豆莢蛋白與心血管疾病的研究進(jìn)展

盧金鑫 曾建平

近幾十年來治療心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的有效藥物和介入手段不斷增加，但CVD仍然是許多國家的頭號致死病因[1]。在中國，心力衰竭、慢性缺血性心肌病與AMI是CVD中3種最常見的死亡病因[2]。動脈粥樣硬化是最常見的CVD，研究[3]證實(shí)動脈粥樣硬化的形成包括巨噬細(xì)胞遷移、平滑肌細(xì)胞增殖、大量膠原纖維、彈力纖維和蛋白多糖等結(jié)締組織基質(zhì)形成，以及細(xì)胞內(nèi)外脂質(zhì)積聚等。豆莢蛋白(legumain),又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶，最初在豆類植物(legumainous plants)種子中發(fā)現(xiàn)的。隨后在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了legumain，其基因定位于14號染色體[4]。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)其與動脈粥樣硬化、ACS、肺動脈高壓等多種CVD相關(guān)，以legumain為靶點(diǎn)進(jìn)行的疾病診斷標(biāo)志物和藥物靶向性等的研究不斷取得進(jìn)展。本文就legumain在CVD中的表達(dá)特點(diǎn)、意義、診斷應(yīng)用和相關(guān)靶向性研究進(jìn)行綜述。

1 legumain概述

1.1 legumain的發(fā)現(xiàn)與來源 legumain是半胱氨酸蛋白酶家族新成員[5]，最初由Kembhavi等[6]從豇豆種子和刀豆中分離出來，所以將其命名為legumain。隨后，研究者相繼發(fā)現(xiàn)在某些寄生蟲(曼氏血吸蟲、線蟲、蜱)和哺乳動物(人、鼠、豬)體內(nèi)均有l(wèi)egumain的表達(dá)。之后的研究[7]進(jìn)一步證實(shí)，legumain還參與了植物的超敏反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、種子貯存蛋白的沉積和哺乳動物機(jī)體的免疫、溶骨、腫瘤等多個病理生理過程。

1.2 legumain的基本生物學(xué)特性 legumain位于溶酶體內(nèi)，是一種具有高度特異性的的天冬酰胺內(nèi)肽酶，其前體酶原由3部分組成，分別是信號肽、前體肽和含有成熟蛋白酶活性中心的催化域[8]。測序結(jié)果顯示，人類legumain的編碼基因定位于人染色體14q32.1，其相對分子質(zhì)量為49 000，由433個氨基酸殘基組成，去糖基化后得到具有生物活性的成熟legumain，其相對分子質(zhì)量為36 000[9]。正常條件下，legumain在人體僅低水平表達(dá)，在pH值為3～6的酸性環(huán)境中被活化，pH值>6時變得不穩(wěn)定[9]。legumain在哺乳動物細(xì)胞里的具體轉(zhuǎn)運(yùn)過程：先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，然后以相對分子質(zhì)量為56 000的前驅(qū)酶形式轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，在溶酶體或者酸性內(nèi)質(zhì)體中激活成相對分子質(zhì)量為47 000或46 000的中間態(tài)legumain，并在應(yīng)激狀態(tài)下經(jīng)過進(jìn)一步的酶(可能是組織蛋白酶)處理成為成熟活躍的相對分子質(zhì)量為36 000 的legumain形式[10]。

