一氧化氮前體類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制研究進(jìn)展

林善鴻，曾文鋒，趙玉婉，吳昊開，柳建軍

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江524001

一氧化氮(NO)是一種具有高度擴(kuò)散性和反應(yīng)性的分子，能夠作為信使參與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間多種重要的生理活動(dòng)。研究[1-2]表明，低濃度的NO可通過增強(qiáng)血管新生能力的方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而高濃度的NO則對腫瘤細(xì)胞具有明顯的腫瘤抑制作用。但NO屬于氣體分子，其半衰期較短，且具有水溶性低、極易擴(kuò)散等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用困難。因此，可釋放NO的NO前體藥物受到廣泛關(guān)注，有關(guān)NO前體類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制研究也較多，現(xiàn)綜述如下。

1 NO的生理特點(diǎn)及其對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用

NO是在生物體內(nèi)一種具有信號傳導(dǎo)作用的氣體信號分子，是由L-精氨酸在NO合成酶(NOS)及其他輔助因子如煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素單核苷酸(FMN)以及(6R-)5,6,7,8-四氫生物蝶呤(BH4)的參與下催化產(chǎn)生的[3]。NOS可分為神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)3種亞型，其中nNOS和eNOS主要受細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平依賴性調(diào)控，而iNOS受鈣離子非依賴性調(diào)控，并可在炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用下迅速在局部產(chǎn)生高水平的NO[4]。有研究[5]表明，雖然不同亞型的NOS在不同的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)有所差異，但是NOS表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，尤其是iNOS的過表達(dá)。NO是腫瘤生長過程中許多轉(zhuǎn)錄因子和信號級聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，低水平濃度的NO可促進(jìn)腫瘤血管的新生、抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，而高水平濃度的NO則主要通過促凋亡的機(jī)制發(fā)揮出抗腫瘤的活性[6]。目前利用NO治療腫瘤研究主要存在兩個(gè)方面的困難。一方面，在物理性質(zhì)上，NO屬于氣體分子，其半衰期較低，且具有水溶性低、極易擴(kuò)散等特點(diǎn)[7]，臨床試驗(yàn)困難諸多。另一方面，不同濃度的NO對不同腫瘤的作用效果不盡相同，精確研究出不同腫瘤各自合適的NO濃度十分困難。

2 NO前體藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制

目前引起廣泛關(guān)注的NO前體藥物包括有機(jī)硝酸酯類、金屬-亞硝基復(fù)合物類、呋咱氮類、S-亞硝基硫醇類、重氮烯二酸鹽類和釋放NO的聚合體納米顆粒(NPs)等，它們通過引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧和活性氮積累，導(dǎo)致線粒體損傷進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，也可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯、損傷DNA、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療和化療的敏感性、改善腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性等途徑，提高腫瘤治療效果。

2.1 有機(jī)硝酸酯類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制 有機(jī)硝酸酯類藥物在臨床上主要用于緩解快速可逆性的急性心絞痛，也可用于治療心力衰竭。研究[8]發(fā)現(xiàn)，有機(jī)硝酸酯類藥物在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、細(xì)胞色素P450還原酶、黃嘌呤氧化還原酶和醛脫氫酶共同催化作用下可轉(zhuǎn)化為NO，從而發(fā)揮其生理作用，其最主要的代表藥物是硝酸甘油(GTN)。GTN為代表的有機(jī)硝酸酯類NO前體藥通過不同的機(jī)制在一定程度上具有抗腫瘤的重要作用。GTN可通過釋放NO，改善腫瘤組織缺氧微環(huán)境的血流情況并減少缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，同時(shí)增加腫瘤血管中化療藥物的傳遞，這種機(jī)制可能提高化療藥物在腫瘤組織的滲透性，進(jìn)而提高腫瘤組織對化療藥物的敏感性[9]。KO等[10]發(fā)現(xiàn)，GTN可通過減弱AKT通路蛋白的活性以及抑制胸苷酸合成酶的合成，抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1703的增殖。BOUAOUICHE等[11]研究發(fā)現(xiàn)，GTN能增強(qiáng)轉(zhuǎn)移性去勢抵抗型前列腺癌(mCRPC)對化療藥物多西他賽的耐藥性，認(rèn)為這可能與可溶性簇蛋白(sCLU)的表達(dá)水平升高相關(guān)，抑制mCPRC細(xì)胞系DU145-DR和PC3-D12中sCLU的表達(dá)是其主要作用機(jī)制。他們還發(fā)現(xiàn)，使用siRNA干擾sCLU在mCRPC中的表達(dá)后，GTN對多西他賽在mCRPC的增敏作用消除，認(rèn)為GTN可能是通過調(diào)節(jié)sCLU的表達(dá)增強(qiáng)了多西他賽對mCRPC的化療敏感性。

