牛輪狀病毒和牛冠狀病毒雙重TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

彭志豪，韓蕎憶，崔明江，范葶莉，劉 瑩，王夢(mèng)佳，馬玉忠，左玉柱*，任玉紅*，范京惠*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省畜牧總站，河北 石家莊 050035；3.滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 滄州 061000）

牛輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV）和牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCV）是引起犢牛腹瀉的主要病原，感染犢牛后引起的疾病具有發(fā)病率高、流行性廣、危害性大等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。BRV 臨床上常導(dǎo)致30 日齡內(nèi)犢牛水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水和酸中毒，7 日齡犢牛感染BRV 時(shí)病死率較高，部分表現(xiàn)為溫和性自限性腹瀉和隱性感染[1-2]。BCV 主要引起犢牛出血性腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道感染，該病嚴(yán)重影響病畜的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能的發(fā)揮[1,3]。由于二者臨床上難以僅憑癥狀鑒別，且常發(fā)生混合感染，加重腹瀉的嚴(yán)重程度，導(dǎo)致死亡率升高[2]，因此建立一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法對(duì)準(zhǔn)確診斷BRV 和BCV 的感染具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR 方法在檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣，而TaqMan 熒光定量PCR 是近些年來(lái)新一代的檢測(cè)方法，該方法用來(lái)檢測(cè)樣品的同時(shí)還可以對(duì)病毒拷貝數(shù)準(zhǔn)確定量，在病原診斷和分析方面具有更廣闊的應(yīng)用前景[4]。目前，尚無(wú)針對(duì)BRV 和BCV 的雙重TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)方法的報(bào)道?；诖?，本研究根據(jù)BRV VP6 基因保守序列和BCV N 基因保守序列分別設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物和探針，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)BRV 和BCV 的雙重TaqMan 熒光定量PCR 方法，為BRV 和BCV 的臨床檢測(cè)提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒及樣品牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BCV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛細(xì)小病毒（BPV）、牛腸道病毒（BEV）、牛傳染性鼻氣管炎（IBRV）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院保存。72 份牛腹瀉糞便樣品于2019 年3 月～9 月采自河北省不同規(guī)?；?chǎng)，保存于-80 ℃。

1.2 主要試劑DNA/RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、Fast TaqMan Mixture購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司、Super GelRed?核酸染料購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank 登錄 的BRV VP6 基 因（MN047454）和BCV N 基 因（MN517908）序列，利用Beacon designer 7 分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物和探針（表1）。引物和探針均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR 探針及引物Table 1 Primers and probes for the real-time PCR

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和鑒定利用DNA/RNA 提取試劑盒提取BRV、BCV 病毒核酸，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，分別作為模板，以BRV-F/BRV-R 和BCV-F/BCV-R 引物分別經(jīng)PCR 擴(kuò)增相應(yīng)病毒目的基因。BRV 的反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94℃30 s、53 ℃30 s、72 ℃15 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。BCV的反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94℃30 s、54 ℃30 s、72 ℃15 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物純化回收后連接到pMD19-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，PCR 鑒定為陽(yáng)性后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序鑒定，并利用Nanodrop 2000 測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，作為相應(yīng)病毒的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 雙重?zé)晒舛縋CR 條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用方陣法優(yōu)化引物探針濃度，體系為20 μL，其中2×Fast TaqMan Mixture 10 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.1 μL、0.2 μL、0.3 μL、0.4 μL、0.5 μL、0.6 μL，探針（10 μmo1/L）各0.1 μL、0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL，BRV 和BCV 重組 質(zhì) 粒 標(biāo) 準(zhǔn)品 各1 μL 混勻后作為模版，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。使用優(yōu)化好的引物和探針體系經(jīng)PCR 擴(kuò)增，優(yōu)化退火溫度（56 ℃～62 ℃）。

