河南省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型全基因組的克隆與序列分析

朱前磊，宋 丹，楊海波，趙美雪，張利平，劉 敏，陳紅英

(1.河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450008；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一[1]。根據(jù)致病性、抗原性和核酸序列的差異，將PCV分為PCV-1和PCV-2，PCV2又分為PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d[2,3]，2003年以后PCV2b逐漸變?yōu)閮?yōu)勢(shì)流行毒株[4]。PCV-1基因組全長(zhǎng)1 759 bp，毒株間的核酸序列同源性大于99%。PCV-2全長(zhǎng)1 768 bp或1 767 bp，毒株間的核酸序列同源性大于96%。PCV-1和PCV-2的核酸序列同源性小于80%。雖然PCV1對(duì)豬無(wú)致病性，但在生豬及豬源細(xì)胞中的污染面很廣。

PCV2是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrom，PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis nephro-pathy syndrome，PDNS)和新生仔豬A2型先天性震顫的主要病原[5]。從2000年首次檢出PCV2病原以來(lái)，我國(guó)相繼發(fā)現(xiàn)PCV2的感染現(xiàn)象。河南省是養(yǎng)豬大省，近年來(lái)PCV2在豬場(chǎng)中污染面非常廣。為了解河南省不同地區(qū)豬場(chǎng)PCV2的變異情況，本試驗(yàn)從河南省5個(gè)疑似患有PWMS的豬場(chǎng)采集病料樣本，先用PCR方法進(jìn)行PCV2的檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)一步進(jìn)行PCV2擴(kuò)增、全基因組測(cè)序及序列分析，本試驗(yàn)對(duì)河南省PCV2分子流行病學(xué)的研究和豬圓環(huán)病毒病的預(yù)防與控制具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和病料

pMDTM18-T Vector Cloning Kit購(gòu)自TaKaRa公司。大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。5份疑似PCV2感染豬的脾臟組織分別來(lái)自河南省淮陽(yáng)、濮陽(yáng)、鶴壁、開(kāi)封、原陽(yáng)的豬場(chǎng)，分別命名為HY、PY、HB、KF和YY，于-20℃凍存。

1.2 酶和試劑

ExTaq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和SalI等購(gòu)自TaKaRa公司。DNA提取試劑盒購(gòu)自江蘇天隆科技信息有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)GenBank發(fā)布的PCV2全基因組序列(登錄號(hào)：HQ650833)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(P1/P2)，擴(kuò)增PCV2基因部分片段；設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(P3/P4)，擴(kuò)增PCV2全基因組。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。引物序列為：

上游引物P1：5′-CGG ATA TTG TAG TCC TGG TCG-3′

下游引物P2：5′-ACT GTC AAG GCT ACC ACA GTCA-3′

上游引物P3：5′-TAT CCG CGG GCT GGC TGA ACT TTT GAA-3′

下游引物P4：5′-GTG CCG CGG AAA TTT CTG ACA AAC GTT-3′

1.4 病料的PCR檢測(cè)

將疑似病料解凍，將組織塊放入2 mL Ependorf管中，用組織研磨機(jī)研磨，取上清液200 μL，提取DNA。用特異性引物(P1/P2)擴(kuò)增PCV2基因部分片段，PCR反應(yīng)體系為：DNA模板3 μL, 上、下游引物(P1/P2)各0.5 μL，Premix Taq酶12.5 μL，去離子水8.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。

1.5 PCV2全基因組擴(kuò)增

利用引物P3/P4擴(kuò)增PCV2全基因組。50 μL PCR反應(yīng)體系為：DNA模板6 μL，上、下游引物(P3/P4)各1 μL，Premix Taq酶25 μL，去離子水17 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。核酸擴(kuò)增陽(yáng)性的樣本進(jìn)行DNA的回收。

1.6 PCV2全基因組的克隆與測(cè)序

將回收純化的PCR產(chǎn)物連接至pMDTM18-T載體上，獲得重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。選擇酶切和PCR鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.7 基因組序列分析

