野牛草克隆分株酶促活性氧清除系統(tǒng)對差異光周期的響應(yīng)

李 偉，錢永強(qiáng)，韓 蕾，劉俊祥，孫振元，＊

（1中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100091；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東青島266109）

野牛草克隆分株酶促活性氧清除系統(tǒng)對差異光周期的響應(yīng)

李 偉1，2，錢永強(qiáng)1，韓 蕾1，劉俊祥1，孫振元1，＊

（1中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100091；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東青島266109）

以盆栽野牛草克隆分株為材料，將克隆分株分別標(biāo)記為O（姊株）和Y（妹株），設(shè)置連接組和斷開組兩種處理，其中，連接組中O分株和Y分株通過節(jié)間子相連，斷開組則剪斷分株節(jié)間子；兩組處理的O分株光周期均設(shè)置為光照12h／黑暗12h，Y分株光周期均設(shè)置為黑暗12h／12h光照（恰好與O分株相反），經(jīng)過7d的差異光周期處理后進(jìn)行72h全光照穩(wěn)定培養(yǎng)，并于全光照條件下在48h內(nèi)連續(xù)測定各分株葉片超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD），過氧化氫酶（CAT），抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性以及丙二醛（MDA）的含量，探討野牛草葉片酶促活性氧清除系統(tǒng)對差異光周期的響應(yīng)特征。結(jié)果表明，差異光周期處理1周后，全光照條件下，斷開狀態(tài)的野牛草克隆分株O和Y間葉片中SOD、POD、CAT、APX活性以及MDA含量在24h內(nèi)基本呈現(xiàn)相反的變化趨勢，而野牛草相連克隆分株O和Y間葉片中以上指標(biāo)在24h內(nèi)呈現(xiàn)趨于一致的變化規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，野牛草酶促活性氧清除系統(tǒng)活性在一天內(nèi)呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)模式，且差異光周期處理下的野牛草相連克隆分株的活性氧清除系統(tǒng)的活性的節(jié)律性變化趨于同步。

野牛草；克隆分株；差異光周期；活性氧清除系統(tǒng)；同步化

地球每天圍繞地軸的自轉(zhuǎn)形成了環(huán)境的規(guī)律性變化。如光照、溫度、濕度等都具有明顯的日變化規(guī)律，而生物體對地球物理學(xué)的周期性變化，在行為和生理機(jī)能上產(chǎn)生有節(jié)律的反應(yīng)，被稱為生物鐘，作為一種內(nèi)源機(jī)制，生物鐘在各類生物體內(nèi)發(fā)揮重要功能［12］。在恒定的外界條件下，植物內(nèi)源生物鐘以近24h的周期振蕩，使植物根據(jù)外界環(huán)境的周期性變化來協(xié)調(diào)自身的新陳代謝和生理過程，進(jìn)而增強(qiáng)植物的適應(yīng)性和生存能力［3-6］。

在植物中，生物鐘調(diào)控了很多生理生態(tài)反應(yīng)，并且與每天的日變化相互匹配，如碳固定、氣孔開閉、蒸騰作用等，同時還參與了逆境脅迫響應(yīng)、活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝和基因表達(dá)等過程［7-9］。而細(xì)胞基礎(chǔ)代謝的周期性振蕩與氧化還原反應(yīng)的動態(tài)平衡密切相關(guān)，在細(xì)菌以及動植物的生物節(jié)律中發(fā)揮重要作用。在微生物中，ROS可以直接促進(jìn)粗糙脈孢菌的生物鐘功能，而在植物中，ROS與生物鐘基因之間存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，擬南芥1／3以上的ROS相關(guān)轉(zhuǎn)錄本受到生物鐘的調(diào)控［1011］，因而各類ROS呈現(xiàn)出每天的節(jié)律性振蕩；相應(yīng)地，約70%的擬南芥生物鐘基因也受到各種逆境脅迫的調(diào)節(jié)［12］。GI（Gigantea）是擬南芥核心生物鐘基因之一，在黑暗條件下，擬南芥gi突變體能夠耐受超氧化物供體——百草枯脅迫，而后者是一個超氧化物供體［13］。在擬南芥的其他生物鐘基因突變體，包括cca1（circadian clock associated1）、lhy（late elongated hypocotyl）、prr9（pseudo response regulator）、prr7和prr5也表現(xiàn)出對超氧化物敏感，同時，這些突變體中過氧化氫水平提高，而過氧化氫清除系統(tǒng)的活性降低［11］。也有研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸過氧化物酶基因1（APX1），以及FER3／4（Ferritins）基因在擬南芥tic（time for coffee）突變體中表達(dá)上調(diào)，這有助于對氧化還原反應(yīng)的調(diào)控［14］，擬南芥日長依賴型的過氧化氫酶突變體中觀察到的生物鐘和氧化還原反應(yīng)之間的平衡關(guān)系也有力地證明了這點(diǎn)［15］。由此可見，活性氧代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與生物鐘系統(tǒng)之間互相協(xié)調(diào)，增強(qiáng)了植物對環(huán)境的適應(yīng)能力。

