不同來(lái)源外泌體與急性腎損傷的研究進(jìn)展

高 搖 范振磊 林 杰 曾 仲 黃漢飛

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)可由膿毒血癥、燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷、外科手術(shù)和腎毒性藥物引起。流行病學(xué)的調(diào)查和研究[1]顯示，AKI的發(fā)病率達(dá)6.7%，病死率達(dá)23%；而在ICU中，AKI的發(fā)病率達(dá)22%，病死率高達(dá)48%。雖然，許多藥物能夠減輕AKI,但目前還沒(méi)有藥物能夠有效治療AKI，以保護(hù)腎臟。腎臟替代治療仍然是AKI的主要治療措施[1]。因此，如何保護(hù)腎功能仍然是臨床上亟須解決的難題。

研究[2]證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)通過(guò)旁分泌方式分泌外泌體來(lái)作用于周圍腎臟細(xì)胞，引起成熟腎臟細(xì)胞的去分化過(guò)程，使腎臟細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。外泌體的來(lái)源廣泛，除了MSC能分泌外泌體外，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)和腎小管上皮細(xì)胞也能夠分泌外泌體，通過(guò)作用于受體細(xì)胞介導(dǎo)保護(hù)作用[3-4]。外泌體能夠內(nèi)化于受體細(xì)胞，釋放核酸分子和活性蛋白作用于受體腎臟細(xì)胞，介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用?，F(xiàn)就多種細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)腎臟缺血再灌注損傷(reperfusion-induced renal injury，RIRI)的保護(hù)作用之研究進(jìn)行綜述，以期為RIRI的治療提供新思路。

1 外泌體的生物合成和生物學(xué)特征

不同來(lái)源的細(xì)胞均可產(chǎn)生外泌體，且形成機(jī)制基本相同：細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成早期核內(nèi)體(endosomes)，早期核內(nèi)體與高爾基復(fù)合體相互作用，逐漸成熟為晚期核內(nèi)體，晚期核內(nèi)體限制性質(zhì)膜結(jié)構(gòu)進(jìn)一步以逆出芽的方式形成含有大量小泡聚集的多囊泡胞內(nèi)體(MVB)。在此過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)活性蛋白因子、微RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)逐漸整合到外泌體或MVB內(nèi)，MVB可與溶酶體結(jié)合，導(dǎo)致自身的降解，也可進(jìn)一步與其來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)膜融合，以細(xì)胞胞吐的方式分泌外泌體和活性因子于細(xì)胞外環(huán)境，調(diào)節(jié)供體、臨近細(xì)胞和遠(yuǎn)處組織的生物學(xué)功能[5]。在電子顯微鏡下，外泌體呈杯口狀，直徑40～200 nm,密度為1.13～1.18 g/mL[6]。脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，外泌體富含膽固醇、神經(jīng)酰胺、甘油磷脂，以及長(zhǎng)而飽和的脂肪?；?，可使外泌體具有穩(wěn)定的雙分子磷脂結(jié)構(gòu)，避免其內(nèi)部活性成分失活，還能增強(qiáng)外泌體的疏水性和親脂性，使其容易通過(guò)生物屏障而被受體細(xì)胞攝取[7]。外泌體的內(nèi)部組分復(fù)雜，已被證實(shí)的成分包括組織相容性復(fù)合物(MCH)Ⅰ、組織相容性復(fù)合物(MCH)Ⅱ、四分子交聯(lián)體蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、程序性死亡蛋白(Alix)6、腫瘤易感基因蛋白(TSG)101、鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶(Rabs)、膜聯(lián)蛋白、熱休克蛋白、細(xì)胞骨架蛋白和核酸分子(miRNA、mRNA)[8-9]。其中，四分子交聯(lián)體蛋白、Alix6和TSG101常用于鑒別外泌體[10]。外泌體可存在尿液、血液、唾液、母乳和滲出液中，通過(guò)檢測(cè)體液中外泌體的組分可協(xié)助疾病診斷[8]，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2 不同來(lái)源外泌體與RIRI

