血清抗體陰性重癥肌無力相關(guān)自身抗體的研究進(jìn)展

張國艷， 路 美，鐘士江 綜述 單煜恒 審校

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種由體液免疫介導(dǎo)、細(xì)胞免疫及補體參與的，主要累及神經(jīng)肌肉接頭的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，目前全球約有70萬MG患者[1]。以往，對于MG的分型主要基于受累肌群的不同及嚴(yán)重程度的差異，如經(jīng)典的Osserman分型及美國重癥肌無力基金會(Myasthenia Gravis Foundation of America，MGFA)分型[2]。但隨著多種MG自身抗體的發(fā)現(xiàn)，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的多維度病因?qū)W分型逐漸成為MG診斷與治療的熱點問題。

乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)是最早發(fā)現(xiàn)的，也是MG最常累及的分子靶點。它是一種分布于神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜的由α、β、γ及ε4亞單位構(gòu)成的跨膜糖蛋白[3]。目前，臨床中廣泛應(yīng)用的檢測AChR抗體的方法包括放射性免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)。這兩種方法都是以人橫紋肌肉瘤TE671細(xì)胞分泌的游離AchR為靶點來檢測患者血清中的AChR抗體，其檢測的敏感度、特異度類似。其診斷全身型MG敏感度為79.5%，特異度為96.1%[4]。 而在眼肌型MG中上述檢測方法的敏感度不到60%。這一類應(yīng)用RIPA 及ELISA 檢測AChR抗體為陰性的MG稱為血清抗體陰性MG(seronegative MG，SNMG)[5]。SNMG是臨床工作中難以明確診斷、易與其他疾病混淆的一類MG。值得注意的是，SNMG同AChR抗體陽性的MG相同，都是抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的自身免疫性疾病，這一點早在1994年就已得到證實?，F(xiàn)根據(jù)SNMG抗體不同將SNMG的不同亞型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 肌肉特異性酪氨酸激酶抗體陽性的MG

肌肉特異性酪氨酸激酶(MuSK)是一種表達(dá)于骨骼肌細(xì)胞膜的單次跨膜糖蛋白。在與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4)結(jié)合后，MuSK胞內(nèi)段的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活。激活的MuSK通過與下游的突觸AChR相關(guān)蛋白(AChR-associated protein of the synapse，Rapsyn)相互作用，從而引起AChR在NMJ突觸后膜簇集表達(dá)。MuSK自身免疫性抗體以IgG4抗體為主，這種自身抗體通過結(jié)合MuSK的胞外段，干擾LRP4-MuSK信號傳導(dǎo)通路，從而影響AChR 的簇集表達(dá)[6]。進(jìn)一步研究表明，MuSK抗體相關(guān)的MG患者血清中同時存在IgG1型抗體，并能夠激活補體引起NMJ突觸后膜的破壞，SNMG患者血清中MuSK抗體陽性率可達(dá)30%～70%[7]。2003年有學(xué)者對78例全身型SNMG患者血清進(jìn)行MuSK抗體檢測，其中MuSK抗體陽性為37例，MuSK抗體陽性的MG患者較抗體陰性者延髓肌易受累且更易發(fā)生MG危象[8]。文獻(xiàn)[9]對比分析了MuSK抗體陽性MG與AChR抗體陽性的MG的臨床特點，發(fā)現(xiàn)MuSK抗體陽性的MG患者的肌肉受累更為常見且更易出現(xiàn)MG危象。MuSK抗體陽性MG臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性是由抗體的異質(zhì)性決定的，提示咽喉肌、胸鎖乳突肌及呼吸肌等中組肌肉的NMJ突觸后膜AChR的簇集表達(dá)更依賴于MuSK信號通路的傳導(dǎo)[10]。

