轉(zhuǎn)染葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶小干擾RNA的胃癌細胞株SGC7901、SGC7901/DDP凋亡觀察

張俊杰，葛艷麗，王聲樂，王喆，王志榮

同濟大學附屬同濟醫(yī)院，上海200065

胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。化療是進展期胃癌主要的治療手段，但腫瘤細胞往往存在多藥耐藥(MDR)，是腫瘤化療失敗的主要原因，對胃癌MDR的研究一直是一個熱點。腫瘤細胞MDR的機制非常復雜，由MDR-1基因編碼的P-糖蛋白(P-gp)通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路介導是MDR的主要機制之一[2-3]。研究[4-6]表明，葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(GCS)與多種腫瘤細胞的MDR密切相關(guān)，在腫瘤細胞MDR中的作用漸受重視。但有關(guān)胃癌細胞MDR的過程中GCS的作用及機制研究較少。2013年6月1日～2016年12月31日，本研究觀察了轉(zhuǎn)染GCS小干擾RNA的胃癌細胞株SGC7901、順鉑耐藥胃癌細胞株SGC7901/DDP凋亡情況，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞分組及SiRNA轉(zhuǎn)染 SGC7901及GES-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃條件下飽和濕度培養(yǎng)。SGC7901/DDP細胞培養(yǎng)條件與SGC7901細胞相同，另在培養(yǎng)基中加入500 ng/mL順鉑，逐漸遞增順鉑劑量至800 ng/mL作為維持耐藥劑量，并在實驗前脫藥培養(yǎng)兩周。各細胞長滿后使用0.25%胰蛋白酶消化液消化、傳代，取對數(shù)生長期各細胞分為6組，分別記為GES-1組、GES-1+SiRNA組、SGC7901組、SGC7901+SiRNA組、SGC7901/DDP組、SGC7901/DDP+SiRNA組。取各組細胞，胰酶消化后以1×105個細胞鋪至6孔板中，待細胞貼壁后，GES-1+SiRNA組、SGC7901+SiRNA組、SGC7901/DDP+SiRNA組細胞采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染GCS SiRNA，GES-1組、SGC7901組、SGC7901/DDP組細胞轉(zhuǎn)染陰性對照GCS SiRNA，各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集對數(shù)生長期各組細胞用于實驗。

1.2 各組細胞凋亡指數(shù)測算 取各組細胞，使用PBS重懸，并計數(shù)。取1×105個細胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入500 μL稀釋的1×Annexin V Binding buffer工作液重懸細胞。在細胞懸液中加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置20 min，使用流式細胞儀檢測凋亡細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/(凋亡細胞數(shù)十正常細胞數(shù))×100。

1.3 各組細胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA檢測 采用Real-time PCR法。取各組細胞，提取總RNA，紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，建立20 μL RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄體系，其中RNA模板為1 μL，Oligo dT引物和隨機引物各1 μL，PCR緩沖液為4 μL(包含鎂離子、dNTPs、甘油等)，逆轉(zhuǎn)錄酶為1 μL，其余用DEPC水補足。采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進行Real-time PCR反應，反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共計40個循環(huán)，72 ℃ 3 min，4 ℃退火。引物序列如下：MDR-1上游引物為5′-CAGCTGTTGTCTTTGGTGCC-3′，下游引物為5′-CTTCCGTGCTGTAGCTGTCA-3′；BCL2上游引物為5′-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3′，下游引物為5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3′；BAX上游引物為5′-AGGATGCGTCCACCAAGAAG-3′；下游引物為5′-AGCTGCCACTCGGAAAAAGA-3′；GAPDH上游引物為5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′，下游引物為5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′。以2-ΔΔCt表示細胞中目的mRNA的相對表達量。

