保存時(shí)間及離心速度對(duì)膽汁α淀粉酶活力影響的分析

李廣明，劉嘉悅，張桂信，李詩(shī)潔，尚 東，陳海龍，楊玉龍

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外三科，大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116011；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院膽石病中心，上海 200120）

膽汁淀粉酶作為診斷膽胰系統(tǒng)疾病的重要指標(biāo)，是醫(yī)學(xué)共識(shí)。在膽胰匯合結(jié)構(gòu)異常、膽系癌變、膽囊結(jié)石、膽管結(jié)石、膽道梗阻都發(fā)生改變[1-3]。膽汁淀粉酶的測(cè)定及研究對(duì)臨床胰腺及相關(guān)膽道疾病的探究和臨床科研具有重大意義[4-5]。目前，雖然對(duì)膽汁淀粉酶的病理生理及臨床意義的研究有了相關(guān)的進(jìn)展，但仍缺少對(duì)樣本的運(yùn)輸和保存受時(shí)間、溫度與離心速度影響的研究。因此，本研究參照臨床血液樣本檢測(cè)的常見(jiàn)誤差問(wèn)題[6]，探討保存時(shí)間以及離心速度對(duì)膽汁淀粉酶穩(wěn)定性的影響。這對(duì)膽汁淀粉酶測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性及檢驗(yàn)質(zhì)量的提升具有重要作用，為臨床研究提供相關(guān)的理論依據(jù)。

膽汁中為α淀粉酶?，F(xiàn)階段測(cè)定α淀粉酶主要方法有3種，分別為碘-淀粉比色法、2氯4硝基苯酚麥芽三糖苷（CNPG3）和亞乙基-NP-麥芽糖庚苷法（EPSG7法）[7]。利用碘-淀粉比色法測(cè)定淀粉酶活力，我國(guó)檢驗(yàn)科應(yīng)用最廣泛。與其他淀粉酶測(cè)定方法相比，碘-淀粉比色法有簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)及準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)[8]。因此，本研究選擇碘-淀粉比色法來(lái)測(cè)定膽汁α淀粉酶。

材料與方法

一、一般資料

收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外三科行內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)治療膽總管結(jié)石病人共27例。移動(dòng)式C型臂X射線機(jī)引導(dǎo)導(dǎo)絲進(jìn)入膽管。造影管進(jìn)入膽管2 cm，抽取膽汁10 mL。膽汁抽取后即刻用低溫樣本轉(zhuǎn)移箱轉(zhuǎn)移至4℃冰箱儲(chǔ)存。所有樣本行淀粉酶檢測(cè)并記錄，以作對(duì)比。

二、儀器與試劑

采用BioTek公司的Cytation 3細(xì)胞成像多功能檢測(cè)儀（微孔板檢測(cè)儀，即酶標(biāo)儀）。試劑采用南京建成生物的α淀粉酶試劑盒，用碘-淀粉比色法測(cè)定膽汁α淀粉酶活力。另有離心管、六孔板、水浴鍋、旋渦混勻器、低速離心機(jī)。

三、方法

（一）樣本采集

病人保持俯臥位或左側(cè)臥位，導(dǎo)管經(jīng)口腔、食管、胃到達(dá)十二指腸降部，通過(guò)十二指腸乳頭插入至膽管內(nèi)。注射造影劑前在導(dǎo)管外側(cè)端連接注射器，抽取膽汁。

（二）樣本分組研究保存時(shí)間和離心速度

將待測(cè)樣本隨機(jī)抽取18例研究保存時(shí)間。每例樣本旋渦振蕩后，立即在20 min內(nèi)分裝6份樣本，即6組。其中一份在30 min內(nèi)檢測(cè)，其余5份放置于 4℃冰箱中分別存放 3 h、12 h、24 h、72 h和30 d。 6 組保存時(shí)間分別為 30 min、3 h、12 h、24 h、72 h和30 d，每組18例。