2.2 金屬-亞硝基復(fù)合物類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制 其主要的代表性藥物是硝普鈉(SNP)和釕亞硝基化合物。SNP是一種有效的降壓藥物，主要應(yīng)用于各種高血壓急癥的治療[12]。QUAN等[13]發(fā)現(xiàn)，SNP可能是通過產(chǎn)生NO與O2生成ONOO-對肝癌細(xì)胞系HepG2起到細(xì)胞毒性作用，認(rèn)為ONOO-在HepG2細(xì)胞中的積累可引起線粒體損傷，進(jìn)一步啟動(dòng)Caspase途徑依賴性的細(xì)胞凋亡。QUAN等[13]進(jìn)一步研究又發(fā)現(xiàn)，SNP和ONOO-清除劑FeTPPS聯(lián)合作用于肝癌細(xì)胞HepG2后，F(xiàn)eTPPS顯著抑制了SNP對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，認(rèn)為SNP發(fā)揮抗腫瘤的作用是由NO參與下生成的ONOO-所介導(dǎo)的。YANG等[14]發(fā)現(xiàn)，SNP在胃癌細(xì)胞AGS、MKN45、MKN28和SGC-7901中通過細(xì)胞內(nèi)刺激NO釋放的方式增強(qiáng)了腫瘤壞死相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，進(jìn)而促進(jìn)了線粒體介導(dǎo)的凋亡信號傳遞途徑，包括Caspase 8和Caspase 9的活化。釕亞硝基化合物是一種可通過光誘導(dǎo)電子傳遞或者氧化還原反應(yīng)從金屬-亞硝基化合物中釋放NO的化合物，其化學(xué)式為[trans-[RuII(NO+)(NH3)4(py-X)]3+][15]。FERNANDO等[16]通過使用多通道傅里葉變換紅外顯微鏡(μFT-IR)觀察到釕亞硝基化合物在肺癌細(xì)胞A549中釋放NO的動(dòng)態(tài)變化過程，隨著腫瘤細(xì)胞內(nèi)的含量的增多，NO快速與胞內(nèi)的核酸、修飾蛋白等生物分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而破壞其分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3 呋咱氮類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制 呋咱氮類化合物是一類經(jīng)典的NO供體，其含氮雜環(huán)與半胱氨酸和谷胱甘肽等含硫醇的化合物可發(fā)生一系列氧化還原反應(yīng)釋放NO，從而衍生出許多以呋咱為中心體的化合物[17,18]。根據(jù)這一特性，JIAO等[19]以呋咱為核心研制出一系列化合物，并在腫瘤細(xì)胞系HepG2、MCF-7、HCT-116、B16和K562以及正常細(xì)胞系L-02和PBMCs間進(jìn)行對照研究，其中化合物15a展現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤作用，且正常細(xì)胞對它具有良好的耐受性；進(jìn)一步研究化合物15a的抗腫瘤機(jī)制發(fā)現(xiàn)，化合物15a的抗腫瘤作用在一定程度上與NO釋放量呈正相關(guān)，隨著NO釋放量的增加，腫瘤細(xì)胞中Bax、Bad、HtrA2和Trail R2/DR5等凋亡相關(guān)分子的表達(dá)水平相應(yīng)增高，認(rèn)為15a可通過內(nèi)源性和外源性途徑誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。WAN等[20]基于呋咱合成了15種與雌二醇衍生物構(gòu)成的新型雜合體，也在腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231、A2780、Hela和HUVEC細(xì)胞系中進(jìn)行了抗腫瘤活力的研究，結(jié)果表明大部分雜合體對腫瘤細(xì)胞的活性具有較強(qiáng)的抑制作用，認(rèn)為這些抗腫瘤作用很可能是與NO的釋放和ERK/MAPK通路受到抑制有關(guān)。

2.4 S-亞硝基硫醇類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制 亞硝基硫醇類化合物是一種由NO與硫醇結(jié)合生成的化合物，具有抗氧化和延長NO作用時(shí)間的作用，其以半胱甘肽-S-亞硝基硫醇的形式廣泛存在于人體內(nèi)環(huán)境中并參與許多重要的生理活動(dòng)[21-22]。S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)是S-亞硝基硫醇類化合物的代表藥物。KIM等[23]發(fā)現(xiàn)，在藥物濃度0.5 mmol/L的情況下，SNAP作用12 h后，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株CRT-MG的細(xì)胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并逐漸發(fā)生細(xì)胞凋亡，且這種改變具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性；進(jìn)一步研究SNAP誘導(dǎo)CRT-MG發(fā)生凋亡的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，NO會(huì)使CRT-MG的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生鈣超載現(xiàn)象，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定性，引發(fā)的Ca2+外流導(dǎo)致胞質(zhì)中的Ca2+濃度顯著增高，從而引起Ca2+依賴性的細(xì)胞凋亡。研究SNAP對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的肌醇酶a(IRE1-a)的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，SNAP可激活CRT-MG內(nèi)IRE1-a的活性，使其與腫瘤壞死因子相關(guān)受體(TRAF2)相結(jié)合，造成JUK1/2底物水平的磷酸化，這提示NO激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的IRE1-a/TRAF2/JUN信號通路在具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

