外泌體microRNAs作為肺部疾病診斷性生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

姚培學(xué) 郭小旭 賀艷飛 歐陽(yáng)瑤

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科呼吸一病區(qū)（貴州遵義563000）

近年來(lái)，肺部疾病已嚴(yán)重危害人類的身體健康，尤其是慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）、肺癌、特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）、支氣管哮喘、肺結(jié)核等慢性肺部疾病，目前已成為全球人類死亡的主要原因之一，給社會(huì)和醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年慢阻肺的死亡人數(shù)達(dá)320 萬(wàn)，預(yù)計(jì)2040年每年將達(dá)到440 萬(wàn)［2］。研究［3］顯示，我國(guó)40 歲以上人群慢阻肺的平均患病率為13.6%，女性為8.1%，男性為19.0%。肺部疾病管理和治療的主要挑戰(zhàn)之一是缺乏可靠、精確及有效的診斷方法。臨床表現(xiàn)、肺功能檢測(cè)和影像學(xué)檢查是診斷和評(píng)估肺部疾病嚴(yán)重程度的主要指標(biāo)，然而，它們并不能診斷亞臨床疾病狀態(tài)。因此，迫切需要分子生物標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)肺部疾病的亞臨床和嚴(yán)重程度，有助于呼吸系統(tǒng)疾病患者的個(gè)體化治療。目前臨床上用于診斷的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)如C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原、可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體1 等缺乏特異性，因此不能對(duì)肺部疾病進(jìn)行早期診斷，因而探索新的特異性生物標(biāo)志物迫在眉睫。外泌體作為細(xì)胞外囊泡的主要類型，由于具有完整的雙層膜結(jié)構(gòu)，微環(huán)境對(duì)其干擾小，其內(nèi)包含大量的遺傳物質(zhì)，介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，使其在疾病診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性［4］。MiRNAs 是外泌體中主要的遺傳物質(zhì)，外泌體miRNAs 廣泛參與細(xì)胞凋亡增殖、免疫調(diào)節(jié)和新生血管形成［5-7］。外泌體miRNAs 可作為各系統(tǒng)疾病的診斷性生物標(biāo)志物，尤其是肺部疾病，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制及靶向治療藥物，在臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

1 外泌體miRNAs

外泌體是納米級(jí)大小的膜性封閉囊泡，可由多種細(xì)胞通過(guò)胞吐作用釋放到細(xì)胞外形成［8］。HESSVIK 等［9］首次在成熟的羊網(wǎng)狀紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了這種囊泡，并將其命名為外泌體。外泌體廣泛分布于唾液、血液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和痰液等各種體液中［10］。通過(guò)查閱外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.exocarta.org），不同物種來(lái)源的外泌體包含2 838 種miRNAs、3 408種mRNAs、41 860 種蛋白質(zhì)等多種生物活性分子。MiRNAs 是一類在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的短序、內(nèi)源性非編碼RNA，由21 ～25 個(gè)核苷酸組成，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、組織分化、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生理或病理進(jìn)程［11］，尤其在肺部疾病，如慢阻肺、支氣管哮喘、IPF、肺癌等。MiRNAs 在各種體液中以組織和細(xì)胞特異性的方式存在，由于具有特異性表達(dá)，與各系統(tǒng)疾病的診斷和預(yù)后密切相關(guān)［12］。特異性miRNAs 在肺部疾病中釋放入各種體液，可用于肺部疾病的監(jiān)測(cè)［7］。隨著外泌體研究領(lǐng)域的不斷深入，體液中外泌體miRNAs 擴(kuò)增度的靈敏性增加，同時(shí)miRNAs 擴(kuò)增出現(xiàn)陰性結(jié)果的可能性減少。成熟miRNAs 占外泌體總RNAs 的41.72%［13］，因此，外泌體可作為miRNAs 研究的可靠載體。外泌體主要通過(guò)旁分泌作用將攜帶的遺傳信息釋放到細(xì)胞外間隙，從而作用于供體細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。供體細(xì)胞有一種特殊的分選機(jī)制來(lái)引導(dǎo)特定的miRNAs 進(jìn)入外泌體，并對(duì)其中的目標(biāo)基因進(jìn)行“重編程”［14］。外泌體miRNAs 作為各種疾病的診斷性生物標(biāo)志物，其主要的原因包括：（1）與循環(huán)中miRNAs 相比，外泌體miRNAs 具有高度穩(wěn)定性及富集性［15］；（2）外泌體miRNAs 能準(zhǔn)確反映起始細(xì)胞的生理狀態(tài)和微環(huán)境，且大多數(shù)細(xì)胞能分泌大量特異性的miRNAs［16］；（3）外泌體可將miRNAs釋放到鄰近和遠(yuǎn)端細(xì)胞中并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［12］；（4）外泌體的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)保護(hù)miRNAs 不被血漿核糖核酸酶的降解，使它們能夠在細(xì)胞外空間穩(wěn)定表達(dá)，有利于標(biāo)本的采集和儲(chǔ)存［4］。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNAs 已成為細(xì)胞間通訊的重要參與者，并作為多系統(tǒng)疾病的生物標(biāo)志物，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?7］、心血管系統(tǒng)疾?。?8］、泌尿系統(tǒng)疾?。?9］，尤其是肺部疾?。?］。根據(jù)細(xì)胞組織來(lái)源不同，外泌體miRNAs 具有不同的生物學(xué)特性，因此，不同肺臟細(xì)胞源性外泌體miRNAs 表達(dá)水平與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2 外泌體miRNAs 與肺部疾病

