用于小分子生產的人工合成微生物菌群研究進展

婁行行，蘆紅云，魏天予，陳志元，李昌瑜，馬 闖，陳啟和

(1.浙江大學 食品科學與營養(yǎng)系，浙江 杭州 310058；2. 勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435000)

微生物遍布于地球，并且直接或間接地影響人類健康。自然微生物群落包括厭氧食物鏈、光養(yǎng)菌群、嗜酸菌群、根際和葉際菌群以及腸道或口腔的微生物區(qū)系[1]。這些自然微生物群落可能包含來自廣泛的種系分類群的物種[2]，它們的組成是由外部因素決定的，比如生長底物的可用性和代謝物的交換，這些分子信號通過生態(tài)網(wǎng)絡的一個亞群被檢測或被交換，而這個亞群根據(jù)這些分子信號在生態(tài)網(wǎng)絡中的具體作用而做出相應的反應[3]。因此，營養(yǎng)物質的可利用性和信號轉導協(xié)調了亞種群，并推動生態(tài)網(wǎng)絡內的合作分工[4]。

微生物菌群可以控制復雜生物材料的降解，相比于單一微生物，微生物菌群對環(huán)境變化和其他微生物入侵表現(xiàn)出更高耐受性[4]。在非結構化或結構化環(huán)境中[5]，微生物菌群中各微生物的分工可以減少單一微生物的生物合成負荷和代謝壓力[6]。如，多聚幾丁質在水棲環(huán)境中降解涉及將自然種群劃分為亞種群，從而形成一個線性的食物網(wǎng)[7]。只考慮營養(yǎng)素相互作用，Grosskopf等[8]描述二元組合的主要分類(圖1)，闡明了生物與生物之間的相互關系以及代謝作用，該二元模型能較好地從生態(tài)學層面和代謝應用水平上闡明微生物與微生物之間的互作，可以為生物的共培養(yǎng)提供理論基礎與技術依據(jù)。本文中，筆者主要綜述近兩年來微生物菌群在底物和產品可及性方面取得的進展，其范圍是通過在多個菌株中重新分配任務來減少每個菌株的代謝壓力和遺傳修飾，每個菌株作為網(wǎng)絡的一個操作單元而工作。

0/0—兩個微生物菌群無相互作用；0/-—用一個亞種群的產物抑制另一個亞種群的偏害共生；-/-—兩種微生物亞種爭奪所需的共同營養(yǎng)物質；+/-—在線性食物鏈中，通過第二亞群的產物抑制第一亞群的捕食/寄生；0/+—線性食物鏈中的共生；+/+—共生線性食物鏈中的互惠/合作。微生物(正方形)和代謝物(圓形)以及刺激(尖箭頭)和抑制(鈍箭頭)相互作用被描繪出來圖1 以代謝為基礎的微生物相互作用(a)和設計的微生物菌群將底物轉化為產品(b)Fig.1 Schematic representation of metabolite-based microbial interactions (a) and designed microbial consortia for converting substrates into products (b)

1 天然微生物菌群

微生物生物技術生產的典型作用是利用微生物將底物轉化為產品[9]。在自然界中，復雜底物的轉化是由具有未知功能的微生物菌群催化的[10]，這與使用單一菌株所進行的大多數(shù)生物技術過程相反。但是，天然微生物菌群在將底物轉化為所需的產物的過程中會產生副產物，從而降低了整個過程的產率[4]。人類使用自然微生物菌群已經(jīng)有上千年的歷史，如用于發(fā)酵食品、廢物處理和農業(yè)生產[11]，而這些應用都是“黑箱操作”，因為這個過程還沒有被完全解析，并且在這些應用中改變或維持微生物菌群構成的原則也沒有完全被理解[12]。農業(yè)上一個典型應用是使用促進植物生長的細菌，這種細菌通過建立植物間的相互作用來固氮，抑制植物病原體，溶解養(yǎng)分等。但由于與植物根際相關的微生物菌群會發(fā)生不可預測的變化，故這項技術在田間應用效果有限[13]。因為代謝異質性甚至可以在克隆微生物單一培養(yǎng)種群中發(fā)現(xiàn)，如生態(tài)因素、恒定環(huán)境中細胞固有動態(tài)或基因表達中的分子噪聲已經(jīng)被證實[14]。

2 利用復雜底物的合成微生物菌群研究

設計合成的微生物菌群是利用工程上的相互依賴性來減少天然微生物菌群中典型的異質性。這種還原論的方法對于理解諸如根際和葉球植物-微生物和微生物-微生物相互作用中的個體和群體生態(tài)系統(tǒng)功能以及本文所述的應用生物技術環(huán)境是有價值的[15]。在生物煉制中，可再生原料和大多數(shù)復雜的原料可以被轉化成多種增值化合物。如果原料是均勻和連續(xù)可用的，則可以使用專門的單一合成菌株。而合成微生物菌群的應用可視為代謝工程單一菌株生物技術的可行性擴展。如果原料供應和原料成分隨季節(jié)變化，采用專門調整的微生物菌群使底物轉換和/或產品形成的離散工藝步驟與當前的需求相匹配可能是有利的[16]。并且與單一菌株相比，合成微生物菌群可以利用更粗糙的底物顯示出更高的生物轉化效率和更便宜的純化過程[4]。最近將纖維素轉化為丁醇和/或異丁醇[17]合成微生物菌群的設計和概念驗證已被提出，還有從糖混合物中獲得最佳產出的羥基丁酸和蘋果酸[18]。具體的實例如表1所示。