2 legumain與CVD的關(guān)系

2.1 legumain參與CVD的病理生理過程 legumain的主要病理生理作用是參與抗原呈遞，Ju等[11]發(fā)現(xiàn)，重組legumain具有抵抗肝吸蟲患者血清抗原的作用。在哺乳動物中，legumain主要參與處理自身和外源蛋白質(zhì)并呈遞給主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)，既可通過破壞自身蛋白產(chǎn)生耐受性，也可對外來抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答[12-13]。legumain可以催化T細(xì)胞表面抗原決定簇的產(chǎn)生和清除[14]，也是免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要因子，有研究[15]結(jié)果表明，legumain可以通過蛋白水解激活先天免疫系統(tǒng)的Toll樣受體(toll-like receptors，TLR)。legumain可以啟動去除MHCⅡ的恒定鏈伴侶，不僅影響蛋白的產(chǎn)生，還影響MHCⅡ的活化[16]。綜上所述，legumain參與了機(jī)體免疫過程中的抗原加工呈遞和免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.2 legumain在CVD中的表達(dá)特點(diǎn) 近年的研究[17-18]結(jié)果表明，legumain在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，能誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移和聚集，參與CVD的發(fā)生、發(fā)展。在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，legumain在巨噬細(xì)胞中特異性表達(dá)。體外研究[4,7]發(fā)現(xiàn)，legumain能誘導(dǎo)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用，從而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。Clerin等[18]的研究證明，legumain具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移的能力；而legumain可能通過調(diào)控TLR4、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白3(Smad3)、蛋白激酶B(Akt)等信號通路，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞成熟和遷移，增強(qiáng)炎性反應(yīng)，促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展[17,19]。研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶L是被legumain激活后表達(dá)最顯著的一種酶，legumain能將相對分子質(zhì)量為30 000的組織蛋白酶L加工成25 000的活性形式，在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)高表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡。另一項(xiàng)研究[22]結(jié)果顯示，在胸主動脈粥樣硬化斑塊中l(wèi)egumain主要在單核-巨噬細(xì)胞胞核、細(xì)胞質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)表達(dá)，而在成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中僅有少量表達(dá)。其他研究[23-24]結(jié)果表明，legumain可通過在巨噬細(xì)胞高表達(dá)、誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞遷移和激活組織蛋白酶L等方式參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。

此外，缺氧環(huán)境也是legumain高表達(dá)的重要原因之一[25]。細(xì)胞內(nèi)天然半胱氨酸蛋白酶抑制物E/M(cystatin E/M)，又稱cystatin6(CST6)，是legumain最有效的內(nèi)源性抑制劑，cystatin E/M可以調(diào)節(jié)legumain在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的加工，以及l(fā)egumain前體在酸性pH值下的自動激活和分泌[26-27]。而cystatin E/M在CVD組織中表達(dá)缺失可能也是legumain在病理組織中高表達(dá)的原因之一[28]。legumain在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的過程中，能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，調(diào)節(jié)白細(xì)胞游走，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡[4,29]。而ECM的降解是通過基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)和絲氨酸等蛋白酶進(jìn)行的，該過程可以促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的破裂。研究[17，20，30]發(fā)現(xiàn)，legumain可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶前體(proMMP)2和組織蛋白酶B、H和L，也可直接增加ECM中的蛋白(如纖連蛋白)水解，從而促進(jìn)ECM降解。還有研究[31-32]發(fā)現(xiàn)，legumain和細(xì)胞自噬關(guān)系密切。Legumain過表達(dá)可以降低半胱天冬酶3、半胱天冬酶9和Bax的表達(dá)，并且促進(jìn)自噬小體微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和酵母自噬相關(guān)基因Atg6的同源物(Beclin1)的表達(dá)，抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的巨噬細(xì)胞的凋亡, 增加巨噬細(xì)胞活性和粥樣斑塊的易損性。

2.3 legumain與CVD的臨床表現(xiàn)與預(yù)后 在動脈粥樣硬化、肺動脈高壓和冠心病等CVD的組織中，legumain高表達(dá)可能與患者的預(yù)后有關(guān)。legumain和組織蛋白酶L表達(dá)增加與動脈粥樣硬化中斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)[4,19,33]。另外，legumain和Smad3在動脈粥樣硬化斑塊巨噬細(xì)胞中的表達(dá)呈線性關(guān)系，經(jīng)他汀類藥物治療后兩者均減弱，提示legumain參與動脈粥樣硬化的機(jī)制可能與Smad3通路相關(guān)[33]。巨噬細(xì)胞起源的legumain可以導(dǎo)致肺動脈高壓發(fā)生，其機(jī)制是通過激活MMP2/轉(zhuǎn)化生長因子β1信號通路[34]。一項(xiàng)包括345例受試者的研究[25]證明，頸動脈粥樣硬化斑塊患者血漿中的legumain水平與健康對照組相比顯著升高。而斑塊不穩(wěn)定區(qū)域的legumain與穩(wěn)定區(qū)域相比較，其總量和活性均超出2倍以上[20]。此外，有研究結(jié)果[35]表明，急性腎損傷時legumain在腎近端小管上皮中高表達(dá)，并與急性腎損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。這些都說明組織或血漿中l(wèi)egumain的濃度可作為預(yù)測CVD預(yù)后的新指標(biāo)。