將測(cè)序基因組進(jìn)行Blast比對(duì)，確定其是否為PCV2基因組，若是PCV2基因組，用DNAstar軟件將所測(cè)基因組與GenBank上的其它PCV2毒株的基因組(表1)進(jìn)行比對(duì)，分析它們之間的同源性并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 疑似病料的PCR檢測(cè)結(jié)果

以疑似病料的DNA為模板，以P1/P2為引物，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。結(jié)果出現(xiàn)5條約470 bp左右的條帶，說(shuō)明5個(gè)疑似病料的檢測(cè)結(jié)果均為PCV2陽(yáng)性。

圖1 病料中PCV2的PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 全基因組的PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCV2全基因組的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。5個(gè)病料樣本均擴(kuò)增出約1 800 bp左右的條帶。

圖2 PCV2 DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒PCR鑒定

重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，5個(gè)病料樣本均擴(kuò)增出約1 800 bp左右的條帶。

圖3 重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和SalI酶切后，電泳出現(xiàn)一條約2 600 bp和一條約1 400 bp的特異性條帶(圖4電泳2道)。重組質(zhì)粒經(jīng)SalI酶切，出現(xiàn)一條約4 500 bp的條帶(圖4電泳3道)。

圖4 重組質(zhì)粒的限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定

2.5 PCV2全基因組序列測(cè)定及分析

2.5.1 序列測(cè)定及分析

測(cè)序結(jié)果表明，5個(gè)毒株全基因組長(zhǎng)度均為1 767 bp。5個(gè)毒株基因組序列的同源性為96.1%～99.9%，其中PY毒株與HY毒株基因組序列的同源性最高(99.9%)(圖5)。所測(cè)的5個(gè)毒株基因組序列與GenBank中其它河南省參考毒株(表1)基因組序列的同源性為95.6%～99.8%，KF毒株與JZS-1毒株基因組序列的同源性最高(99.8%)(圖5)。

圖5 河南部分地區(qū)PCV2全基因組同源性分析

表1 序列對(duì)比與分析所參照的河南各地區(qū)其它圓環(huán)病毒毒株

2.5.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

在分析毒株同源性的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖6所示。PCV2毒株形成兩大分支，在PCV2的大分支中又有許多小分支，其中PY和HY在一個(gè)大分支，KF、YY和HB在另一個(gè)大分支上。

圖6 河南部分地區(qū)PCV2基因組進(jìn)化樹(shù)圖

3 討論

PMWS是近年來(lái)影響?zhàn)B豬業(yè)的主要疾病之一，PCV2是引起該病的主要病原[6]。PCV2無(wú)論在生豬或病死豬中的檢出率都非常高，因此對(duì)該病的防控已迫在眉睫。本研究對(duì)河南省部分豬場(chǎng)圓環(huán)病毒基因組序列進(jìn)行分析，對(duì)本地PCV2流行毒株基因遺傳變異的研究和候選疫苗的研制具有重要的意義[7]。

本研究先對(duì)疑似病料進(jìn)行檢測(cè)以確定是否感染，然后進(jìn)行全基因擴(kuò)增，這樣全基因擴(kuò)出的機(jī)率更高。本研究成功擴(kuò)增5株P(guān)CV2全基因組序列，大小均為1 767 bp。所擴(kuò)增的5個(gè)毒株基因序列的同源性介于96.1%～99.9%，其中 PY毒株與HY毒株基因序列的同源性最高(99.9%)。這5個(gè)毒株與GenBank其它河南省參考毒株基因序列的同源性為95.6%～99.8%，KF毒株與JZS-1毒株基因序列的同源性最高(99.8%)。由此可見(jiàn)，PCV2毒株的核苷酸序列都有較高的同源性，說(shuō)明PCV2毒株間的親緣關(guān)系很近，PCV2病毒進(jìn)化速度較慢。