光周期是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子之一，在植物不同生境（生態(tài)區(qū)）間引種、異地移植、遠(yuǎn)緣嫁接等過程中頻繁出現(xiàn)的低成活率或生長異常等問題，其重要原因之一也是植物內(nèi)源生物鐘與外界環(huán)境因子（如光周期）難以協(xié)調(diào)一致，而導(dǎo)致植物生長代謝紊亂，甚至死亡。野牛草［Buchloe dactyloides（Nutt.）Engelm.］是典型的匍匐莖型克隆植物，先前的研究發(fā)現(xiàn)，異質(zhì)性水分脅迫下，野牛草相連克隆分株通過節(jié)間子實(shí)現(xiàn)水分［16］、光合同化物的運(yùn)輸與共享［17］。當(dāng)野牛草相連克隆分株分別處于不同的光周期下，能否感知外界的差異光周期信號，實(shí)現(xiàn)內(nèi)部生物學(xué)過程與外界光周期的協(xié)調(diào)一致？本試驗(yàn)擬以野牛草克隆分株為材料，研究差異光周期條件下野牛草的脂質(zhì)過氧化作用及酶促活性氧清除系統(tǒng)的變化規(guī)律，以期進(jìn)一步為植物生物節(jié)律調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)于中國林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室及林業(yè)研究所的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。野牛草幼苗來自于一粒種子萌發(fā)后產(chǎn)生的無性繁殖群體，保證了所用試驗(yàn)材料基因型完全相同。從中選取長勢基本一致的相連克隆分株，移栽于裝有基質(zhì)（草炭土中加入適量雞糞）的營養(yǎng)缽內(nèi)（直徑為7cm，高度為8cm），相連克隆分株分別種植于兩個缽內(nèi)，中間由節(jié)間子相連，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照／黑暗為12h／12h，白天／夜晚的溫度為25℃／20℃，培養(yǎng)箱室內(nèi)光照強(qiáng)度約為1 100lx。每隔2d澆水50 mL／缽，保證其正常生長。預(yù)培養(yǎng)4周后，當(dāng)相連克隆分株生長和生理狀態(tài)一致時，進(jìn)行差異光周期處理。

1.2 光周期處理

培養(yǎng)4周后的野牛草相連克隆分株進(jìn)行差異光周期處理，野牛草相連克隆分株標(biāo)記為O（姊株）和Y（妹株），實(shí)驗(yàn)設(shè)置為連接組和斷開組（圖1）。連接組（處理組）野牛草O分株和Y分株

通過節(jié)間子相連，O分株光周期設(shè)置為光照／黑暗＝12h／12h，Y分株光周期設(shè)置為黑暗／光照＝12h／12h（恰好與O分株相反）；斷開組（對照組）O和Y分株光周期設(shè)置相同連接組，但O和Y分株間節(jié)間子被剪斷，光照培養(yǎng)箱的溫度、濕度和光照強(qiáng)度同1.1。連接組和斷開組樣本經(jīng)過7d的光周期處理后進(jìn)行3d全光照條件（24h光照）穩(wěn)定培養(yǎng)，隨后在全光照條件下，于48h內(nèi)每隔4h取葉片樣品1次，液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶促活性氧清除系統(tǒng)活性測定

1.3.1 粗酶液制備 按王愛國等［18］的方法加以改進(jìn)，取植物材料0.5g（新鮮葉片）于預(yù)冷過的研缽中，加入少量石英砂在冰浴條件下研磨成粉，將粉末轉(zhuǎn)移至10mL離心管，加入5mL提取液搖勻，4℃下，12 000×g離心20min，取上清液定容至5 mL后保存于4℃，即為粗酶液。用于超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性測定以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定。提取液為50mmol·L-1（pH 7.8）的磷酸緩沖（PBS）溶液，內(nèi)含1%（W／V）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

1.3.2 MDA含量測定 MDA含量測定參照Buege等［19］的方法略加改動。反應(yīng)體系：取1mL粗酶液加入2mL 0.6%的硫代巴比妥酸（TBA），沸水浴15min（自試管內(nèi)出現(xiàn)小泡開始計時），到時間后立即將試管放入冰水浴中，待試管冷卻后，12 000g離心10min，取上清測定體積，以0.6%的TBA為對照測定600、532和450nm處的吸光度值A(chǔ)600、A532、A450，最后計算MDA含量。MDA含量（μmol／g）＝（6.452×（A532-A600）-0.559×A450）×VT／（VS×FW），式中，VT為酶提取液總體積（mL）；VS為測定時酶液用量（mL）；FW為樣品鮮重（g）。

圖1 野牛草差異光周期處理示意圖Fig.1 Schematic diagram of buffalo grass under different photoperiod treatments