1.4 各組細胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，PBS洗3次，加入蛋白裂解液，置冰上裂解30 min，收集離心后取上清液，用BCA方法測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。配置SDS-PAGE凝膠，根據(jù)蛋白濃度，計算40 μg蛋白的上樣體積。使用電泳儀接通電源，經(jīng)過濃縮膠和分離膠，直至樣品和溴酚藍到達分離膠底部后停止電泳。使用PVDF膜200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，加入5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，加入稀釋好的一抗，4 ℃搖床孵育過夜，洗滌一抗后，在避光孵育盒中繼續(xù)孵育二抗，孵育完畢后應用0dyssey激光成像系統(tǒng)掃描圖像并檢測條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值表示細胞中目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞凋亡指數(shù)比較 GES-1組、GES-1+SiRNA組細胞凋亡指數(shù)分別為3.60±0.82、4.02±0.58，兩組相比，P>0.05；SGC7901組、SGC7901+SiRNA組細胞凋亡指數(shù)分別為0.36±0.05、14.98±1.01，兩組相比，P<0.05；SGC7901/DDP組、SGC7901/DDP+SiRNA組細胞凋亡指數(shù)分別為0.18±0.02、12.75±0.68，兩組相比，P<0.05。SGC7901/DDP+SiRNA組、SGC7901+SiRNA組細胞凋亡指數(shù)分別為12.75±0.68、14.98±1.01，兩組相比，P<0.05。

2.2 各組細胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA相對表達量比較 GES-1組細胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA的相對表達量分別為0.98±0.06、1.06±0.08、1.15±0.06，GES-1+SiRNA組分別為0.92±0.05、1.02±0.05、1.06±0.05，兩組相比，P均>0.05。

SGC7901組細胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA的相對表達量分別為1.36±0.06、1.52±0.08、0.82±0.05，SGC7901+SiRNA組分別為0.68±0.04、0.78±0.06、1.46±0.05，兩組相比，P均<0.05。

SGC7901/DDP組細胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA的相對表達量分別為1.52±0.08、1.76±0.09、0.75±0.05，SGC7901/DDP+SiRNA組分別為0.82±0.05、1.08±0.07、1.23±0.06，兩組相比，P均<0.05。

SGC7901/DDP組細胞中MDR-1 mRNA的相對表達量為1.52±0.08，SGC7901組細胞中MDR-1 mRNA的相對表達量為1.36±0.06，兩組相比，P<0.05。SGC7901/DDP+SiRNA組細胞中MDR-1 mRNA的相對表達量為0.82±0.05，SGC7901+SiRNA組細胞中MDR-1 mRNA的相對表達量為0.68±0.04，兩組相比，P<0.05。

2.3 各組細胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白相對表達量比較 GES-1組細胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白的相對表達量分別為0.78±0.05、0.58±0.03、0.46±0.04、0.36±0.03，GES-1+SiRNA組分別為0.75±0.04、0.52±0.03、0.48±0.03、0.38±0.04，兩組相比，P均>0.05。

SGC7901組細胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白的相對表達量分別為0.85±0.06、0.80±0.05、0.24±0.03、0.21±0.03，SGC7901+SiRNA組分別為0.45±0.05、0.62±0.05、0.48±0.04、0.40±0.04，兩組相比，P均<0.05。

SGC7901/DDP組細胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白的相對表達量分別為0.98±0.07、0.83±0.05、0.16±0.02、0.13±0.02，SGC7901/DDP+SiRNA組分別為0.68±0.05、0.70±0.06、0.30±0.04、0.28±0.04，兩組相比，P均<0.05。

SGC7901/DDP組細胞中P-gp蛋白的相對表達量為0.98±0.07，SGC7901組細胞中P-gp蛋白的相對表達量為0.85±0.06，兩組相比，P<0.05。SGC7901/DDP+SiRNA組細胞中P-gp蛋白的相對表達量為0.68±0.05，SGC7901+SiRNA組細胞中P-gp蛋白的相對表達量為0.45±0.05，兩組相比，P<0.05。