外泌體miRNAs 作為肺結(jié)核、慢阻肺、IPF、支氣管哮喘和腺病毒性肺炎等肺部疾病新的診斷性生物標(biāo)志物具有潛在的研究前景。近年來(lái)，MiRNAs 包裹入外泌體、凋亡體和細(xì)胞微泡等細(xì)胞外囊泡的研究不斷引起研究者的興趣。研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNAs 通過(guò)影響受體細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，從而導(dǎo)致受體細(xì)胞功能的改變和病理狀態(tài)的發(fā)展［20］。因此，外泌體miRNAs 可作為肺部疾病潛在的診斷性生物標(biāo)志物。

2.1 外泌體miRNAs 與慢性阻塞性肺疾病慢阻肺是一種慢性炎癥性肺部疾病，研究發(fā)現(xiàn)各種體液（包括血清、血漿和BALF）中的外泌體miRNAs可作為慢阻肺早期診斷、判斷病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的特異性生物標(biāo)志物。SUNDAR 等［21］研究發(fā)現(xiàn)吸煙的慢阻肺患者血漿中miR-22-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-22-3p、miR-320b、miR-99a-5p、miR-320d 表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)外泌體中的miRNAs 通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）過(guò)程而參與慢阻肺的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。XU 等［22］研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）可以誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體成分發(fā)生改變，支氣管上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體miRNA-21通過(guò)靶向腫瘤抑制蛋白/缺氧誘導(dǎo)因子1α信號(hào)通路促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的分化，從而導(dǎo)致氣道重塑，進(jìn)一步證實(shí)吸煙者和慢阻肺患者血清中miRNA-21 的表達(dá)增加，且與第1 秒用力呼氣容積比用力肺活量（FEV1/FVC）呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明外泌體miRNA-21可作為診斷和評(píng)估慢阻肺肺功能?chē)?yán)重程度的生物標(biāo)志物。HE 等［23］研究發(fā)現(xiàn)CSE 刺激支氣管上皮細(xì)胞分泌miRNA-21，可通過(guò)抑制M2 巨噬細(xì)胞的極化，從而間接調(diào)節(jié)EMT 過(guò)程而參與慢阻肺的發(fā)病過(guò)程。SERBAN等［24］發(fā)現(xiàn)CSE 可導(dǎo)致小鼠血漿和原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液中外泌體miR-191、miR-126、miR-125a 和let-7d 的表達(dá)增加，這些外泌體miRNAs 可通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞功能而影響慢阻肺的進(jìn)展。綜上所述，慢阻肺患者及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體液中外泌體miRNAs 的表達(dá)水平均有升高，這說(shuō)明可作為慢阻肺的診斷性生物標(biāo)志物，但是外泌體miRNAs 參與慢阻肺氣道重塑的機(jī)制尚未明確，這些研究機(jī)制在慢阻肺的靶向治療中具有深遠(yuǎn)的研究意義。