除了累及肌群不同，MuSK抗體陽性MG在治療藥物及療效方面也與傳統(tǒng)MG不同。研究表明，MuSK抗體陽性的MG患者采用膽堿酯酶抑制藥及胸腺切除治療的效果比MuSK抗體陰性者差[11]。原因可能與MuSK抗體不僅干擾了AChR在NMJ突觸后膜的簇集，還影響了乙酰膽堿酯酶相關(guān)膠原蛋白膠原鏈(collagen Q，ColQ)同MuSK胞外段的結(jié)合有關(guān)。上述研究提示，MuSK抗體陽性的MG是一種免疫學(xué)及臨床表現(xiàn)異質(zhì)的獨特類型。因此，針對SNMG患者進(jìn)行MuSK抗體檢測對于疾病癥狀預(yù)測及嚴(yán)重程度具有較大意義。在完善AChR抗體的檢測及MuSK抗體檢測后，仍有一部分患者上述兩種抗體均為陰性，這類MG稱為血清雙陰性MG(double-negative MG，DNMG)[12]。

2 LRP4抗體陽性的MG

LRP4是一種以胞外段為主的含有多種低密度脂蛋白重復(fù)序列的單次跨膜蛋白。作為LRP4-MuSK信號傳導(dǎo)通路的上游結(jié)構(gòu)，LRP4與聚集蛋白結(jié)合后能夠激活下游的MuSK，從而促使AChR在NMJ突觸后膜上蔟集表達(dá)。LRP4抗體以IgG1型抗體為主，其致病作用主要通過補體激活途徑破壞NMJ突觸后膜LRP4并干擾AChR 的簇集表達(dá)。LRP4抗體陽性的MG并不常見，在DNMG患者血清中，LRP4抗體陽性率為10%～13%。但LRP4抗體診斷MG的特異性接近100%，只有10%的肌萎縮側(cè)索硬化的患者血清中LRP4抗體也可為陽性，其機制尚不明確[13]。LRP4抗體陽性的MG患者臨床癥狀較輕，受累肌群以眼肌為主，治療效果及預(yù)后較好。提示除LRP4外，MuSK可能同時存在其他的上游激活途徑。

目前，針對LRP4抗體的檢測方法以ELISA為主，雖然其檢測不如AChR抗體及MuSK抗體檢測普及，但也逐漸成為MG患者血清抗體常規(guī)檢查的項目之一。部分MG患者AChR、MuSK及LRP4抗體均為陰性，稱為血清三陰性MG[14]。

3 簇集性AChR抗體陽性的MG

文獻(xiàn)[15]研究了74例確診MG患者的血清，其中20例患者AChR抗體陰性的SNMG，這類患者的臨床表現(xiàn)、Osserman不同分型的構(gòu)成比同AChR抗體陽性的MG患者無顯著性差異。鑒于臨床表現(xiàn)的一致性，SNMG分子靶點的分布及功能很可能同AChR類似或相同，只不過通過現(xiàn)有檢測方法無法檢測到?；谶@樣的假設(shè)，Leite等[7]將重組的AChR亞單位及Rapsyn共轉(zhuǎn)染至人胚胎腎(human embryonic kidney，HEK)細(xì)胞，從而模擬了AChR在NMJ突觸后膜的簇集表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNMG患者的血清中存在與細(xì)胞表面簇集表達(dá)的AchR特異結(jié)合的抗體，即簇集性AChR抗體。同AChR抗體相同，簇集性AChR抗體主要為IgG1型抗體，可以激活補體級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致突觸后膜AChR的破壞，引起與AChR陽性MG相同的病理改變及臨床表現(xiàn)。Leite等[7]還對65例全身型MG患者血清進(jìn)行檢測，其中AChR陽性MG17例，MuSK抗體陽性MG24例，血清雙陰性MG24例。在這24例血清雙陰性MG中簇集性AChR抗體陽性為14例。2015年，Zhao等[16]利用同樣的基于細(xì)胞學(xué)的檢測方法(cell-based assay，CBA)，對我國24例SNMG患者血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中11例(45.8%)為簇集性AChR抗體陽性MG。并且這些患者的臨床表現(xiàn)與AChR抗體陽性MG無顯著差異。因此，可以認(rèn)為簇集性AChR抗體陽性MG與AChR抗體陽性MG是針對同一靶點的一類疾病，只是因為對RIPA 及ELISA 敏感度不如CBA，難以檢測到低親和力的AChR抗體。