其余9例樣本，每份樣本分為3份即3組，第一組不離心，余兩組分別以3 000 r/min、8 000 r/min速度離心，10 min后取上清液。3組研究離心速度分別為3 000 r/min和8 000 r/min，每組9例。

（三）樣本檢測(cè)

用碘-淀粉比色法測(cè)定膽汁α淀粉酶活力。按試劑盒說(shuō)明配制碘應(yīng)用液。取0.1 mL待測(cè)樣本與0.5 mL底物緩沖液混勻，37℃水浴7.5 min。后加入0.5 mL碘應(yīng)用液，加入3 mL雙蒸餾水?；靹蚝笥妹笜?biāo)儀檢測(cè)660 nm處吸光值。每份樣本平行測(cè)3次，取平均值。利用公式計(jì)算α淀粉酶活力。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0?統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。淀粉酶檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各時(shí)間點(diǎn)的測(cè)量值與初始（30 min值）測(cè)量值比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。不同離心速度比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、4℃保存膽汁α淀粉酶活力隨時(shí)間的變化

4℃保存3 h時(shí)，膽汁α淀粉酶活力下降幅度為0.73個(gè)百分點(diǎn)；保存12～72 h時(shí)，平均下降幅度約2.11個(gè)百分點(diǎn)；第30天時(shí)，下降幅度約3.94個(gè)百分點(diǎn)，P=0.33（＞0.05）。即膽汁中淀粉酶活力值雖有一定幅度的下降，但不超過(guò)5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在4℃條件下保存，30 d內(nèi)隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，膽汁α淀粉酶的穩(wěn)定性無(wú)明顯變化（見(jiàn)表1）。

表1 不同時(shí)間膽汁α淀粉酶活力（n=18）

二、膽汁α淀粉酶活力隨不同離心速度的變化

離心3 000 r/min后膽汁α淀粉酶活力較不離心下降2.70個(gè)百分點(diǎn)，8 000 r/min后下降8.98個(gè)百分點(diǎn)，離心8 000 r/min比離心3 000 r/min下降6.45個(gè)百分點(diǎn)（P＞0.05）。可能由于1例膽汁樣本含有大量泥沙，離心后膽汁中部分雜質(zhì)沉淀導(dǎo)致上清液中膽汁α淀粉酶活力出現(xiàn)變化，具體原因分析擬通過(guò)進(jìn)一步大樣本量實(shí)驗(yàn)觀察，明確結(jié)論（見(jiàn)表2）。

由于出現(xiàn)一例膽汁的異常數(shù)據(jù)，剔除后每組8例的結(jié)果為，離心3 000 r/min后膽汁α淀粉酶較不離心下降0.16個(gè)百分點(diǎn)，P=0.869；離心8 000 r/min膽汁α淀粉酶較膽汁不離心上升4.74個(gè)百分點(diǎn)，P=0.885；離心8 000 r/min與離心3 000 r/min之間上升4.91個(gè)百分點(diǎn)，P=0.753。說(shuō)明離心8 000 r/min之內(nèi)，膽汁淀粉酶的穩(wěn)定性無(wú)明顯改變（見(jiàn)表3）。

討 論

膽汁α淀粉酶主要來(lái)自于胰腺和唾液腺，但在特殊情況下，也可在扁桃體、子宮內(nèi)膜、肺、甲狀腺、輸卵管、前列腺內(nèi)存在并分泌[9]。正常生理狀態(tài)下，膽汁由膽鹽、膽色素、膽固醇、鈉、鉀等組成，不含淀粉酶，主要作用也僅是參與脂肪的消化與分解[1]。研究測(cè)定、分析膽汁淀粉酶有助于胰腺疾病和膽系疾病，尤其是膽系癌變疾病的診斷[10-12]。一般認(rèn)為，膽汁淀粉酶升高主要有以下兩方面原因：一方面，血清淀粉酶具有一定程度的熱不穩(wěn)定性，受到感染等影響，血清淀粉酶經(jīng)由肝臟的血液循環(huán)滲透至膽汁中，膽汁淀粉酶升高[13-15]；另一方面，膽胰管合流異常，胰液逆流入膽汁導(dǎo)致膽汁淀粉酶升高，而這也是膽汁淀粉酶升高的直接因素[16-19]。研究指出，膽胰反流存在于各種膽道疾病，包括急慢性膽管炎、膽管結(jié)石及膽管癌等良、惡性疾病[20-22]。

