火雞組織滴蟲熒光定量PCR 檢測方法的建立及初步應(yīng)用

陳喬光，孔令明，戎 杰，候照峰，劉丹丹，陶建平，許金俊*

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

組織滴蟲?。℉istomonas meleagridis）是由火雞組織滴蟲感染禽類后引起的一種寄生蟲病，又稱黑頭病或盲腸肝炎[1]，是對養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害的一種疾病[2]。目前，該病在散養(yǎng)雞、特種禽類及動物園禽類中較為常見。組織滴蟲病在臨床上主要引起盲腸炎、肝炎、腹膜炎[3]，感染后首先出現(xiàn)盲腸壁的增厚和充血，隨病程發(fā)展，肝臟出現(xiàn)腫大，表面有大量火山口樣壞死灶[4]，該病發(fā)病率較高，死亡率可達(dá)20%～30%[5]，造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。

臨床上對組織滴蟲病的診斷仍然主要依靠剖檢、顯微鏡刮片鏡檢、蟲體的體外分離培養(yǎng)[6]等方法。由于肝臟和盲腸的病變與弧菌性肝炎、球蟲病等禽病類似，且病原形態(tài)也不易與四毛滴蟲等原蟲區(qū)分，體外分離培養(yǎng)不易實現(xiàn)，給該病的診斷帶來了一定的困難。目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種檢測火雞組織滴蟲的方法。Hafez 等建立了火雞組織滴蟲熒光定量PCR 檢測方法，敏感性較高，但未進(jìn)行臨床樣品的檢測試驗[7]；Meike 等建立了火雞組織滴蟲原位雜交檢測方法，特異性較強(qiáng)，但成本較高[8]；曲昌寶等建立了雞組織滴蟲病PCR 診斷方法，特異性較強(qiáng)，但敏感性較低[5]。本研究以火雞組織滴蟲高度保守的18S rRNA 基因序列作為靶標(biāo)，建立了火雞組織滴蟲熒光定量PCR 檢測方法，并對采集的臨床樣品進(jìn)行檢測，以期為臨床組織滴蟲病流行病學(xué)調(diào)查提供一種敏感、特異、重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)的診斷技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株和臨床樣品雞源火雞組織滴蟲標(biāo)準(zhǔn)蟲株（JSYZ-D）由本實驗室分離并保存；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室制備；147 份病雞臨床樣品（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、回腸、盲腸各21 份）采集自江蘇省各地送至揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院就診的疑似病例，病雞均表現(xiàn)精神沉郁、垂翅等癥狀，剖檢可見肝臟有壞死灶、盲腸有腫大栓塞或出血等病理變化；柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、弓形蟲、犬巴貝斯蟲等蟲體DNA 由本實驗室保存。

1.2 主要試劑10×PCR Buffer、dNTP、Taq 酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、pGEM-T Easy、DNA Marker、DNA Ligation 試劑盒、DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等均購自TaKaRa 公司；蛋白酶K、RNase 購自上海生工生物工程公司；瓊脂糖、IPTG、X-gal 購自美國Promega 公司；SYBR Green I Master 購自瑞士Roche 公 司。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)文獻(xiàn)[9]設(shè)計PCR 引物：F1：5'-GAAAGCATCTATCAGTGGAA-3'/R1：5'-GATC TTTTCAAATTAGCTTTAAA-3'，擴(kuò)增片段長度576 bp，用于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備和后續(xù)的PCR 檢測；根據(jù)火雞組織滴蟲18S rRNA 的保守區(qū)域[10]設(shè)計熒光定量PCR 引物：F2：5'-GGCGAAAGCATCTATCAAGTGG-3'/R2：5'-CTCGTCGGCATAGTTTAAGGTAGG-3'，擴(kuò)增片段長度106 bp，引物由華大基因公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備以DNA 提取試劑盒提取火雞組織滴蟲基因組DNA為模板，使用引物（F1/R1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃2 min；95 ℃35 s，57 ℃35 s，72 ℃45 s，35 個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，回收純化后，克隆至pGEM-T Easy 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-HM1，經(jīng)酶切鑒定后，由華大基因公司測序鑒定。利用NanoDrop2000 測定質(zhì)粒濃度，換算成拷貝數(shù)，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化以濃度為4.6×1011拷貝/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用矩陣法分別對 引物濃度（5 μmol/μL、10 μmol/μL、15 μmol/μL、20 μmol/μL、30 μmol/μL）和退火溫度（58 ℃、60 ℃、62 ℃）進(jìn)行優(yōu)化，摸索最佳反應(yīng)條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將已制備好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋（1012拷貝/μL～10-1拷貝/μL），在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，選擇連續(xù)的5 個濃度，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗以火雞組織滴蟲標(biāo)準(zhǔn)株、犬巴貝斯蟲、弓形蟲、雞毒害艾美耳球蟲、雞柔嫩艾美耳球蟲基因組DNA 為模板，采用建立的熒光定量PCR方法分別擴(kuò)增，同時以雙蒸水作為陰性對照，檢測本研究建立的熒光定量PCR 方法的特異性。