將BRV 和BCV 的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按1:1 混勻后10 倍倍比稀釋，選取6 個(gè)濃度（1.0×107拷貝/μL～1.0×102拷貝/μL）作為模板，按照優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)利用DNA/RNA 提取試劑盒提取BRV、BCV、BVDV、BEV、IBRV、BPV 病毒核酸后，將各病毒DNA 和反轉(zhuǎn)錄得到的各病毒cDNA 作為模板，同時(shí)以ddH2O 作為陰性對(duì)照，利用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR 擴(kuò)增，評(píng)估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)將稀釋成1.0×107拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL 的BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，利用優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縋CR 進(jìn)行擴(kuò)增，確定其敏感性，同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室建立的常規(guī)PCR 進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：將濃度為1.0×106拷貝/μL～1.0×102拷貝/μL 的BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，利用優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縋CR方法進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3 次；選取3 個(gè)不同時(shí)間，對(duì)上述5 個(gè)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組間重復(fù)性試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到的Ct 值來(lái)計(jì)算組內(nèi)組間變異系數(shù)，評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)從河北省不同地區(qū)的規(guī)?；?chǎng)中采集的72 份腹瀉糞便樣品，PBS 稀釋后提取核酸反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后作為模板，利用本實(shí)驗(yàn)建立的雙重TaqMan 熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室建立的常規(guī)PCR 對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較二者的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果將BRV 和BCV 病毒核酸作為模板，利用BRV-F/BRVR 和BCV-F/BCV-R PCR 擴(kuò)增后，分別在116 bp 和139 bp 出現(xiàn)和預(yù)期相符的目的條帶（圖1）。PCR 產(chǎn)物純化回收后克隆至pMD19-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-BRV和pMD-BCV，測(cè)序結(jié)果顯示插入片段與預(yù)期一致，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)計(jì)算pMDBRV和pMD-BCV的拷貝數(shù)分別為4.36×1010拷貝/μL和3.55×1010拷貝/μL。

圖1 目的基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立通過優(yōu)化后，雙重TaqMan 熒光定量PCR 的最佳反應(yīng)體系為20 μL：Fast TaqMan Mixture 10 μL；BRV-F/BRV-R（20 μmoL/L）各0.3 μL，BRV 探針（10 μmoL/L）0.2 μL；BCV-F/BCV-R（20 μmoL/L）0.2 μL，BCV 探針（10 μmoL/L）0.2 μL；模板2 μL；ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件確定為：95 ℃5 min；95 ℃10 s，58 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)。

將BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋后作為模板，經(jīng)雙重TaqMan 熒光定量PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在1.0×107拷貝/μL～1.0×102拷貝/μL 時(shí)與Ct 值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程式分別為BRV：y=-3.3064x+38.76 E=107%；BCV：y=-3.1551x+41.81，E=102%，R2均大于99%（圖2）。因此可以根據(jù)檢測(cè)樣品的Ct 值，對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

圖2 BRV 和BCV 雙重?zé)晒舛縋CR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of BRV and BCV duplex real-time PCR

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果分別以BRV、BCV、BVDV、BEV、IBRV、BPV 的核酸作為模板，同時(shí)以ddH2O作為陰性對(duì)照，利用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行雙重TaqMan 熒光定量PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，除BRV 和BCV 的核酸擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性外，其他均為陰性結(jié)果（圖3），表明該檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖3 熒光定量PCR 的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity test result of the real-time PCR

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果將BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1.0×107拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL 后，經(jīng)雙重TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)其敏感性。結(jié)果顯示，BRV 和BCV 的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限分別為4.18×101拷貝/μL 和3.55×100拷貝/μL（圖4）；而常規(guī)PCR 對(duì)BRV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限為4.18×104拷貝/μL，對(duì)BCV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出最低限為3.55×103拷貝/μL（圖5）。表明該方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR，敏感性較高。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果采用本研究建立的雙重Taq?Man 熒光定量PCR 進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示組內(nèi)組間的變異系數(shù)均小于2%（表2），表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果利用建立的雙重Taq?Man 熒光定量PCR 方法對(duì)來(lái)自河北省的72 份腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示， BRV 陽(yáng)性率為50.0%（36/72），BCV 陽(yáng)性率為75.0%（54/72），共感染率為33.3%（24/72）；常 規(guī)PCR 檢 測(cè) 的BRV 陽(yáng) 性 率 為47.2%（34/72），BCV 陽(yáng)性率為70.8%（51/72），共感染率為29.1%（22/72）。二者檢測(cè)BRV、BCV 的陽(yáng)性符合率分別為97.2%，BCV 96.8%（表3）。表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法優(yōu)于常規(guī)PCR 檢測(cè)方法，可以應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

