤在體內(nèi)的微環(huán)境差異；ESCC類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中暫無涉及體內(nèi)的免疫成分和血管成分，培養(yǎng)體系仍需進(jìn)一步優(yōu)化；對(duì)于ESCC患者手術(shù)切除組織培養(yǎng)的成功率還有待提高；利用ESCC類器官所進(jìn)行的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果仍需進(jìn)一步與臨床結(jié)合等。