2.1 MSC來(lái)源外泌體(MSC-exo)介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用 MSC-exo通過(guò)遞送相應(yīng)的活性蛋白因子和核酸分子至受體細(xì)胞內(nèi)，激活腎臟細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)機(jī)制。MSC-exo及其供體組分的復(fù)雜性可能是該外泌體能通過(guò)多種機(jī)制保護(hù)腎臟的基礎(chǔ)[11-13]。雖然，該外泌體對(duì)腎臟的保護(hù)作用是綜合性的，但外泌體內(nèi)活性蛋白因子和核酸分子的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究來(lái)揭示。Lin等[14]的研究證實(shí)，MSC-exo通過(guò)抑制腎臟纖維化、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低細(xì)胞凋亡水平和促進(jìn)血管再生，從而介導(dǎo)外泌體對(duì)RIRI的綜合性保護(hù)作用。但這兩種生物學(xué)過(guò)程介導(dǎo)腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制并沒(méi)有被進(jìn)一步闡明。Zhou等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，MSC-exo通過(guò)抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)通路介導(dǎo)減輕腎臟氧化應(yīng)激的作用，通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2信號(hào)通路介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞增殖作用，同時(shí)上調(diào)抗凋亡蛋白(Bcl-2)和下調(diào)促凋亡蛋白(Bax)的表達(dá)，以促進(jìn)外泌體對(duì)腎臟的綜合性保護(hù)作用。而B(niǎo)runo等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，MSC-exo抑制腎小管上皮的細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與外泌體可同時(shí)上調(diào)抗凋亡基因(bcl-xL、bcl2、BIRC8)和下調(diào)促凋亡基因(casp1、casp8、LTA)的表達(dá)有關(guān)。Zhang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導(dǎo)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的可能機(jī)制是抑制了還原型輔酶Ⅱ氧化酶(NOX)2的表達(dá)，以減少活性氧(ROS)的產(chǎn)生。另有研究[18]發(fā)現(xiàn)，MSC-exo可通過(guò)激活Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Keap)1/紅細(xì)胞系衍生的核因子(Nrf)2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路，上調(diào)血紅素氧合酶(HO)1的表達(dá)，減輕腎小管氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的凋亡和炎性反應(yīng)。Zou等[19]的研究發(fā)現(xiàn)MSC-exo主要通過(guò)降低化學(xué)趨化因子(CX3CL1)的表達(dá)水平，抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的促炎性反應(yīng)。Wang等[20]的研究發(fā)現(xiàn)MSC-exo抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和炎性反應(yīng)的機(jī)制，主要與外泌體可誘導(dǎo)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路活性的上調(diào)，進(jìn)一步激活自噬途徑介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用有關(guān)。綜上，外泌體主要通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，以及降低細(xì)胞凋亡水平，介導(dǎo)對(duì)RIRI的綜合性保護(hù)作用。

2.1.1 MSC-exo的活性蛋白介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用 研究[2,7,21-22]證實(shí)，MSC能通過(guò)旁分泌的方式分泌活性蛋白因子作用于受體腎臟細(xì)胞，雖然MSC分泌的活性因子對(duì)腎臟細(xì)胞的保護(hù)作用比較局限，但外泌體內(nèi)的活性蛋白因子對(duì)腎臟的保護(hù)作用卻很明顯，外泌體具有的穩(wěn)定脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，可使其內(nèi)部活性蛋白因子的活性不受細(xì)胞微環(huán)境的影響，而細(xì)胞微環(huán)境則可能影響MSC分泌的活性蛋白因子的活性。上述研究結(jié)論提示MSC-exo的活性蛋白能夠激活受體腎臟細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，減輕RIRI。Wang等[20]的研究結(jié)果顯示MSC-exo通過(guò)上調(diào)受體細(xì)胞內(nèi)微管關(guān)聯(lián)蛋白(LC3B)的表達(dá)，激活受體細(xì)胞內(nèi)的自噬保護(hù)機(jī)制，減輕RIRI；但該研究對(duì)外泌體內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用的蛋白因子沒(méi)有闡明。Jia等[23]的研究發(fā)現(xiàn)MSC-exo能夠激活受體腎臟細(xì)胞的自噬保護(hù)機(jī)制，且該機(jī)制與MSC-exo內(nèi)14-3-3ζ蛋白有關(guān)，其可靶向調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白(ATG)16L的表達(dá)，增強(qiáng)自噬機(jī)制對(duì)腎臟的保護(hù)作用。Shen等[24]的研究發(fā)現(xiàn)MSC-exo能通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)對(duì)腎臟的損傷，這種保護(hù)作用主要與MSC-exo表達(dá)的化學(xué)趨化因子受體(CCR)2有關(guān)，其可結(jié)合腎臟組織中游離的化學(xué)趨化因子(CCL)2，降低組織中CCL2的水平，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用。Yuan等[25]的研究發(fā)現(xiàn)MSC-exo內(nèi)特異性蛋白(SP)1也能通過(guò)抑制炎性反應(yīng)介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用，但這種保護(hù)作用是間接地通過(guò)抑制腎臟細(xì)胞的壞死性凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的；MSC-exo通過(guò)遞送SP1于受體腎小管細(xì)胞內(nèi)，上調(diào)受體細(xì)胞內(nèi)SP1的水平，激活腎小管上皮內(nèi)鞘氨醇激酶信號(hào)通路(SP1/SK1/S1P)，減輕腎小管上皮細(xì)胞壞死性凋亡，抑制由損傷相關(guān)的分子模式(DAMP)激活的固有免疫反應(yīng)。Zou等[26]的研究證實(shí)，MSC-exo能將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)遞送至受體腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，可促進(jìn)腎臟細(xì)胞的增殖和血管再生，而具體的機(jī)制未得到進(jìn)一步揭示。Ju等[27]的研究證實(shí)MSC-exo對(duì)腎臟細(xì)胞的增殖作用是基于MSC-exo含有的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，其可重新啟動(dòng)成熟的腎小管上皮細(xì)胞的去分化過(guò)程，還能激活腎小管細(xì)胞內(nèi)ERK1/2信號(hào)通路，介導(dǎo)腎小管上皮的增殖。