1.8 敏感性試驗將10 倍倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（1012拷貝/μL～10-1拷貝/μL）作為模板，采用熒光定量PCR 方法擴(kuò)增，以確定本研究建立的熒光定量PCR方法的檢測下限，同時設(shè)雙蒸水作為陰性對照。

1.9 重復(fù)性試驗以同一批次提取的不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（4.6×1010拷貝/μL、4.6×109拷貝/μL、4.6×108拷貝/μL）作為模板，采用熒光定量PCR 方法進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗，每個濃度重復(fù)3 次。同時將3個不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分成3 個批次，采用熒光定量PCR 方法進(jìn)行組間重復(fù)性試驗。以評估本研究建立的火雞組織滴蟲熒光定量PCR 方法的重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測將本實驗室采集的147 份雞組織（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、回腸、盲腸各21 份）樣品按常規(guī)方法處理消化后，利用DNA試劑盒提取病料的DNA 作為模板，利用本研究建立的火雞組織滴蟲熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測，每次檢測均設(shè)置火雞組織滴蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作陽性對照，雙蒸水作陰性對照，記錄試驗結(jié)果，并同時利用本實驗室前期建立的PCR 方法[5]進(jìn)行檢測，比較分析二者的檢測結(jié)果。

1.11 數(shù)據(jù)處理與分析利用SPSS 22 軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行單因素“平均數(shù)+方差”分析，并進(jìn)行Tukey、Duncan 多重比較，以p<0.05 作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果以火雞組織滴蟲基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增18S rRNA 序列，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到576 bp 的目的條帶。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后連接pGEM-T Easy 載體，提取質(zhì)粒后進(jìn)行EcoR I 酶切鑒定，結(jié)果可見載體片段和576 bp 的目的片段（圖1），經(jīng)測序，結(jié)果顯示其為火雞組織滴蟲18S rRNA 基因片段。NanoDrop2000 測定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為88.5 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為4.6×1012拷貝/μL。

2.2 熒光定量PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果經(jīng)數(shù)次試驗，并對熒光定量PCR 結(jié)果進(jìn)行分析，最終確定反應(yīng)條件：反應(yīng)總體系20 μL，其中SYBR Green I Master 熒光染料10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，質(zhì)粒模板2 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)程序為：95 ℃300 s，95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃15 s，共40 個循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立根據(jù)檢測結(jié)果建立熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2A）與熔解曲線（圖2B）。結(jié)果顯示當(dāng)質(zhì)粒濃度為4.6×106拷貝/μL～4.6×1010拷貝/μL時，其與Cq值的線性關(guān)系最佳（圖2）。Cq值和標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)（q）之間的線性關(guān)系表達(dá)式：Cq=-3.32log10（q）+58.19，R2=0.9939，Error=0.369，E=2.001。

圖2 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）與熔解曲線（B）Fig.2 Standard curve(A) and melting curve(B) of qPCR

2.4 特異性試驗結(jié)果利用所建立的熒光定量PCR方法檢測常見的幾種寄生蟲基因組，并以雙蒸水作陰性對照。結(jié)果顯示，除火雞組織滴蟲外，其余病原均無特異性擴(kuò)增（圖3），表明所建立的火雞組織滴蟲熒光定量PCR 檢測方法特異性較強(qiáng)。

