限食后重飼大鼠軀干脂肪改變對骨密度的影響及機(jī)制

王素星，邵偉華，王 娜，呂彩霞

(河北省人民醫(yī)院老年病二科，河北 石家莊 050051)

限食后重飼，為短期熱卡限制后重新開放飲食，可導(dǎo)致能量攝入的波動(dòng)。不適當(dāng)限食減肥后飲食反彈、疾病和疾病的康復(fù)等均伴隨熱卡攝取的波動(dòng)[1]。脂肪組織是人體最大的能量儲(chǔ)存庫，通過脂肪合成、脂肪動(dòng)員儲(chǔ)存或釋放能量,應(yīng)對進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)、饑餓等代謝應(yīng)激[2]。故飲食改變可影響脂肪組織的代謝，而軀干部因其特殊解剖特點(diǎn)，成為脂肪更易聚集的部位。同時(shí)，能量攝入的波動(dòng)多伴隨有體重的改變，進(jìn)而使骨骼的承重負(fù)荷發(fā)生變化，極有可能影響骨代謝。近年來隨著對脂肪功能研究的深入，有關(guān)脂肪組織的不同分布類型對骨密度的作用也被不斷發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為脂肪分布可獨(dú)立于全身脂肪含量而對骨發(fā)生作用。在短期熱卡攝入波動(dòng)模型上，軀干部位的脂肪改變情況是怎樣的，與骨密度關(guān)系怎樣，值得研究。熱卡攝入的質(zhì)和量是一個(gè)可控因素，所以探討能量波動(dòng)與疾病之間的關(guān)系具有重要意義。雙能X線吸收測量法是目前檢測體成分與骨密度的最有效的手段[3]，并可對不同部位的脂肪含量進(jìn)行準(zhǔn)確評估，其檢測的軀干脂肪含量可作為肥胖的替代表型[4]。因此本研究以限制熱卡，進(jìn)而快速恢復(fù)不同飲食模式的成年大鼠為模型，檢測軀干體脂含量及全身骨密度，觀察營養(yǎng)改變過程中不同膳食模式對軀干脂肪含量及骨密度的影響，以及二者之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量(160±20)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(冀)2013-1-003。

1.2研究方法 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，實(shí)驗(yàn)周期分為4周和12周。4周組分為正常飲食組(normal control 4 week，NC4)和熱卡限制(calorie restriction for 4 weeks,R4)組，12周組分為正常飲食組(normal control 12 week，NC12)、限制飲食后重飼普通飲食組[(refeeding with normal chow，RN)，限食4周+8周正常飲食]、限制飲食后重飼高脂飲食組[(refeeding with high-fat diet,RH)，限食4周+8周高脂飲食]。動(dòng)物及普通飼料均購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，高脂飼料配制參閱國外配方[5]。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3指標(biāo)檢測

1.3.1體重測量 電子秤稱取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日體重及食物攝入質(zhì)量(精確至0.1 g)。

1.3.2軀干脂肪含量、軀干脂肪比例與骨密度測定 分別在實(shí)驗(yàn)的第4、12周末時(shí)，大鼠禁食過夜，精確稱量體重，按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥，待動(dòng)物肌力消失，呼吸平穩(wěn)，仰臥位將四肢用膠帶固定于硬紙板，從鼻尖掃描至尾端，選用美國GE Lunar公司生產(chǎn)的雙能X線吸收測量儀行軀干脂肪含量、軀干脂肪與全身脂肪比例及全身骨密度測定。

1.3.3腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Pierce公司)，按試劑盒說明操作。

1.3.4三酰甘油(triglyceride，TG)及游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)檢測 TG采用脂蛋白脂肪酶-甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法測定，按說明書操作。FFA測定采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5胰島素檢測 放免法測定血漿胰島素的濃度，遵照胰島素放免試劑盒說明書逐步進(jìn)行。

1.3.6骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物檢測 全自動(dòng)生化分析儀測定血清堿性磷酸酶水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清骨鈣素濃度,在450 nm波長下測光密度值(OD值),計(jì)算血清骨鈣素含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，本研究限于同周齡實(shí)驗(yàn)大鼠組內(nèi)比較，計(jì)量資料比較分別采用F檢驗(yàn)，SNK-q檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的兩指標(biāo)相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，不符合正態(tài)分布的兩指標(biāo)相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。使用多元逐步回歸分析比較全身骨密度與各個(gè)變量之間的關(guān)系，同時(shí)行共線性檢驗(yàn)，排除相關(guān)性強(qiáng)的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1體重比較 5組熱卡限制4周后，R4組與NC4組比較，體重顯著下降(P<0.01)；重飼后，RN及RH組體重均有不同程度提升，但較NC12仍為低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組體重比較