4 橫紋肌抗體相關(guān)的MG

橫紋肌抗體，又稱為非NJM抗體，是指MG患者血清中針對橫紋肌組分的特異性抗體，包括肌動蛋白、肌球蛋白、肌聯(lián)蛋白(titin)、Kv1.4及蘭尼堿(ryanodine receptor，RyR)抗體等。其中，研究較多的是titin、Kv1.4及RyR抗體。

4.1 肌聯(lián)蛋白(titin) 是一種定位于橫紋肌纖維內(nèi)的大分子蛋白，對于維持細(xì)胞的彈性及肌肉的收縮運動起到重要作用。Stergiou等[14]針對titin在MG中表達(dá)情況進(jìn)行了多中心研究，發(fā)現(xiàn)titin抗體陽性的MG占AChR抗體陽性MG的40.9%，占MuSK抗體陽性MG的14.6%，占LRP4抗體陽性MG的16.4%，占血清三陰性MG的13.4%。其中titin抗體陽性的血清三陰性MG患者臨床癥狀輕微，90%患者的MGFA分級為Ⅰ級、Ⅱ級， 10%為Ⅲ級。而且這些患者對于臨床治療敏感，膽堿酯酶抑制藥及免疫抑制治療均能起到較好的療效。但是，在AChR抗體陽性的MG患者中，titin抗體陽性提示較嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)及較高的胸腺瘤風(fēng)險。Hong等[17]檢測了437例我國MG患者的血清抗體，其中titin抗體陽性且RyR抗體陰性患者占16.5%，RyR抗體陽性且titin抗體陰性患者占11.9%，titin抗體及RyR抗體雙陽性患者11.9%，且這部分橫紋肌抗體陽性的MG患者血清中AChR抗體陽性率接近100%。

4.2 Kv1.4及RyR 均是在肌肉收縮過程中起到重要作用離子通道蛋白，其中RyR是肌漿網(wǎng)內(nèi)的Ca2+通道，而Kv1.4是電壓門控K+通道的組成部分。Kufukihara等[18]利用基于細(xì)胞學(xué)的檢測方法檢測了30例MG合并肌炎及心肌炎患者的血清橫紋肌抗體，發(fā)現(xiàn)在合并肌炎及心肌炎的MG患者血清中titin抗體陽性比例為93%，RyR抗體陽性比例為73%，Kv1.4抗體陽性比例為50%。提示橫紋肌抗體，尤其是titin抗體MG合并肌炎及心肌炎患者的診斷中具有較大價值。

與其他的胞內(nèi)抗體類似，橫紋肌抗體是潛在的腫瘤標(biāo)志物。尤其是在合并有AChR抗體陽性的晚發(fā)型MG中，橫紋肌抗體陽性預(yù)示著胸腺瘤的高風(fēng)險。相關(guān)臨床研究表明，胸腺瘤相關(guān)MG的橫紋肌抗體陽性率為50%～70%。其中，titin抗體陽性診斷胸腺瘤相關(guān)MG的特異度為80.8%，而RyR抗體的特異度為85.7%[19]。

5 其他抗體陽性的MG

除了上述的AChR抗體、MuSK抗體、LRP4及橫紋肌抗體外，多種MG的致病抗體已被識別。如ColQ抗體、皮層蛋白(cortactin)抗體、Agrin抗體等。ColQ是乙酰膽堿酯酶復(fù)合體的一部分，通過其C末端同MuSK的胞外段結(jié)合，從而將乙酰膽堿酯酶錨定于NMJ突觸后膜[20]。ColQ抗體一方面影響了NMJ突觸后膜乙酰膽堿酯酶的功能，另一方面干擾了LRP4-MuSK信號傳導(dǎo)通路及AChR的簇集表達(dá)。Zoltowska等[21]檢測了415例MG患者的血清中ColQ抗體的表達(dá)情況，僅發(fā)現(xiàn)12例陽性表達(dá)。且這12例中，5例合并AChR抗體陽性，2例合并MuSK抗體陽性。由于ColQ起到錨定乙酰膽堿酯酶的作用，被抗體破壞后將影響乙酰膽堿酯酶的功能，因此這部分ColQ抗體陽性的MG患者很可能對乙酰膽堿酯酶抑制藥不敏感。但由于ColQ抗體臨床檢測尚未普及，因此相關(guān)隊列較少，ColQ抗體陽性的MG的臨床表現(xiàn)及對常規(guī)治療的效果尚需進(jìn)一步研究。