3 討論

神經(jīng)酰胺是一種脂質(zhì)分子，是鞘脂類的中間代謝產(chǎn)物，由細胞膜神經(jīng)鞘磷脂水解產(chǎn)生，目前被認為是一種細胞內(nèi)的第二信使，參與了細胞的分化、生長抑制、衰老及凋亡等多種生物學過程[7]。由GCS催化UDP-glucose上的糖基以β型糖苷鍵與神經(jīng)酰胺相結(jié)合可以生成葡萄糖神經(jīng)酰胺(glucosylceramide，GlcCer)[8]。GlcCer作為前體物質(zhì)可以被細胞用來進一步合成其他鞘糖脂(glycosphingolipids,GSLs)。GlcCer不僅維持著細胞的正常結(jié)構(gòu)功能，其亦與腫瘤細胞的各種生物學行為密切相關(guān)，參與了細胞的增殖分化及腫瘤細胞的MDR。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺可以調(diào)控多種腫瘤細胞的MDR，在多藥耐藥的腫瘤細胞中GlcCer大量聚集，有學者認為這可以作為腫瘤細胞MDR表型的標志，腫瘤細胞可以通過調(diào)節(jié)自身細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺糖基化水平導致MDR，這可能是腫瘤細胞產(chǎn)生MDR的一個新機制[9]。因此，我們可以通過抑制神經(jīng)酰胺的糖基化，增加細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的含量來達到逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞MDR的目的。

有研究[10]發(fā)現(xiàn)，許多化療藥物可以通過損傷DNA或作用于凋亡相關(guān)基因來誘導細胞產(chǎn)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，而一旦腫瘤細胞對某些化療藥物產(chǎn)生耐受性，就意味著腫瘤能夠抵抗這些藥物誘導的凋亡，因而腫瘤對這些藥物產(chǎn)生了MDR，從而證明凋亡與MDR密切相關(guān)。近年來，越來越多的研究[11]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺誘導細胞凋亡在腫瘤細胞MDR中發(fā)揮了巨大作用。殷麗等[12]使用GCS抑制劑PDMP干預K562細胞及其表柔比星耐藥株K562/A02后發(fā)現(xiàn)，抑制GCS活性后，耐藥株細胞凋亡率增加，對表柔比星的敏感性亦增加。LUCCI等[13]以阿霉素處理MCF-7及其耐藥株MCF-7/AdrR兩種細胞，發(fā)現(xiàn)阿霉素可以抑制MCF-7細胞的增殖，而MCF-7/AdrR細胞存活率沒有變化，進一步研究發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株可以將神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為GlcCer，抵抗了神經(jīng)酰胺誘導的凋亡。由此可見，神經(jīng)酰胺可以作為第二信使介導腫瘤細胞的凋亡，MDR的腫瘤細胞可以調(diào)節(jié)自身神經(jīng)酰胺及糖基化神經(jīng)酰胺的比例，降低了神經(jīng)酰胺的促凋亡作用，導致了腫瘤細胞MDR。

我們的研究結(jié)果顯示，通過RNA干擾的方法將GCS表達抑制以后，正常胃黏膜細胞GES-1凋亡情況沒有明顯變化，經(jīng)典的多藥耐藥途徑MDR-1基因及其表達的蛋白P-gp亦未見明顯變化。而抑制GCS表達以后，胃癌細胞SGC7901及順鉑耐藥株SGC7901/DDP的凋亡指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學意義，提示GCS發(fā)揮對胃癌細胞的影響可能發(fā)生在細胞癌變以后，且SGC7901/DDP+SiRNA組凋亡指數(shù)低于SGC7901+SiRNA組，提示GCS的表達可能與胃癌細胞的MDR有關(guān)。我們進一步研究了凋亡有關(guān)的基因及蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)抑制GCS表達以后，BCL2基因水平降低，BAX及Caspase3蛋白表達增加，提示GCS可能通過抑制BCL2，促進BAX、Caspase3表達而發(fā)揮抑制胃癌細胞凋亡的作用。抑制GCS表達以后，經(jīng)典的多藥耐藥途徑MDR-1基因及其表達的蛋白P-gp表達亦隨之降低，但耐藥細胞株的表達高于普通胃癌細胞株，提示GCS可能通過經(jīng)典的MDR途徑影響了細胞的MDR。

綜上所述，抑制GCS的表達，可以促進胃癌細胞及其耐藥株凋亡，其作用機制可能與調(diào)節(jié)凋亡通路中的關(guān)鍵分子比如BCL2、BAX及Caspase3等有關(guān)。GCS的表達亦與胃癌細胞的MDR有關(guān)，其可能通過經(jīng)典的MDR-1通路影響胃癌的MDR。GCS可能是改變胃癌MDR、提高胃癌化療效果的潛在靶點。