2.2軀干脂肪及骨密度比較 R4組軀干脂肪含量及軀干與全身脂肪比例在熱卡限制期與NC4組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但R4組全身骨密度下降明顯，與NC4組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重飼后，軀干脂肪含量及軀干與全身脂肪比例均明顯升高(P<0.05)，尤其是以RH組為著，但與RN組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RN組的全身骨密度達(dá)到NC12組水平，RH組的全身骨密度仍明顯低于NC12組，亦較RN組顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 軀干脂肪和骨密度比較

2.3FFA、TG及血清胰島素(fasting serum lisulin，F(xiàn)INS)水平比較 R4組TG下降明顯，與NC4組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)INS、FFA變化不明顯。重飼后，RN及RH組血清FFA、TG及FINS水平均顯著高于NC12組水平(P<0.01)，其中RH組FINS及FFA水平亦較RN組明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 血清FFA、TG及FINS水平比較

2.4炎癥因子比較 熱卡限制使R4組血清TNF-α、IL-6水平明顯降低，與NC4組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。開放飲食后，RN及RH組血清TNF-α、IL-6水平較NC12組比較均顯著升高(P<0.01)，以RH組升高顯著(P<0.05)。見表4。

2.5血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平比較 熱卡限制使R4組血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平明顯降低，與NC4組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。重飼后，RN及RH組血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平有所提升，但仍明顯低于NC12(P<0.05)。見表5。

表5 血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平比較

2.6Pearson′s相關(guān)分析 全身骨密度與體重、堿性磷酸酶、骨鈣素呈正相關(guān)(r=0.662、0.613、0.589，P<0.05)；與軀干脂肪含量、軀干脂肪比例、FISN、FFA、TNF-α、IL-6成負(fù)相關(guān)(r=-0.818、-0.794、-0.623、-0.649、-0.662、-0.537，P<0.05)。進(jìn)一步行逐步回歸分析顯示軀干脂肪含量、軀干脂肪比例是影響全身骨密度的重要因素(r2=0.823，P<0.001)。

3 討 論

因疾病或其他原因?qū)е聶C(jī)體暫時(shí)能量攝入減少，隨著不利因素解除，飲食恢復(fù)，進(jìn)而可補(bǔ)充前期能量不足時(shí)機(jī)體的消耗。故機(jī)體能量攝入的波動(dòng)是一種常見的病理生理現(xiàn)象，這個(gè)過程中各系統(tǒng)發(fā)生的代謝改變越來越引起人們的關(guān)注[6]。研究證實(shí)體成分受能量供應(yīng)及飲食的影響[7]。有研究報(bào)道，給予40%～60%熱卡限制后，大鼠脂肪組織減少明顯[8]。然而本研究顯示限食階段軀干脂肪含量及與全身脂肪比例變化不明顯。考慮本研究與其他研究熱卡限制程度及時(shí)間、飼料成分存在差異等有關(guān)。但熱卡限制導(dǎo)致骨密度下降明顯，這與眾多研究結(jié)果相一致[9-10]。飲食恢復(fù)后，RN及RH組均表現(xiàn)出軀干脂肪堆積的現(xiàn)象，至飲食恢復(fù)8周時(shí)，軀干脂肪含量及與全身脂肪比例均顯著高于NC組，以RH組為著。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高脂重飼RH組全身體重指數(shù)恢復(fù)程度較普通飲食重飼RN組為差。兩組重飼實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在體重尚未完全恢復(fù)的情況下，均出現(xiàn)軀干脂肪堆積明顯，并伴隨全身骨骼密度降低，我們推測在該模型上，軀干部位的脂肪堆積對骨代謝產(chǎn)生了負(fù)性影響。