2.5 重氮烯二酸鹽類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制 重氮烯二酸鹽是由氮原子和親核胺(包括主胺、仲胺和多胺)結(jié)合形成的，在生理?xiàng)l件下每分子的重氮烯二酸鹽可自發(fā)釋放兩個(gè)NO分子，具有半衰期較長和良好的穩(wěn)定性特點(diǎn)[24-25]。有研究表明，重氮烯二酸鹽在腫瘤細(xì)胞中能夠以可控的分解速率自發(fā)地釋放出NO，具有良好的抗增殖活性和選擇性[26]。正是由于這些優(yōu)良的特性，設(shè)計(jì)以重氮烯二酸鹽為核心的抗腫瘤化合物得到了科研工作者的青睞。重氮烯二酸鹽類化合物的代表藥物是JS-K，其主要作用機(jī)制是在GSTs催化下，通過活化反應(yīng)與腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)相結(jié)合，從而在胞內(nèi)釋放出NO發(fā)揮抗腫瘤作用[27]。研究[28]表明，與在正常細(xì)胞中的含量相比，GSTs在惡性腫瘤細(xì)胞中廣泛過表達(dá)，JS-K正是利用腫瘤細(xì)胞這種表達(dá)差異發(fā)揮其抗腫瘤的特異性。LIU等[29]研究發(fā)現(xiàn)，JS-K在濃度1.25-5 μmol/L的范圍內(nèi)可使卵巢癌細(xì)胞株A2780和SKOV3發(fā)生caspase途徑依賴性的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究JS-K的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，JS-K使細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的濃度水平顯著增高，認(rèn)為JS-K可能通過ROS途徑參與細(xì)胞凋亡的過程。LIU等[29]還通過透射電鏡觀察到，經(jīng)2.5 μmol/L JS-K處理后的A2780和SKOV3有自噬小體的產(chǎn)生，認(rèn)為JS-K在細(xì)胞自噬途徑上發(fā)揮著重要作用。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，JS-K可抑制腫瘤的生長，提高腫瘤對順鉑的敏感性，說明JS-K在體內(nèi)和體外均發(fā)揮著抗腫瘤的活性。QIU等[30]研究JS-K對腎癌細(xì)胞株A498和ACHN以及原代心肌細(xì)胞H9C2的影響后發(fā)現(xiàn)，JS-K可提高腎癌細(xì)胞對多柔比星的敏感性，同時(shí)可以有效降低多柔比星對心肌細(xì)胞的損傷；在這項(xiàng)研究中，0-1 μmol/L的JS-K未對以上三種細(xì)胞系的增殖活性產(chǎn)生抑制作用，而在0-5 μmol/L范圍的JS-K作用下，NO在A498和ACHN的釋放量顯著高于H9C9，原代心肌細(xì)胞H9C9的NO含量仍維持在低水平。深入探討JS-K在腎癌細(xì)胞的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，JS-K可能是通過在腫瘤細(xì)胞中釋放高水平的NO引起P53的磷酸化，進(jìn)而激活下游促凋亡信號通路的應(yīng)答，同樣低濃度下JS-K在心肌細(xì)胞H9C2中維持低水平的NO釋放量，可刺激其氧化應(yīng)激反應(yīng)而保護(hù)H9C2的生長活性。此外，JS-K在前列腺癌[31]、胃癌[31]、膀胱癌[33]、肝癌[34]等多種惡性腫瘤細(xì)胞中均表現(xiàn)出很好的抑制腫瘤活性作用。雖然重氮烯二酸類NO前體藥物在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上展現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤作用，正常組織細(xì)胞對其耐受性也良好，但是目前缺乏廣泛的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對其抗腫瘤作用作為補(bǔ)充?？偟膩碚f，根據(jù)該類藥物具有穩(wěn)定性和對腫瘤特異性的特點(diǎn)，可以深入研究其在體內(nèi)的作用，探討其是否可能成為日后應(yīng)用于臨床的靶向治療藥物。