1.3.3 SOD活性測定 SOD活性測定參照Giannopolitis等［20］的方法稍加改進(jìn)。反應(yīng)混合液配制（以60個樣為準(zhǔn)）：分別取130mmol／L甲硫氨酸（Met）溶液162mL，100μmol／L EDTA-Na2溶液0.6mL，PBS（pH 7.8）5.4mL，750μmol／L氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）溶液6mL，20μmol／L核黃素溶液6mL（用前配制，避光保存），混合后搖勻；分別取上述3mL反應(yīng)混合液和30μL粗酶液于離心管中，將離心管置于4 000lx光照下反應(yīng)20min；同時做兩支對照管，其中1支管取3mL反應(yīng)混合液加入30μL PBS（pH 7.8）不加酶液，照光后測定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測定時用于調(diào)零；以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，遮光下測A560（當(dāng)最大光還原管的A560約為0.9～1.1時測定）。酶活性計算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50%所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個酶活單位（U）。SOD總活性（U·g-1· min-1）＝［（ACK-AS）×VT］／（1／2ACK×FW×VS）。式中，ACK為照光對照管的吸光度；AS為樣品管的吸光度；VT為酶提取液總體積（mL，加入PBS的體積）；VS為測定時的粗酶液用量（mL，30μL）；FW為樣品鮮重（g）。

1.3.4 POD活性測定 POD活性測定參照Kraus等［21］的方法略有改動。反應(yīng)混合液配制（以60個樣為準(zhǔn)）：取200mL PBS（0.2mol／L，pH 6.0），加入0.076mL愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）原液加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112mL 30%的H2O2，混勻后置冰箱中備用。取3mL反應(yīng)液并加入30μL粗酶液，以PBS（pH 6.0）為對照調(diào)零，而后測定A470值（測定60s）。（邊加樣邊測定，測定前等待5s，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）。酶活性計算：以A470值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（U）。POD活性（U· g-1·min-1）＝（ΔA470×Vt）／（FW×Vs×0.01× t）。式中，ΔA470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；FW為樣品鮮重（g）；t為反應(yīng)時間（min）；Vt為酶提取液總體積（mL）；Vs為測定時粗酶液用量（mL）。

1.3.5 CAT活性測定 CAT活性測定參照Kraus等［21］的方法略有改動。反應(yīng)液配制：取200mL PBS（0.15mol／L，pH 7.0），加0.309 2mL 30%的H2O2（原液）搖勻。取3mL反應(yīng)液加0.1mL（可視情況調(diào)整）粗酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定吸光度A240（紫外）值（測定60s）。酶活性計算：以A240值減少0.01為1個酶活性單位（U）。CAT活性（U· g-1·min-1）＝（ΔA240×VT）／（FW×VS×0.01× t）。式中，ΔA240為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；FW為樣品鮮重（g）；t為反應(yīng)時間（min）；VT為酶提取液總體積（mL）；VS為測定時粗酶液用量（mL）。

1.3.6 APX活性測定 APX活性測定參照Dal-ton等［22］的方法略有改動。取3mL反應(yīng)液（含0.05mol／L PBS（pH 7.0），0.1mmol／L EDTA，0.5mmol／L ASA）加入80μL粗酶液。1號比色皿中不加抗壞血酸（ASA）和H2O2作為參照，2號比色皿中不加H2O2作為控制參照，3號比色皿中加入0.1mmol／L H2O2啟動反應(yīng)，每10s連續(xù)記錄室溫下290nm吸光值的變化ΔA290。以室溫下氧化1 μmol ASA的酶量作為一個酶活性單位（U）。計算APX活性（μmol·g-1·min-1）＝（ΔA290×VT× VR×1 000）／（FW×2.8×VS×t）。式中，ΔA290為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度值的變化；VT為酶提取液總體積（mL）；VR為反應(yīng)液體積（mL）；1 000為將mmol／L轉(zhuǎn)換成μmol／L的系數(shù)；FW為樣品鮮重（g）；2.8為消光系數(shù)（mmol·L-1·cm-1）；VS為測定時粗酶液用量（mL）；t為反應(yīng)時間（min）。

圖2 差異光周期處理后斷開組（A）和連接組（B）野牛草克隆分株MDA含量的日變化圖中數(shù)據(jù)為差異光周期處理7d后進(jìn)行全光照穩(wěn)定培養(yǎng)72h，并于全光照下連續(xù)48h測定的指標(biāo)；下同F(xiàn)ig.2 Diurnal changes on MDA content in disconnective ramets（A）and connective ramets（B）of buffalo grass under different photoperiod treatments The data of MDA content which was continuous measured 48hillumination after cultivation of 7ddifferent photoperiod treatments and 72hstable illumination conditions.The same as below.