需要注意的是，熱卡限制是重飼以正常飲食RN組與正常對照NC組的唯一不同之處，我們考慮熱卡限制可能是限食后重飼模型軀干脂肪及骨密度改變的始動(dòng)因素，這可能與熱卡限制激活了能量節(jié)約代謝機(jī)制密切相關(guān)。另外，相對于正常飲食重飼，高脂重飼對機(jī)體代謝影響更為明顯。我們分析高脂再喂養(yǎng)較正常飲食提供了更多熱量，而調(diào)節(jié)營養(yǎng)底物氧化代謝是機(jī)體適應(yīng)不同生理及營養(yǎng)狀況的一種重要機(jī)制。有研究顯示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在限食期間對脂肪的氧化能力低于碳水化合物[11]。提示營養(yǎng)底物供應(yīng)模式的轉(zhuǎn)變是導(dǎo)致限食后重飼模型中脂質(zhì)堆積的重要原因。同時(shí)，熱卡限制降低了成骨細(xì)胞活性和骨形成，損害骨礦化和生物力學(xué)[9-10]，重飼以高脂飲食后，高脂飲食本身及更為顯著的軀干脂肪堆積進(jìn)一步加劇了骨破壞，故至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，RH組骨密度恢復(fù)程度較RN組為差。

肥胖與骨代謝的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，既往研究表明，超重或肥胖者骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下降，體重和骨密度呈正相關(guān)[12-13]。其原因之一可能為增加的體重加大了對骨骼的重力負(fù)荷和機(jī)械刺激。然而近年來肥胖與骨密度的關(guān)系出現(xiàn)了爭議，有研究表明在去除了體重對于骨礦密度的作用后，發(fā)現(xiàn)脂肪組織的增加并不能預(yù)防骨質(zhì)疏松,甚至可能產(chǎn)生負(fù)性的影響[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)重飼后軀干脂肪增多，機(jī)體出現(xiàn)高胰島素血癥。有研究報(bào)道血胰島素水平不足是糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松原因之一,外源性補(bǔ)充胰島素可刺激成骨細(xì)胞內(nèi)骨基質(zhì)的合成,促進(jìn)成骨細(xì)胞攝取葡萄糖,進(jìn)而使骨基質(zhì)和骨密度增加[15]。對此我們考慮對于單純胰島素不足，補(bǔ)充胰島素可促進(jìn)骨形成，預(yù)防骨質(zhì)疏松，我們的模型存在胰島素分泌過量甚至胰島素抵抗[6]，后者可影響1α-腎羥化酶的活性，影響腎臟對鈣、磷的調(diào)節(jié)，鈣流失增多,以及繼發(fā)甲狀旁腺激素等激素分泌異常，進(jìn)而影響骨代謝[16]。另外，我們的結(jié)果顯示血清游離脂肪酸和甘油三酯水平亦升高明顯，后者進(jìn)一步加重胰島素抵抗，負(fù)面調(diào)控骨代謝。

本研究重飼后，血清TNF-α、IL-6水平顯著升高。腹部脂肪細(xì)胞不僅儲(chǔ)存能量，而且分泌大量的細(xì)胞因子，TNF-α、IL-6等炎性物質(zhì)使組織處于一種“慢性炎癥”環(huán)境中，在這一環(huán)境中，RANKL作為腫瘤壞死因子超家族的成員被明顯上調(diào)，它在破骨細(xì)胞前體向破骨細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵作用[17]，從而促進(jìn)骨吸收。需要提出的是，熱卡限制期間，炎癥因子與骨密度呈相同的變化趨勢，我們推測限食期間營養(yǎng)底物供應(yīng)不足，軀干脂肪含量變化不明顯，故炎癥因子分泌較少，同時(shí)熱卡限制導(dǎo)致機(jī)體能量優(yōu)先供應(yīng)重要臟器，骨生成受抑。

相對于RN組，RH組炎癥因子以及FISN、FFA、TG升高趨勢更為明顯，考慮與RH組軀干部位堆積了更多的脂肪，進(jìn)而胰島素抵抗、脂代謝紊亂、炎癥因子釋放程度較RN組更為顯著，故對骨代謝影響更為明顯，導(dǎo)致血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平下降顯著，后二者在骨骼發(fā)育與重建的過程中起重要作用[18]。

綜上所述，限食后重飼可以導(dǎo)致軀干部脂質(zhì)含量及與全身脂肪比例增加，以高脂飲食重飼為著；熱卡限制導(dǎo)致骨密度下降明顯，高脂飲食重飼較正常飲食重飼骨密度恢復(fù)程度差；軀干脂肪含量及比例增加導(dǎo)致的高胰島素血癥、脂質(zhì)外溢、炎癥因子分泌增多，進(jìn)而影響骨轉(zhuǎn)換，可能是降低全身骨密度的重要原因。