隨著內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)、經(jīng)皮經(jīng)肝膽管穿刺置管引流術(shù)等技術(shù)的不斷完善、發(fā)展，臨床收集膽汁越來(lái)越方便、快捷[23-24]。對(duì)膽汁淀粉酶的研究與分析逐漸深化，為臨床工作提供新的思路與方法。然而膽汁樣本淀粉酶的穩(wěn)定性對(duì)研究的最終結(jié)果起著重要甚至決定性影響，要求在儲(chǔ)存及檢測(cè)處理樣本時(shí)更嚴(yán)謹(jǐn)與科學(xué)。因此，本研究嚴(yán)格模擬膽汁樣本收集、儲(chǔ)存與檢測(cè)處理的相關(guān)狀態(tài)，控制實(shí)驗(yàn)條件，以確保最后結(jié)果的準(zhǔn)確性，為相關(guān)研究者提供確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，樣本數(shù)據(jù)整體變化較小，分布較均勻。膽汁在4℃保存30 d內(nèi)，總體平均差異幅度≤3.94個(gè)百分點(diǎn)，膽汁α淀粉酶活力未出現(xiàn)明顯下降，t=1.01，P=0.33。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，樣本穩(wěn)定性會(huì)出現(xiàn)變化，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明膽汁樣本4℃存放30 d內(nèi)，膽汁α淀粉酶總體活力仍相對(duì)穩(wěn)定。離心速度增加到8 000 r/min，α淀粉酶較原液下降8.98個(gè)百分點(diǎn)，但由于實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)一組異常數(shù)值，膽汁α淀粉酶為負(fù)值。經(jīng)分析，此組肉眼可見(jiàn)大量泥沙，可能影響測(cè)定結(jié)果，故將其剔除。在剔除該組異常值后，膽汁樣本離心8 000 r/min，α淀粉酶較原液上升4.74個(gè)百分點(diǎn)，P=0.885?？梢?jiàn)，在離心8 000 r/min內(nèi)隨著離心速度的增加，膽汁α淀粉酶活力值有一定的變化，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明膽汁樣本在8 000 r/min內(nèi)，離心前、后膽汁α淀粉酶總體活力穩(wěn)定。

本研究作為臨床多中心開(kāi)展探尋膽汁成分對(duì)膽胰疾病診斷意義的前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)之一，希望通過(guò)多中心、多地區(qū)的研究，加強(qiáng)對(duì)臨床工作中膽汁樣本保存的質(zhì)量控制。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，筆者集中解決以往研究的不足。樣本離體后的檢測(cè)方面，利用實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)室及人員安排等優(yōu)勢(shì)，取出標(biāo)本后即刻轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，并于30 min內(nèi)迅速檢測(cè)膽汁α淀粉酶活力，以求盡可能與離體前一致且準(zhǔn)確。儲(chǔ)存溫度及離心速度方面，選取研究常用溫度4℃保存，且不超過(guò)8 000 r/min離心，以模擬并接近樣本暫時(shí)儲(chǔ)存及檢測(cè)處理的狀態(tài)。

綜上所述，膽汁于4℃保存30 d內(nèi)，離心速度不超過(guò)8 000 r/min時(shí)，膽汁α淀粉酶活力相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明該溫度、周期及離心速度未影響膽汁α淀粉酶的穩(wěn)定性。膽汁中α淀粉酶活力在-20℃或-80℃等超低溫冰箱保存、離心超過(guò)8 000 r/min時(shí)的穩(wěn)定性變化有待進(jìn)一步研究。

表2 不同離心速度膽汁α淀粉酶活力變化（n=9）

表3 不同離心速度膽汁α淀粉酶活力變化（n=8）