2 結(jié)果與分析

2.1 差異光周期處理對野牛草克隆分株MDA含量的影響

在斷開組（圖2，A）中，野牛草經(jīng)過1周的正置光周期（光照／黑暗＝12h／12h）處理后，O分株中MDA含量在24h內(nèi)呈現(xiàn)近余弦的波形，并在測定第1天4：00和測定第2天4：00時達(dá)到波峰，分別為6.715和6.117μmol／g；而經(jīng)過1周的倒置光周期（黑暗／光照＝12h／12h）處理后，Y分株中MDA含量整體的變化趨勢與O分株相反，24h內(nèi)基本上呈現(xiàn)近正弦的波形，并在測定第1天4：00和測定第2天4：00時達(dá)到波谷，分別為3.893和4.577 μmol／g。在連接組中（圖2，B），相連克隆分株分別經(jīng)過相反的光周期處理后（即O分株處于正置光周期，Y分株處于反置光周期），O分株MDA含量變化呈現(xiàn)近余弦的波形，并在測定第1天24：00、測定第2天12：00和24：00時達(dá)到波峰，分別為5.431、5.377和5.341μmol／g，而Y分株MDA含量在24 h內(nèi)的整體變化與O分株趨于基本一致，并在測定第1天24：00、測定第2天12：00和24：00時達(dá)到波峰，分別為5.090、5.129和4.105μmol／g。這說明野牛草克隆分株內(nèi)的MDA含量在日變化周期內(nèi)呈現(xiàn)節(jié)律性變化，斷開分株間由于光周期完全相反，其MDA含量變化也基本處于相反的變化規(guī)律，而相連克隆分株通過節(jié)間子相連，分株之間存在著物質(zhì)的交流和信號的傳遞，在完全相反的光周期處理?xiàng)l件下，由于克隆植物的生理整合特性，使得MDA含量的節(jié)律性變化趨于一致。

2.2 差異光周期處理對野牛草克隆分株SOD活性的影響

在斷開組（圖3，A）中，經(jīng)過1周的正置光周期處理后，O分株中SOD活性在24h內(nèi)的變化基本符合近正弦的波形，并在測定第1天24：00、測定第3天8：00時達(dá)到波峰，分別為355.253和277.995 U·g-1·min-1，而經(jīng)過1周的倒置光周期處理后，Y分株中SOD活性在48h內(nèi)的整體變化趨勢與O分株基本相反，符合近余弦的波形，并在測定第1天24：00、測定第3天8：00時達(dá)到波谷，分別為225.991和246.811U·g-1·min-1；而在連接組中（圖3，B），相連克隆分株分別經(jīng)過相反的光周期處理后，O分株中SOD活性在24h內(nèi)的變化基本屬于近正弦的波形，并在測定第1天20：00、測定第2天20：00時達(dá)到波峰，分別為393.378和348.973 U·g-1·min-1，Y分株SOD活性在24h內(nèi)的整體變化趨于與O分株基本一致，并在測定第1天20：00、測定第2天8：00和20：00時達(dá)到波峰，分別為394.119、317.917和305.196U·g-1·min-1。這說明野牛草克隆分株內(nèi)的SOD活性在日變化周期內(nèi)呈現(xiàn)一定的節(jié)律性變化，且相連克隆分株之間存在著物質(zhì)的共享和信號的傳遞，使得處于相反光周期處理?xiàng)l件下的兩分株在差異光信號因子作用下，克隆分株的酶促活性氧清除系統(tǒng)中的SOD活性的節(jié)律性變化也趨于一致。

2.3 差異光周期處理對野牛草克隆分株P(guān)OD活性的影響

圖3 差異光周期處理斷開組（A）和連接組（B）野牛草克隆分株SOD活性的日變化Fig.3 Diurnal changes on SOD activity in disconnective ramets（A）and connective ramets（B）of buffalo grass under different photoperiod treatments

在斷開組中（圖4，A），經(jīng)過1周的正置光周期處理后，O分株中POD活性在24h內(nèi)的變化呈現(xiàn)“M形”的波形，并在測定第1天16：00和24：00、測定第2天20：00和04：00時達(dá)到波峰，分別為6 239.219、7 347.397、5 971.764和6 294.940U· g-1·min-1；同時，而經(jīng)過1周的倒置光周期處理后，Y分株中POD活性在24h內(nèi)的整體變化趨勢也是呈現(xiàn)“M形”的波形，但變化軌跡與O分株基本相反，即當(dāng)O分株中POD活性位于波峰時，Y分株中POD的活性基本降為最低值，并分別在測定第1天16：00、測定第2天4：00和20：00，以及測定第3天4：00時達(dá)到波谷，分別為3 216.643、4 575.685、2 516.720和1 510.163U·g-1·min-1。而在連接組中（圖4，B），相連克隆分株分別經(jīng)過相反的光周期處理后，O分株P(guān)OD的活性在24h內(nèi)的變化呈現(xiàn)“倒V”的波形，并在測定第1天4：00、測定第2天16：00時達(dá)到波峰，分別為6 524.908和6 617.583U·g-1·min-1，Y分株P(guān)OD活性在24 h內(nèi)的整體變化趨于與O分株基本一致，并在測定第1天4：00、測定第2天16：00時達(dá)到波峰，分別為5 558.562和6 102.131U·g-1·min-1。這說明野牛草克隆分株在差異光信號因子作用下，植株內(nèi)部酶促活性氧清除系統(tǒng)中的POD活性呈現(xiàn)節(jié)律性變化，且相連分株間的節(jié)律性變化規(guī)律趨于一致，推測是由于克隆分株間的生理整合作用。