2.1.2 MSC-exo相關(guān)的核酸分子介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用 研究[3, 26, 28-30]顯示，提前用核糖核酸酶(RNase)預(yù)處理外泌體可有效抑制外泌體對(duì)受體腎臟細(xì)胞的保護(hù)作用，提示外泌體內(nèi)miRNA或mRNA可能是介導(dǎo)腎臟保護(hù)作用的主要物質(zhì)。MSC-exo的核酸分子能夠靶向調(diào)節(jié)受體腎臟細(xì)胞內(nèi)基因和蛋白的表達(dá)，激活細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。Wang等[31]的研究發(fā)現(xiàn)MSC-exo通過(guò)將miRNA-199a-5p遞送至受體腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，靶向抑制結(jié)合免疫球蛋白(BIP)的表達(dá)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的腎小管細(xì)胞凋亡，但這種保護(hù)作用只限于RIRI的早期階段。Zhu等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，MSC-exo通過(guò)將miRNA-199a-3p遞送至受體腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，靶向抑制信號(hào)素(Sema)3A表達(dá)，激活腎小管上皮內(nèi)蛋白激酶B(AKT)和ERK信號(hào)通路，拮抗細(xì)胞凋亡。Gu等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，MSC-exo通過(guò)上調(diào)受體腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)miRNA-30的水平，靶向抑制動(dòng)力相關(guān)蛋白(DRP)1的表達(dá)，拮抗線粒體分裂介導(dǎo)的促細(xì)胞凋亡作用。Wang等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-let7c介導(dǎo)MSC-exo對(duì)腎臟的保護(hù)作用是通過(guò)抑制腎臟纖維化的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)，MSC-exo通過(guò)遞送miRNA-let7c于受體腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)miRNA-let7c的水平，靶向抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β1的表達(dá)，抑制TGFβ1下游信號(hào)通路激活介導(dǎo)的促腎臟纖維化反應(yīng)。然而，也有研究結(jié)果顯示，MSC-exo可以直接通過(guò)遞送活性蛋白因子的mRNA介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用，其過(guò)程并不需要miRNA的間接靶向調(diào)節(jié)作用。Choi等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，MSC-exo介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用，主要與MSC-exo含有血管生長(zhǎng)因子核酸分子(VEGF-A-mRNA)、胰島素樣生長(zhǎng)因子核酸分子(IGF-mRNA)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子核酸分子(FGF-mRNA)有關(guān)，但并未闡明具體的作用機(jī)制，這可能與受體腎臟細(xì)胞活性因子的水平上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)增殖機(jī)制啟動(dòng)有關(guān)。Ju等[27]的研究也發(fā)現(xiàn)，MSC-exo通過(guò)直接遞送肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子核酸分子(HGF-mRNA)于受體腎臟細(xì)胞，上調(diào)受體腎臟細(xì)胞內(nèi)HGF的水平，激活細(xì)胞內(nèi)ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的增殖作用。研究[13]結(jié)果顯示，MSC-exo主要含有23種miRNA,包括miRNA-1246、miRNA-23a-3p、miRNA-451a、miRNA-125b-5p、miRNA-199a-3p/199b-3p、miRNA-4454/7975、miRNA-21-5p、miRNA-100-5p、miRNA-29a-3p、miRNA-144-3p、miRNA-29b-3p、miRNA-22-3p、miRNA-630、miRNA-221-3p、miRNA-424-5p、miRNA-191-5p、miRNA-25-3p、miRNA-30a-3p、miRNA-376a-3p、miRNA-27b-3p、miRNA-let-7a-5p、miRNA-let-7b-5p和miRNA-let-7i-5p，可以靶向調(diào)節(jié)5 481種mRNA的表達(dá)，提示MSC-exo內(nèi)的miRNA的對(duì)RIRI有保護(hù)作用，但仍有待進(jìn)一步研究和闡明。