Cortactin是LRP4-MuSK信號傳導(dǎo)通路的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在AChR 的簇集表達(dá)中起到中介作用。DNMG患者血清中Cortactin抗體的陽性率為20%。而在AChR抗體陽性的MG患者血清中Cortactin抗體的陽性率不到10%[22]。因此，目前認(rèn)為Cortactin是MG致病的重要獨立靶點之一。Gallardo等[23]檢測了38例DNMG患者的血清，其中9例Cortactin抗體為陽性，且這部分Cortactin抗體陽性的MG患者與AChR抗體陽性的MG患者相比，臨床表現(xiàn)更為輕微，多以眼肌型及輕度全身型為主，較少累計咽喉肌和呼吸肌，預(yù)后較好。值得注意的是，這9例Cortactin抗體陽性的MG患者均未發(fā)現(xiàn)胸腺瘤。但是否Cortactin抗體陽性的MG與胸腺瘤無關(guān)尚需進(jìn)一步的研究與探討。

Agrin是一種由突觸前膜分泌的硫酸類肝素多糖蛋白。其生理作用在于易化LRP4-MuSK信號通路的傳導(dǎo)，從而使AChR在NMJ突觸后膜簇集表達(dá)。MG患者血清中可檢測到Agrin抗體的存在，可能通過干擾LRP4-MuSK信號通路而致病。Cordts檢測了100例MG患者的血清中抗體的表達(dá)情況，在55例AChR抗體陽性及45例AChR抗體陰性的血清中，Agrin陽性率分別為5%和2%。這部分Agrin陽性的MG患者多為早發(fā)型MG，臨床癥狀與AChR抗體陽性的MG并無明顯差異[24]。

SNMG的概念是伴隨著MG相關(guān)抗體的發(fā)現(xiàn)及檢測手段的完善而不斷變化的。20世紀(jì)70年代，當(dāng)人們認(rèn)識到AChR抗體在MG發(fā)病過程中的主導(dǎo)地位時，Burges指出SNMG是一類AChR抗體陰性的MG[5]。但隨著研究的深入，MuSK及LRP4抗體被逐漸認(rèn)識并用于臨床檢測， SNMG的新概念逐步擴展為血清雙陰性MG及血清三陰性MG。有學(xué)者將MG分為七類，包括AChR抗體陽性的早發(fā)型MG、AchR抗體陽性的晚發(fā)型MG、眼肌型MG、胸腺瘤相關(guān)的MG、MuSK抗體相關(guān)的MG，LRP4抗體相關(guān)的MG及SNMG[25]。目前，這樣的基于臨床表現(xiàn)及抗體異質(zhì)性的分類已得到廣泛認(rèn)同。這樣的分類能夠幫助臨床醫(yī)師更好地識別病因機制、預(yù)測病情發(fā)展并選擇恰當(dāng)?shù)闹委熓侄巍?/p>

總之，即使多種MG相關(guān)抗體被發(fā)現(xiàn)，但仍有部分MG患者血清中未檢測到已知抗體，這些患者臨床癥狀相對輕，以眼肌型為主，胸腺檢查多為正常，治療效果理想。這類患者抗體靶點可能定位于NMJ突觸后膜的非AChR組分，通過影響NMJ突觸后膜AChR與乙酰膽堿的結(jié)合效率而致病。我們有理由相信隨著更多的MG致病抗體被發(fā)現(xiàn)，SNMG在MG中的比例將會越來越小。