2.4 差異光周期處理對野牛草克隆分株CAT活性的影響

圖4 差異光周期處理斷開組（A）和連接組（B）野牛草克隆分株P(guān)OD活性的日變化Fig.4 Diurnal changes on POD activity in disconnective ramets（A）and connective ramets（B）of buffalo grass under different photoperiod treatments

圖5 差異光周期處理后野牛斷開組（A）和連接組（B）草克隆分株CAT活性的日變化Fig.5 Diurnal changes on CAT activity in disconnective ramets（A）and connective ramets（B）of buffalo grass under different photoperiod treatments

在斷開組中（圖5，A），經(jīng)過1周的正置光周期處理后，野牛草O分株中CAT活性在24h內(nèi)的變化變化呈現(xiàn)近余弦曲線的波形，并在測定第1天8：00、測定第2天4：00和12：00，以及第3天4：00時達(dá)到波峰，分別為94.392、103.823、90.041和74.074U·g-1·min-1；而經(jīng)過1周的倒置光周期處理后，Y分株中CAT活性在24h內(nèi)的變化趨勢呈現(xiàn)近正弦曲線的波形，變化軌跡與O分株完全相反，并在測定第1天8：00、測定第2天4：00和12：00，以及第3天8：00時達(dá)到波谷，分別為31.208、49.730、14.276和36.752U·g-1· min-1。在連接組中（圖5，B），相連克隆分株分別經(jīng)過相反的光周期處理后，O分株CAT活性在24h內(nèi)的變化呈現(xiàn)“M形”的波形，并在測定第1天20：00、測定第2天4：00和16：00，以及測定第3天4：00時達(dá)到波峰，分別為150.067、122.410、90.880和106.088U·g-1·min-1，Y分株CAT活性在24 h內(nèi)的整體變化趨勢與O分株基本一致，并在測定第1天20：00、測定第2天4：00和16：00，以及測定第3天4：00時達(dá)到波峰，分別為133.729、135.732、71.509和94.242U·g-1·min-1。說明斷開分株間彼此獨(dú)立，在相反的光周期處理下，酶促活性氧清除系統(tǒng)中的CAT活性的變化也基本處于相反的狀態(tài)，并在兩個日變化周期內(nèi)呈現(xiàn)一定的節(jié)律性，而相連分株間由于存在著物質(zhì)和能量的傳遞與共享，在差異光信號因子作用下，克隆分株的酶促活性氧清除系統(tǒng)中CAT活性的節(jié)律性變化也趨于一致。

2.5 差異光周期處理對野牛草克隆分株APX活性的影響

在斷開組中（圖6，A），經(jīng)過1周的正置光周期處理后，野牛草O分株中APX活性在24h內(nèi)的變化呈現(xiàn)近余弦曲線的波形，并在測定第1天24：00和測定第2天12：00時達(dá)到波峰，分別為1 142.645和1 168.216μmol·g-1·min-1，而經(jīng)過1周的倒置光周期（黑暗／光照＝12h／12h）處理后，Y分株中APX活性在24h內(nèi)的整體變化趨勢則是呈現(xiàn)近正弦曲線的波形，變化規(guī)律與O分株完全相反，并在測定第1天24：00、測定第2天12：00和24：00時達(dá)到波谷，分別為478.762、305.919和560.734 μmol·g-1·min-1；在連接組中（圖6，B），相連克隆分株分別經(jīng)過相反的光周期處理后，O分株APX活性在24h內(nèi)的變化呈現(xiàn)“W”形的波形，并在測定第1天12：00、20：00和測定第2天8：00時達(dá)到波峰，分別為2 112.895、2 306.622和1 388.289μmol· g-1·min-1，而同期Y分株APX活性在24h內(nèi)的整體變化趨勢與O分株基本一致，并分別在測定第1天20：00，測定第2天4：00和16：00時達(dá)到波峰，分別為1 492.513、1 454.275和1 015.177μmol· g-1·min-1。這說明斷開分株在相反的光周期處理下，APX活性的變化也基本處于相反的狀態(tài)，并在兩個日變化周期內(nèi)呈現(xiàn)一定的節(jié)律性，而相連分株間由于生理整合作用，在差異光信號因子作用下，克隆分株的酶促活性氧清除系統(tǒng)中的APX活性也趨于一致。

以上結(jié)果說明，野牛草分株在斷開和連接兩種處理?xiàng)l件下，植株酶促活性氧清除系統(tǒng)的活性在一天內(nèi)呈現(xiàn)節(jié)律性變化，且差異光周期處理下的野牛草相連克隆分株的活性氧清除系統(tǒng)的活性的節(jié)律性變化趨于同步。