2.6 NPs在腫瘤治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制 NO在分子屬性上屬于低分子氣體，具有光和熱的不穩(wěn)定性，在內(nèi)環(huán)境中又容易被紅細(xì)胞中的血紅蛋白快速清除[35]，這使得NO前體藥物在生物體上的應(yīng)用面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。NPs是一種能夠在表面進(jìn)行化學(xué)修飾進(jìn)而調(diào)整NO釋放位置和延長NO釋放持續(xù)時(shí)間的新策略，可極大提高NO的穩(wěn)定性，同時(shí)根據(jù)化學(xué)修飾的改變以及溫度、光線、PH等環(huán)境條件的變化增強(qiáng)NO對腫瘤的靶向作用。此外，NPs結(jié)構(gòu)表面存在親水相容性聚合物聚乙二醇(PEG)，可避免循環(huán)系統(tǒng)中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的識別，減少與血紅蛋白的相互作用進(jìn)而延長藥物作用時(shí)間[36]。WU等[37]開發(fā)了一個(gè)新型納米粒子釋放NO的合成策略，將S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)偶聯(lián)到一段兩性共聚物的親脂性末端的聚乙二醇-硫化丙烯(PEG-PPS)，形成一種NO負(fù)載能力高、穩(wěn)定性良好且具有GSH持續(xù)活化釋放NO能力的納米顆粒聚合體PEG-PPS-GSNO。在體外實(shí)驗(yàn)研究中，PEG-PPS-GSNO可通過轉(zhuǎn)亞硝基反應(yīng)消耗GSH，形成PEG-PPS-GSH復(fù)合物，釋放GSNO，進(jìn)而通過GSNO在靶細(xì)胞內(nèi)釋放出大量的NO，引起ROS的增加，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。為進(jìn)一步研究PEG-PPS-GSNO在克服癌癥多藥耐藥方面的潛力，將阿霉素(DOX)包裹到PEG-PPS-GSNO納米顆粒中，與單純用藥DOX組相比，納米顆粒PEG-PPS-GSNO-DOX對阿霉素耐藥肝癌細(xì)胞株HepG2/ADR的藥物敏感性提高了3倍，同時(shí)對正常細(xì)胞的耐受性良好。NIU等[38]基于納米粒子的合成思路，設(shè)計(jì)了一種10-羥基喜樹堿(HCPT)負(fù)載的電荷反轉(zhuǎn)殼聚糖納米顆粒與苯磺酰氧化呋咱共價(jià)結(jié)合，命名為HCPT/CTS-NO-DMMA NPs，這種NPs釋放NO的能力依賴微環(huán)境中GSH的濃度水平，利用GSH常常在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的這種特性將其靶向作用于腫瘤細(xì)胞。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，HCPT/CTS-NO-DMMA NPs可直接靶向作用于腫瘤細(xì)胞，且藥物不良反應(yīng)明顯小于單純用藥組?？傮w來看，可釋放NO的NPs相比于傳統(tǒng)的NO前體藥物作用更強(qiáng)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中不良反應(yīng)更小。另外，由于NPs的體積極小，在腫瘤微環(huán)境中的滲透上，藥物也有很大的優(yōu)勢。

當(dāng)前研究[39]結(jié)果表明，NO在腫瘤細(xì)胞中的濃度水平和持續(xù)時(shí)間是發(fā)揮其抗腫瘤活性作用的關(guān)鍵所在。高濃度與低濃度的NO在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生的作用完全不同，可以說是一把“雙刃劍”。高濃度的NO在腫瘤內(nèi)可誘導(dǎo)活性氮和活性氧的顯著增加，引發(fā)一系列的氧化反應(yīng)和亞硝化反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)、功能受損以及核DNA損傷和細(xì)胞凋亡；低濃度的NO可促進(jìn)腫瘤血管生成從而增強(qiáng)其營養(yǎng)的供給，促進(jìn)腫瘤的生長[40]。且不同的腫瘤細(xì)胞株對NO的濃度水平效應(yīng)有所差異，不同的正常組織細(xì)胞對NO濃度水平的耐受程度也存在差異。但目前在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對精準(zhǔn)把握NO濃度方面的研究仍是空白。另外，鑒于在保持NO分子穩(wěn)定性和適應(yīng)人體內(nèi)環(huán)境方面的優(yōu)勢，關(guān)于NO前體藥物與各種納米聚合物相結(jié)合方面的研究，有可能成為未來的研究趨勢。

總之，有機(jī)硝酸酯類、金屬-亞硝基復(fù)合物類、呋咱氮類、S-亞硝基硫醇類、重氮烯二酸鹽類和NPs等NO前體藥物在體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出比以往單純使用傳統(tǒng)化療藥物的抗腫瘤作用更具有優(yōu)勢，它們可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯、損傷DNA、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療和化療的敏感性、改善腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性等途徑提高腫瘤治療效果，但缺少更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)支撐。研究出一種安全性高、特異性強(qiáng)、能在臨床應(yīng)用中的NO前體藥物，有光明的應(yīng)用前景。