研究[36-37]發(fā)現(xiàn)，legumain可作為ACS患者的診斷指標(biāo)。國外有學(xué)者指出，血清legumain水平與特發(fā)性肺動脈高壓的嚴(yán)重程度高度相關(guān)[34]；legumain還可能是阿霉素心臟毒性的早期生物標(biāo)志物[38]；主動脈瘤患者的血清legumain和組織蛋白酶L水平顯著升高，并與病變大小、斑塊易損性和炎癥標(biāo)志物相關(guān)[33]。最近，Hong等[39]利用legumain特異性的Ac-hAla-Pro-azaAsn肽合成了一種帶有熒光標(biāo)記的Michael受體抑制劑[激活蛋白(AP)1探針]，這種探針只有通過與legumain反應(yīng)后才會產(chǎn)生熒光，從而可以用于包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等多種活細(xì)胞的成像實(shí)驗(yàn)。legumain可能成為一個有吸引力的非侵入性分子成像靶點(diǎn)，用以判斷CVD患者的疾病程度和預(yù)后[40]。隨著可視化活性legumain的選擇性成像技術(shù)的發(fā)展[41]，其應(yīng)用前景值得期待。

3 legumain與 CVD的治療

3.1 legumain與他汀類藥物 他汀類藥物具有多效性，除降脂作用外還參與多種炎癥因子、炎癥通路的免疫過程 ，他汀類藥物治療可以顯著延緩甚至逆轉(zhuǎn)冠狀動脈斑塊形成，與其全面調(diào)節(jié)血脂和抗炎作用相關(guān)，其中部分機(jī)制與調(diào)控legumain密切關(guān)系[10,25,29,37]。研究[42-43]發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可引起巨噬細(xì)胞中的legumain mRNA表達(dá)下調(diào)，接受他汀類藥物治療的動脈瘤患者的組織蛋白酶L活性下降。阿托伐他汀治療12周后legumain基因表達(dá)顯著降低[43]。辛伐他汀可降低legumain在人肌管中的活性，是由于其抑制了羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶，導(dǎo)致相對分子質(zhì)量為56 000的legumain前驅(qū)酶減少，同時使legumain前驅(qū)酶從高爾基體向酸性pH值囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)功能出現(xiàn)障礙[10]。Smith等[10]研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可降低細(xì)胞中的葡萄糖濃度, 葡萄糖濃度降低時溶酶體的pH值升高，從而降低legumain前驅(qū)酶的生成和表達(dá)。陳少源等[37]發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)化瑞舒伐他汀治療(20 mg/d)可降低血清legumain濃度，顯著延緩甚至逆轉(zhuǎn)冠狀動脈斑塊形成，并且改善患者左心室功能，而且不良反應(yīng)無增加。

3.2 legumain可作為CVD藥物研制的靶點(diǎn) legumain是人體內(nèi)唯一一種天冬酰胺內(nèi)切酶，在CVD和腫瘤組織特異性高表達(dá)，這一表達(dá)特點(diǎn)為相關(guān)藥物的靶向性研究提供了新思路。目前已有研究[34]指出，legumain特有的抑制劑RR-11a能顯著減輕肺動脈高壓，因?yàn)镽R-11a可以與半胱氨酸殘基形成共價(jià)鍵，不可逆地抑制legumain活性。legumain在pH值>5.5時還表現(xiàn)出一種連接酶活性，這為CVD的靶向藥物設(shè)計(jì)提供了可能[44]。重組legumain治療顯著抑制ox-LDL引起的巨噬細(xì)胞凋亡,提示干預(yù)legumain可能是動脈粥樣硬化的一個新的治療靶點(diǎn)[20,25]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)[45]結(jié)果表明，低劑量使用秋水仙堿(0.5 mg/d)在預(yù)防CVD方面有很好的效果。秋水仙堿具有親脂性和細(xì)胞毒性，其治療指數(shù)較低，故可作為藥物前體與可裂解legumain合成藥物，與低表達(dá)legumain或僅表達(dá)legumain前驅(qū)酶的細(xì)胞相比，該藥物對高表達(dá)legumain的細(xì)胞和組織的藥效更強(qiáng)大，這種新策略有望用于動脈粥樣硬化斑塊的靶向治療[46]。

4 小 結(jié)

綜上所述，legumain作為一種與CVD密切相關(guān)的蛋白酶，其表達(dá)和活性的改變對動脈粥樣硬化、冠心病和肺動脈高壓等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用，其與他汀類藥物抗炎和降脂作用關(guān)系密切，但目前尚缺乏legumain與高血壓、心肌病之間聯(lián)系的相關(guān)研究。進(jìn)一步闡明legumain 在相關(guān)CVD中的作用和機(jī)制，以及l(fā)egumain表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，可為CVD的診斷、治療和預(yù)防提供新的干預(yù)靶點(diǎn)方向。