3 討 論

圖6 差異光周期處理斷開組（A）和連接組（B）野牛草克隆分株APX活性的日變化Fig.6 Diurnal changes on APX activity in disconnective ramets（A）and connective ramets（B）of buffalo grass under different photoperiod treatments

植物體內(nèi)許多反應(yīng)都能夠產(chǎn)生活性氧：如質(zhì)外體（特別是葉綠體和線粒體）中的電子傳遞鏈，過氧化物酶體及質(zhì)膜上的氧化酶和過氧化物酶等［23-25］。活性氧（ROS）的增加以及與氧化還原組分之間的互作可以完成信號的傳遞［26-28］，誘導(dǎo)體內(nèi)其它信號的級聯(lián)反應(yīng)，啟動植物體內(nèi)復(fù)雜的活性氧清除系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控［24］。本研究通過對野牛草設(shè)置差異光周期處理，分析了斷開和連接兩種狀態(tài)下的相連克隆分株生理代謝的變化，發(fā)現(xiàn)分株MDA的含量及酶促活性氧清除系統(tǒng)（SOD、POD、CAT、APX）的活性在一天內(nèi)呈現(xiàn)周期振蕩的節(jié)律變化，并具有一定消長規(guī)律。其一，野牛草克隆分株SOD、POD、CAT和APX的活性增強(qiáng)時，MDA的含量呈現(xiàn)下降趨勢，總體上此消彼長，呈負(fù)相關(guān)。前人研究證實(shí)，MDA含量的高低在一定程度上能反映脂膜過氧化水平和膜結(jié)構(gòu)的受害程度及植物的自我修復(fù)能力，而當(dāng)植物受到逆境脅迫時，植物體內(nèi)活性氧的清除能力有所下降，本研究結(jié)果與之一致。其二，野牛草克隆分株在斷開的狀態(tài)下，當(dāng)O分株和Y分株處于相反的光周期條件（即O分株處于正置光周期，而Y分株處于反置光周期）時，葉片中SOD、POD、CAT和APX的活性和MDA的含量的變化軌跡在兩者之間基本上是相反的。因?yàn)閅分株在預(yù)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將光周期完全倒置，在這種逆境條件下，植物體內(nèi)的活性氧既對細(xì)胞造成毒害作用，同時還作為防御化學(xué)信號分子，誘導(dǎo)體內(nèi)其它信號的級聯(lián)反應(yīng)，啟動植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)［24］，植物體內(nèi)的SOD、CAT、POD等活性氧清除系統(tǒng)活性增加，協(xié)調(diào)清除活性氧自由基，減輕植物受到的傷害［29-30］，進(jìn)而提高植物的適應(yīng)力。其三，野牛草克隆分株在連接的狀態(tài)下，當(dāng)O分株和Y分株處于相反的光周期條件下時，兩者葉片中SOD、POD、CAT和APX的活性和MDA的含量的變化趨于一致，并傾向于O分株的變化軌跡，這點(diǎn)再次證明了克隆植物可以通過分株之間節(jié)間子的連接，發(fā)生生理上的整合作用［31］，不僅能實(shí)現(xiàn)物質(zhì)或資源（如光合產(chǎn)物、水分和養(yǎng)分等）在克隆分株之間的運(yùn)輸與分享［32］，同時發(fā)生分株間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使其在惡劣環(huán)境中具備較強(qiáng)的適應(yīng)能力和生存競爭能力［33］。其四，野牛草葉片中SOD、POD、CAT和APX的活性與MDA的含量的變化規(guī)律并不依賴于光照條件，如在相連分株斷開條件下，O分株葉片中MDA含量在4：00、SOD活性在24：00、POD活性在24：00和4：00′、CAT活性在4：00和04：00′、APX活性在24：00都處于最大值；而野牛草相連分株在連接狀態(tài)下，O分株葉片中MDA含量在24：00和24：00′、POD活性在4：00、CAT活性在4：00和4：00′、APX活性在4：00，以及Y分株中SOD活性在4：00′時都處于最大值。植物酶促活性氧清除系統(tǒng)在光保護(hù)中雖然功能各異，但發(fā)揮作用時互相配合，使得光合器官活性氧代謝能夠保持一定的動態(tài)平衡，從而避免活性氧傷害［34］。O株在與外部自然晝夜節(jié)律環(huán)境相近或同步，表現(xiàn)出更強(qiáng)的生長適應(yīng)性。Y株雖經(jīng)完全相反的節(jié)律同步化處理，但與外部自然環(huán)境客觀上存在失同步，為提高其適應(yīng)性，兩相連分株基于生理整合機(jī)制實(shí)現(xiàn)生長及生理代謝的同步化，且傾向于O株。

總之，野牛草酶促活性氧清除系統(tǒng)活性在一天內(nèi)并非維持在一個恒定的水平，而是呈現(xiàn)節(jié)律性變化規(guī)律；同時，野牛草活性氧清除系統(tǒng)不僅減緩了活性氧產(chǎn)生速率及其對細(xì)胞膜的氧化傷害，而且在差異光周期下相連克隆分株間的活性氧清除系統(tǒng)活性趨于同步，有效地分?jǐn)偭嗣{迫風(fēng)險，提高野牛草在逆境下的適應(yīng)能力。

［1］ BELL-PEDERSEN D，CASSONE VM，EARNEST DJ，et al.Circadian rhythms from multiple oscillators：lessons from diverse organisms［J］.Nature Reviews Genetics，2005，6（7）：544-556.