表2 TaqMan 熒光定量PCR 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The repeatability test of the TaqMan real-time PCR

表3 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection of clinical samples with the duplex TaqMan real-time PCR

3 討 論

BRV 和BCV 是犢牛腹瀉的主要病原，嚴(yán)重?fù)p害世界各國(guó)畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益。1968 年BRV 首次被Mebus 等分離鑒定，并證明了其對(duì)犢牛的致病性[5]；1972 年Mebus 等再次從牛腹瀉糞便樣品中分離出BCV[6]；1980 年和1985 年在我國(guó)分別確認(rèn)了BRV 和BCV 的存在[7-8]。這兩個(gè)病毒自報(bào)道以來(lái)，其引發(fā)的疫病在我國(guó)各省市均有發(fā)生和流行。有研究表明，在我國(guó)新疆地區(qū)，BRV 陽(yáng)性率為92.86%～100%，BCV 陽(yáng)性率為86.67%～100%，混合感染率為86.67%～100%[9-10]。因此，建立兩種病毒的快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法非常重要。

當(dāng)前用于BRV 和BCV 的檢測(cè)方法主要有PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（LAMP）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、SYBR Green 熒光定量PCR 法等[11-15]，但常規(guī)PCR 耗時(shí)長(zhǎng)，特異性相對(duì)較低；而LAMP 因其對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，假陽(yáng)性率較高；ELISA 相較于Taq?Man 熒光定量PCR 則具有靈敏度較低、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)；另外，有研究報(bào)道，相較于SYBR Green 熒光定量PCR，TaqMan 熒光定量PCR 的檢測(cè)結(jié)果更佳[16]。TaqMan 熒光定量PCR 具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)易、靈敏性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)樣品檢測(cè)的同時(shí)還可以對(duì)其定量分析，因此廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外的臨床檢測(cè)。

目前同時(shí)檢測(cè)BRV 和BCV 方法較少，林初文、沈志強(qiáng)建立了可以同時(shí)檢測(cè)BRV 和BCV 的多重PCR方法[1]；曹禹建立了檢測(cè)BRV 和BCV 的單一SYBR Green I 熒光定量PCR 方法，但無(wú)法同時(shí)檢測(cè)BRV 和BCV[13]。目前，尚無(wú)同時(shí)檢測(cè)BRV 和BCV 的多重TaqMan 熒光定量PCR 方法，本研究建立的雙重Taq?Man 熒光定量PCR 方法較林初文、沈志強(qiáng)建立的多重PCR 相比具有更高的靈敏度和特異性；與曹禹建立的方法相比，該方法更敏感、準(zhǔn)確，且可以同時(shí)檢測(cè)BRV 和BCV。本研究建立的雙重TaqMan 熒光定量PCR 方法對(duì)BRV 和BCV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限分別為41.8 拷貝/μL 和3.55 拷貝/μL，組內(nèi)組間變異系數(shù)均小于2%，與BVDV、BEV、IBRV、BPV 均無(wú)交叉反應(yīng)，臨床樣品檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于常規(guī)PCR，表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法特異性強(qiáng)，敏感性高，具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，可以用于BRV 和BCV 的臨床檢測(cè)，為犢牛腹瀉病診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的檢測(cè)方法，對(duì)我國(guó)犢牛腹瀉病早期診斷和防控具有重要意義。