2.2 EPC來(lái)源的外泌體(EPC-exo)介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用 RIRI能夠破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，低氧則加重腎小管上皮細(xì)胞的壞死與凋亡，促進(jìn)腎臟纖維化的形成；提示改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能，可減輕RIRI[36]。研究[37]證實(shí)，EPC也是通過(guò)旁分泌的方式作用于受損的內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)與再生。而EPC-exo在介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用中，起著至關(guān)重要的作用。Cantaluppi等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，EPC-exo抑制受體內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用是通過(guò)EPC-exo內(nèi)miRNA-126和miRNA-296來(lái)介導(dǎo)的；該研究結(jié)果提示，當(dāng)用miRNA-126和miRNA-296抑制劑預(yù)處理EPC-exo時(shí)，EPC-exo抗內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡作用能夠被有效地抑制，說(shuō)明EPC-exo內(nèi)miRNA-126和miRNA-296表達(dá)上調(diào)能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，但并未闡明具體的作用機(jī)制。Vias等[38]的研究則發(fā)現(xiàn)，EPC-exo內(nèi)miRNA-486-5P能夠介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用，EPC-exo通過(guò)遞送miRNA-486-5P于受體內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)miRNA-486-5P水平，靶向抑制磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)的表達(dá),激活A(yù)KT信號(hào)介導(dǎo)抑制細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用；然而Vias等[39]的進(jìn)一步研究則發(fā)現(xiàn)，受體內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1α和EPC-exo表達(dá)的化學(xué)趨化因子受體(CXCR)4能夠增強(qiáng)EPC-exo的歸巢和靶向調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)受體內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)EPC-exo的吸收。EPC-exo內(nèi)部組分復(fù)雜，相應(yīng)的活性蛋白因子與核酸分子對(duì)受體細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

2.3 腎小管上皮細(xì)胞(renal epithelial cell，REC)來(lái)源的外泌體(REC-exo)介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用 Dominguez等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，REC-exo可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)和腎臟的纖維化，以及促進(jìn)血管的修復(fù)，介導(dǎo)外泌體對(duì)RIRI的綜合保護(hù)作用。RIRI能夠代償性啟動(dòng)REC的保護(hù)機(jī)制，增強(qiáng)自身的耐受性。REC可能也是通過(guò)旁分泌的方式分泌外泌體介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用。研究[40]結(jié)果顯示，REC-exo含有水孔蛋白(AQP)1，能夠促進(jìn)腎小管細(xì)胞的遷移，提示REC-exo中AQP1對(duì)腎臟可能具有潛在的保護(hù)作用。相關(guān)研究[11,39]結(jié)果表明，REC-exo含有693種活性蛋白，參與介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用，經(jīng)缺氧預(yù)處理的REC-exo能夠發(fā)揮明顯的保護(hù)作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)缺氧預(yù)處理的REC-exo能夠表達(dá)更高水平的細(xì)胞間黏附分子(ICAM)1，其可增強(qiáng)受體腎小管上皮細(xì)胞與REC-exo的黏附作用，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)化REC-exo的作用。Chen等[41]的研究發(fā)現(xiàn)REC-exo也能通過(guò)抑制炎性反應(yīng)介導(dǎo)對(duì)腎臟的保護(hù)作用，REC-exo通過(guò)上調(diào)受體腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)3的水平，靶向抑制單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)1基因的表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕RIRI,而這種保護(hù)作用則可能是外泌體內(nèi)ATF3蛋白及其mRNA共同作用的結(jié)果。

3 總結(jié)與展望

外泌體介導(dǎo)的受體腎臟的保護(hù)作用基于外泌體含有大量的活性蛋白和核酸分子，而這些活性蛋白和核酸分子對(duì)腎臟的保護(hù)作用機(jī)制尚未得到完全揭示。外泌體來(lái)源廣泛、安全性高、生物活性穩(wěn)定，能夠用于協(xié)助疾病的診斷、作為藥物和基因靶向治療疾病的載體，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。外泌體的提取技術(shù)、提取量和提取純度是制約其臨床應(yīng)用的主要因素，因此，除亟須研發(fā)經(jīng)濟(jì)且便捷的提取技術(shù)外，還需研究外泌體分泌的影響因素，以獲取高質(zhì)量的外泌體應(yīng)用于臨床。