［2］ WIJNEN H，YOUNG M W.Interplay of circadian clocks and metabolic rhythms［J］.Annu.Rev.Genet.，2006，40：409-448.

［3］ OUYANG Y，ANDERSSON CR，KONDO T，et al.Resonating circadian clocks enhance fitness in cyanobacteria［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1998，95（15）：8 660-8 664.

［4］ GREEN R M，TINGAY S，WANG Z Y，et al.Circadian rhythms confer a higher level of fitness to Arabidopsis plants［J］.Plant Physiol.，2002，129（2）：576-584.

［5］ DODD A N，SALATHIA N，HALL A，et al.Plant circadian clocks increase photosynthesis，growth，survival，and competitive advantage［J］.Science，2005，309（5 734）：630-633.

［6］ ZOLTOWSKI B D，SCHWERDTFEGER C，WIDOM J，et al.Conformational switching in the fungal light sensor Vivid［J］.Science，2007，316（5 827）：1 054-1 057.

［7］ MCCLUNG C R.Comes a time［J］.Curr.Opin.Plant Biol.，2008，11（5）：514-520.

［8］ WENDEN B，KOZMA-BOGNAR L，EDWARDS K D，et al.Light inputs shape the Arabidopsis circadian system［J］.Plant J.，2011，66（3）：480-491.

［9］ YAKIR E，HILMAN D，HARIR Y，et al.Regulation of output from the plant circadian clock［J］.FEBS J，2007，274（2）：335-345.

［10］ COVINGTON M F，MALOOF J N，STRAUME M，et al.Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development［J］.Genome Biol.，2008，9（8）：R130.

［11］ LAI A G，DOHERTY C J，MUELLER-ROEBER B，et al.CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1regulates ROS homeostasis and oxidative stress responses［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（42）：17 129-17 134.

［12］ KREPS J A，WU Y，CHANG H S，et al.Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt，osmotic，and cold stress［J］.Plant Physiol，2002，130（4）：2 129-2 141.

［13］ KUREPA J，SMALLE J，VA M，et al.Oxidative stress tolerance and longevity in Arabidopsis：the late-flowering mutant gigantea is tolerant to paraquat［J］.The Plant Journal，1998，14（6）：759-764.

［14］ DUC C，CELLIER F，LOBREAUX S，et al.Regulation of iron homeostasis in Arabidopsis thaliana by the clock regulator time for coffee［J］.Journal of Biological Chemistry，2009，284（52）：36 271-36 281.

［15］ QUEVAL G，ISSAKIDIS-BOURGUET E，HOEBERICHTS FA，et al.Conditional oxidative stress responses in the Arabidopsis photorespiratory mutant cat2demonstrate that redox state is a key modulator of daylength-dependent gene expression，and define photoperiod as a crucial factor in the regulation of H2O2-induced cell death［J］.Plant Journal，2007，52（4）：640-657.

［16］ QIAN Y，LI D，HAN L，et al.Inter-ramet physiological integration detected in buffalo grass（Buchloe dactyloides（Nutt.）Engelm.）under water stress［J］.Weed ＆Turfgrass Science，2009，23（2）：331-343.

［17］ QIAN Y，LI D，HAN L，et al.Inter-ramet photosynthate translocation in buffalo grass under differential water deficit stress［J］.Journal of the American Society for Horticultural Science，2010，135（4）：310-316.

［18］ WANG A G（王愛國），LUO G H（羅廣華）.Quantitative relation between the reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants［J］.Plant Physiology Communications（植物生理學(xué)通訊），1990，26（6）：55-57.

［19］ BUEGE J A.Microsomal lipid peroxidation［J］.Methods Enzymol.，1978，52：302-310

［20］ GIANNOPOLITIS CN，RIES SK.Superoxide dismutases I.Occurrence in higher plants［J］.Plant Physiol.，1977，59（2）：309-314.

［21］ KRAUS T E，F(xiàn)LETCHER R A.Paclobutrazol protects wheat seedlings from heat and paraquat injury.Is detoxification of active oxygen involved？［J］.Plant and Cell Physiology，1994，35（1）：45-52.

［22］ DALTON D A，HANUS F J，RUSSELL S A，et al.Purification，properties，and distribution of ascorbate peroxidase in legume root nodules［J］.Plant Physiol.，1987，83（4）：789-794.