圖3 特異性試驗結(jié)果Fig.3 Specificity test of the qPCR

2.5 敏感性試驗結(jié)果分別以各個稀釋度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（4.6×1012拷貝/μL～4.6×10-1拷貝/μL）進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中含有4.6×102拷貝/μL 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品時仍可產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，而陰性對照無擴(kuò)增（圖4）。表明本研究所建立的方法敏感性較高。

圖4 敏感性試驗結(jié)果Fig.4 Sensitivity test of the qPCR

2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果顯示變異系數(shù)在0.09%～0.33%，批間重復(fù)性試驗變異系數(shù)在0.08%～0.21% 。批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于1%（表1），3 次試驗結(jié)果經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。表明建立的火雞組織滴蟲熒光定量PCR 方法重復(fù)性較好。

2.7 臨床病料中火雞組織滴蟲檢測結(jié)果利用建立的熒光定量PCR 方法對147 份臨床樣品的DNA 進(jìn)行檢測，并與普通PCR 檢測方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，熒光定量PCR方法的總檢出率為42.9%（63/147），略高于普通PCR 方法的總檢出率37.4%（55/147）。其中，肝臟、盲腸的檢出率分別達(dá)到71.4%和66.7%，明顯高于普通PCR的檢出率57.1%和52.4%（p<0.05），表明本研究所建立的火雞組織滴蟲熒光定量PCR 檢測方法敏感性更佳，可以用于臨床樣品的檢測。

表1 熒光定量PCR 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 1 The result of qPCR repeatability test

表2 兩種方法檢測病死雞臟器組織結(jié)果的比較Table 2 Compairation of two different methods for detection of H. meleagridis in organs of sick chicken

3 討 論

本實驗根據(jù)火雞組織滴蟲的18S rRNA 基因序列，設(shè)計了熒光定量PCR 檢測引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增其18S rRNA 基因后，構(gòu)建了含該基因的標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行了熒光定量PCR 條件優(yōu)化，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了火雞組織滴蟲的SYBR Green I 熒光定量PCR 檢測方法。特異性試驗顯示，本實驗建立的方法可以有效地區(qū)分組織滴蟲與雞盲腸球蟲及其他相似原蟲。敏感性試驗顯示，所建立的熒光定量PCR 方法檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的下限為4.6×102拷貝/μL，較本實驗室之前建立的普通PCR 方法的檢測限高了100倍[5,11]，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。重復(fù)性檢測結(jié)果表明，該技術(shù)重復(fù)性較好，在實際生產(chǎn)中具有較高的適用性。利用該熒光定量PCR 方法檢測臨床疑似火雞組織滴蟲感染的病料樣品時，總陽性率比常規(guī)PCR方法的檢測陽性率高5.5%（42.9%/37.4%）。并且兩種檢測方法在肝臟、盲腸這兩個靶器官的檢出率存在顯著差異（p<0.05）。

本研究中初步建立的熒光定量PCR 方法特異性強(qiáng)，檢出率和準(zhǔn)確率較高，與Hafez 等人的結(jié)論基本相符[7]。本實驗建立的檢測方法敏感性較Hafez 的檢測方法高1 000 倍[7]，究其原因，可能是兩者擴(kuò)增的靶基因不同所致。Hafez 等人采用的靶基因是將火雞組織滴蟲與毛滴蟲基因序列進(jìn)行比對后篩選的是同源性最低的部分序列，而本實驗所用目的基因為火雞組織滴蟲特異性多拷貝的18S rRNA 序列。此外，本實驗所用的熒光定量PCR 引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件也存在一定的差異。與Meike 等人[8]所建立的原位雜交法相比，本研究建立的熒光定量PCR 方法不僅特異性上與之相當(dāng)，而且操作更簡便，檢測速度更快，且成本更低。相比普通PCR 方法，本研究所建立的熒光定量PCR 方法對臨床疑似病料中的火雞組織滴蟲檢出率更高。本研究建立的該方法為臨床上禽組織滴蟲病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的技術(shù)手段。