2.2 外泌體miRNAs 與支氣管哮喘支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)、可逆性氣流受限為特點(diǎn)的異質(zhì)性疾病。外泌體miRNAs 作為細(xì)胞間信息傳遞的重要中介，在支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。PUA 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘模型BALF 中外泌體miR-223 和miR-142a 表達(dá)顯著增加，同時(shí)證實(shí)支氣管哮喘小鼠模型BALF 中部分外泌體miRNAs 可能影響肺部炎癥而促進(jìn)支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展，提示這些外泌體miRNAs 可作為支氣管哮喘的特異性診斷性生物標(biāo)志物。另有研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)塵螨誘導(dǎo)的支氣管哮喘小鼠模型BALF 中外泌體miRNAs 的表達(dá)量增高8.9 倍，其中54 種外泌體miRNAs 在氣道和肺組織中呈負(fù)相關(guān)，且部分外泌體miRNAs 靶向作用于IL-13 基因，引起表達(dá)水平上調(diào)，從而促進(jìn)支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展［26］。外泌體miRNAs 與炎性細(xì)胞相關(guān)哮喘及過(guò)敏原誘發(fā)的哮喘有關(guān)，主要通過(guò)氣道上皮細(xì)胞和支氣管平滑肌細(xì)胞的凋亡及增殖導(dǎo)致氣道重塑，但能否靶向作用于炎性細(xì)胞發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究及探索。

2.3 外泌體miRNAs 與特發(fā)性肺纖維化IPF 是一種病因未明的彌漫性肺纖維化疾病，且致殘率、病死率高，極具侵襲性。NJOCK 等［10］研究發(fā)現(xiàn)IPF 患者痰液中外泌體miR-33a-5p、miR-142-3p、miR-145-5p 和miR-374a-5p 的表達(dá)水平顯著升高，而miR-92b-3p、miR-24-3p 、miR-26a-5p 和miR-30a-5p 的表達(dá)水平顯著降低，表明特異性外泌體miRNAs 對(duì)IPF 的診斷具有重要參考價(jià)值。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p 與一氧化碳彌散量與肺泡通氣量之比呈負(fù)相關(guān)，而let-7d-5p 水平呈正相關(guān)。MAKIGUCHI 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，IPF 患者血清中的外泌體miR-21-5p 顯著上調(diào)。這使得外泌體miRNAs可作為IPF 非侵入性的診斷性生物標(biāo)志物，間接說(shuō)明外泌體miRNA 具體促進(jìn)纖維化的作用，但其具體機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究，以指導(dǎo)相關(guān)靶向抗纖維化藥物應(yīng)用于臨床。

2.4 外泌體miRNAs 與肺結(jié)核肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性消耗性疾病，由于漏診及誤診率較高，不能早期有效規(guī)律的抗結(jié)核治療，從而嚴(yán)重的危害人類的身體健康。然而，目前診斷肺結(jié)核的方法由于缺乏其敏感性和特異性。因此，迫切需要新的生物標(biāo)志物來(lái)幫助肺結(jié)核的早期診斷和治療。研究已證實(shí)外泌體miRNAs 可作為肺結(jié)核的診斷性生物標(biāo)志物。ALIPOOR 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者血清外泌體miR-484、miR-425和miR-96 表達(dá)水平顯著升高，然而根據(jù)痰涂片陽(yáng)性程度分析發(fā)現(xiàn)，隨著痰菌量增多，這3 種血清外泌體miRNAs 表達(dá)水平均有差異性，證實(shí)這3 種血清外泌體miRNAs 與結(jié)核分枝桿菌感染的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。LYU 等［29］通過(guò)對(duì)60 例健康對(duì)照組、60 例潛伏期結(jié)核分枝桿菌感染患者（LTBI）和60 例活動(dòng)性肺結(jié)核患者（ATB）血清外泌體miRNAs 的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，LTBI 血清外泌體miR-let-7e-5p、miR-let-7d-5p、miR-450a-5p 和miR-140-5p 表達(dá)水平明顯升高，而ATB 血清外泌體miR-1246、miR-2110、miR-370-3P 和miR-28-3p、miR-193b-5p 表達(dá)水平顯著升高。另有研究發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體miRNAs 與電子健康記錄（EHR）相結(jié)合對(duì)結(jié)核病的診斷具有顯著的臨床意義，與對(duì)照組相比，結(jié)核病患者血漿中外泌體miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191 和miR-486 具有差異性表達(dá)，血漿外泌體miRNAs 的表達(dá)水平和HER 結(jié)合具有潛在的臨床診斷價(jià)值，且對(duì)肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異度分別為100%、84%［30］。綜上所述，外泌體miRNAs可作為肺結(jié)核的早期診斷性生物標(biāo)志物及評(píng)估病情的嚴(yán)重程度，便于指導(dǎo)臨床早期治療，減少?gòu)?fù)發(fā)，改善患者的遠(yuǎn)期預(yù)后及提高生存質(zhì)量。