［23］ BINDSHEDLER L V，DEWDNEY J，BLEE K A，et al.Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance［J］.The Plant Journal，2006，47（6）：851-863.

［24］ MITTLER R，VANDERAUWERA S，GOLLERY M，et al.Reactive oxygen gene network of plants［J］.Trends.Plant Sci.，2004，9（10）：490-498.

［25］ SAGI M，F(xiàn)LUHR R.Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases［J］.Plant Physiol.，2006，141（2）：336-340.

［26］ APEL K，HIRT H.Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction［J］.Annu.Rev.Plant Biol.，2004，55：373-399.

［27］ FOYER CH，LOPEZ-DELGADO H，et al.Hydrogen peroxide and glutathione-associated mechanisms of acclimatory stress tolerance and signalling［J］.Physiologia Plantarum，1997，100（2）：241-254.

［28］ LAMB C，DIXON R A.The oxidative burst in plant disease resistance［J］.Annu.Rev.Plant Biol.，1997，48（1）：251-275.

［29］ YORDANOVA R Y，CHRISTOV K N，POPOVA L P.Antioxidative enzymes in barley plants subjected to soil flooding［J］.Environmental and Experimental Botany，2004，51（2）：93-101.

［30］ YAN B，DAI Q，LIU X，et al.Flooding-induced membrane damage，lipid oxidation and activated oxygen generation in corn leaves［J］.Plant and Soil，1996，179（2）：261-268.

［31］ MARSHALL C，SAGAR G.The distribution of assimilates in Lolium multiflorumLam.following differential defoliation［J］.Annals of Botany，1968，32（4）：715-719.

［32］ MARSHALL C.Source-sink relations of interconnected ramets［J］.Clonal Growth in Plants：Regulation and Function，1990：23-41.

［33］ CHEN SH（陳 尚），LI Z ZH（李自珍），WANG G（王 剛）.Advances in research of growth form of the clonal plant［J］.Chinese Journal of Ecology（生態(tài)學(xué)雜志），1997，16（4）：59-63.

［34］ MARUTA T，TANOUCHI A，TAMOI M，et al.Arabidopsis chloroplastic ascorbate peroxidase isoenzymes play a dual role in photoprotection and gene regulation under photooxidative stress［J］.Plant and Cell Physiology，2010，51（2）：190-200.

（編輯：裴阿衛(wèi)）

The Response of Enzymatic Active Oxygen Scavenging System in Leaves of Buchloe dactyloides to Differences Photoperiod

LI Wei1，2，QIAN Yongqiang1，HAN Lei1，LIU Junxiang1，SUN Zhenyuan1，＊
（1Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration，Research Institute of Forestry，CAF，Beijing 100091；2College of Landscape Architecture and Forestry，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China）

We used Buchloe dactyloides.ramets as materials to research physiological metabolic response of B.dactyloides.leaves active oxygen scavenging system to differences photoperiod response.Clonal ramets were labeled as O（old sister ramet）and Y（young sister ramet），then we set connective group and disconnected group.O ramet and Y ramet were connected through the internode in connective group，whereas the internodes were cut off in disconnected group；the light cycle of O ramet was set for light 12h／dark 12hin both two groups，instead，light cycle of Y ramet was set for 12hdarkness／12hlight（just opposite to O ramet）.And the activities of superoxide dismutase（SOD），peroxidase（POD），catalase（CAT），ascorbate peroxidase（APX），and malondialdehyde（MDA）content of ramet leaves were continuous measured 48hillumination after cultivation of 7ddifferences photoperiod treatment and 72hstable illumination condi-tions.The results showed that after one weeks of different photoperiod treatments，under continuous light conditions，SOD，POD，CAT，APX activities and MDA content in disconnected ramets of B.dactyloides.leaves basically showed the opposite variation trend within 24h.However，SOD，POD，CAT，APX activities and MDA content in connected ramets of B.dactyloides.leaves presented convergence of variation trend within 24h.It indicated that reactive oxygen species scavenging system of B.dactyloides.showed rhythmic expression patterns，and B.dactyloides.connected ramets reactive oxygen species scavenging system tends to be synchronized under different photoperiod treatments.

Buchloe dactyloides（Nutt.）Engelm.ramets；photoperiod；reactive oxygen species scavenging system；synchronization

Q945.78

A

1000-4025（2015）07-1428-09

10.7606／j.issn.1000-4025.2015.07.1428

2014-04-28；修改稿收到日期：2015-05-28

國家自然科學(xué)基金（31100505）；中國林業(yè)科學(xué)研究院基金（CAFYBB2012043）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（RIF2014-03）

李偉（1985-），博士，主要研究方向?yàn)橹参锓肿佑N。E-mail：lwcsu_caf＠163.com

＊通信作者：孫振元，博士，研究員，主要研究方向?yàn)閳@林植物生理生態(tài)。E-mail：sunzy＠263.net