2.5 外泌體miRNAs 與肺癌肺癌是呼吸系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率均居高不下，且年發(fā)病率明顯升高。外泌體miRNAs 可作為肺癌細(xì)胞與其他細(xì)胞之間信息交換的重要媒介，在腫瘤的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。LIU 等［31］通過(guò)10 例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者和10 例健康對(duì)照組研究發(fā)現(xiàn)，兩組之間存在30 個(gè)差異性表達(dá)的miRNAs，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-23b-3p、miR-10b-5p 和miR-21-5p 與NSCLC 患者的總體生存率相關(guān)，可作為評(píng)估NSCLC 患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。ZHANG 等［32］發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者血清外泌體miR-17-5P 表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組；同時(shí)，外泌體miRNAs 也可作為鑒別不同類型NSCLC 的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步研究證實(shí)血漿中外泌體miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p 和miR-361-5p 是腺癌的特異性診斷性生物標(biāo)志物，而血漿中外泌體miR-10b-5p、miR-15b-5p 和miR-320b可作為鱗癌的特異性診斷性生物標(biāo)志物［33］。XUE等［34］研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，肺腺癌患者血漿外泌體miR-484 表達(dá)水平明顯升高；與肺腺癌患者術(shù)前相比，肺腺癌患者術(shù)后血漿外泌體miR-484 表達(dá)水平顯著降低，提示血漿外泌體miR-484 有望成為肺腺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。外泌體miRNAs 可作為肺癌的生物標(biāo)志物，可應(yīng)用于肺癌的診斷和分型，但介導(dǎo)肺癌發(fā)病的機(jī)制尚未明確，若能探索清楚肺癌的發(fā)病機(jī)制，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)阻斷這些機(jī)制的藥物，從而降低肺癌的發(fā)病率。

2.6 外泌體miRNAs 與腺病毒性肺炎腺病毒性肺炎是由人腺病毒感染引起的間質(zhì)性肺炎，其發(fā)病率及病死率較高，然而腺病毒性肺炎在臨床的診療工作仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。因此早期診斷及早期治療能改善其預(yù)后，故探索其早期診斷的生物標(biāo)志物具有深遠(yuǎn)的研究意義。HUANG 等［35］研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒性肺炎患者全血中miR-629-3p、miR-223-3p 和miR-142-3p 表達(dá)水平明顯升高，這說(shuō)明血源性miRNAs在腺病毒性肺炎中具有潛在的研究背景。HUANG等［36］通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析5 例腺病毒性肺炎患者和4 例健康對(duì)照組血清外泌體miRNAs 表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，腺病毒性肺炎患者血清中外泌體miR-450a-5p、miR-103a-3p、miR-103b-5p 和miR-98-5p 具有差異性表達(dá)，這說(shuō)明外泌體miRNAs 可作為診斷腺病毒性肺炎的候選生物標(biāo)志物。

3 總結(jié)與展望

隨著各種體液（血液、痰液、BALF 等）中外泌體miRNAs 的發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNAs 也成為慢阻肺、支氣管哮喘、IPF、肺結(jié)核、肺癌和腺病毒性肺炎等慢性肺部疾病早期診斷的研究熱點(diǎn)。經(jīng)過(guò)不懈的努力，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)外泌體miRNAs 作為慢性肺部疾病的診斷性生物標(biāo)志物取得新的進(jìn)展，但仍處于初級(jí)階段，仍有問(wèn)題急需解決：（1）外泌體miRNAs 與肺部疾病的發(fā)病機(jī)制研究尚淺，尚未系統(tǒng)、深入闡述。（2）缺乏簡(jiǎn)單、有效的早期診斷手段和靶向治療藥物。（3）肺部疾病存在病因多樣、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)，目前尚未發(fā)現(xiàn)特異的外泌體miRNAs 作用靶點(diǎn)。（4）盡管體液中的外泌體miRNAs 可作為疾病早期診斷的潛在標(biāo)志物，但大多處于基礎(chǔ)研究階段，且規(guī)模較小，缺乏大樣本和多中心的驗(yàn)證。（5）現(xiàn)今分離和富集體液外泌體的技術(shù)和方法較多，但存在程序復(fù)雜、設(shè)備昂貴等問(wèn)題，難以在臨床推廣應(yīng)用，使得外泌體miRNAs 的應(yīng)用也受到限制。為此，需要進(jìn)一步系統(tǒng)研究各種體液中外泌體miRNAs 與肺部疾病的發(fā)病機(jī)制，為將來(lái)研究出帶有保護(hù)性物質(zhì)（抗炎/抗纖維化miRNAs）的外泌體用于治療肺部疾病。