表1 構建合成微生物菌群進行的小分子生物合成的實例Table 1 Recent examples of small molecule production processes based on synthetic microbial consortia

續(xù)表

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)在單一培養(yǎng)時可生產許多產品，特別是用于氨基酸生產[34]。近年來，用淀粉生產賴氨酸、尸胺(cadaverine)、L-2-哌啶酸(L-pipecolic acid)的過程都證實了E.coli(底物轉換)和C.glutamicum(增值化合物生產)之間勞動分工的概念[21](圖2)。同時研究者也開發(fā)出不同程度相互依賴的例子，即偏利共生(0/+相互作用)和互利共生(+/+相互作用)的聯(lián)合體，作為共生體的典型實例，將L -賴氨酸營養(yǎng)缺陷、蔗糖陰性的E.coli與生產L-賴氨酸的C.glutamicum共培養(yǎng)，由于C.glutamicum果糖輸入基因ptsF的缺失，當培養(yǎng)時添加蔗糖，C.glutamicum會利用蔗糖分泌果糖來喂養(yǎng)E.coli[21]；在蔗糖含量極低的培養(yǎng)基中，2種菌株都不能單一生長，但共生體可以生長并產生L-賴氨酸；當C.glutamicum生產的L -賴氨酸量超過了E.coli生長所需的量時，則會產生L-賴氨酸的凈產量，在這個共生菌群中，E.coli沒有給C.glutamicum生長提供好處(0/+相互作用)。類似地，還有分泌纖維素酶的T.reesei和產生富馬酸(fumaric acid)的R.delemar共培養(yǎng)時用木質纖維素生產富馬酸[20]。

圖2 合成共生菌群E. coli-C. glutamicum轉化底物轉化(淀粉水解)與合成產物(L-賴氨酸、尸胺、L-2-哌啶酸)的分工示意圖(改編自文獻[21])Fig.2 Division of labor between substrate conversion (starch hydrolysis) and production (L-lysine,cadaverine and L-pipecolic acid from glucose) insynthetic mutualistic E. coli-C. glutamicum consortia (adapted from reterence [21])

另一類微生物菌群E.coli-C.glutamicum也被研發(fā)應用，這2種細菌都彼此依賴于對方的代謝活動(+/+，相互作用)：利用E.coli將淀粉分解為葡萄糖，再通過C.glutamicum將葡萄糖轉化為賴氨酸，而其中代謝依賴性是通過使E.coli賴氨酸營養(yǎng)缺陷實現(xiàn)的[21]，即在淀粉基本培養(yǎng)基中，L-賴氨酸營養(yǎng)缺陷、分泌α-淀粉酶的E.coli菌株和淀粉酶陰性、生產過量L-賴氨酸的C.glutamicum共同培養(yǎng)可以產生賴氨酸[21]。這個工藝可以擴展到利用淀粉生產賴氨酸的衍生產品，如尸胺和L-2-哌啶酸，即將L-賴氨酸營養(yǎng)缺陷、分泌α-淀粉酶的E.coli與過量分泌尸胺或L-2-哌啶酸、淀粉酶陰性的C.glutamicum共培養(yǎng)生成尸胺或L-2-哌啶酸[21]。對于每一種組合，以淀粉為原料生產理想產物只能出現(xiàn)在設計的組合中，而不能單獨用于單個菌株。

微生物菌群的應用也存在一些技術上的障礙，如群體中各菌群的比例不穩(wěn)定、菌群進行增值化合物生產時產率低下。Sgobba等[21]在對E.coli-C.glutamicum菌群進行的25 L分批發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)，E.coli和C.glutamicum組成的互惠共同體可以從淀粉中生產L-賴氨酸。由于E.coli和C.glutamicum表達不同的熒光蛋白，因此可以鑒別該菌群的組成。通過熒光顯微鏡的單細胞分析顯示，共生體中C.glutamicum遠遠超過E.coli細胞，很可能共生菌群中E.coli細胞分泌的α-淀粉酶不足以維持淀粉水解，并且該共生菌群的賴氨酸產量不如分泌α-淀粉酶、L-賴氨酸高產的C.glutamicum菌株[21]。此外，人工設計的菌群以淀粉為底物生產尸胺和L-2-哌啶酸的總體滴度、產量和生產率均低于以葡萄糖為底物單一培養(yǎng)C.glutamicum生產的總體滴度、產量和生產率[21]。所以在人工合成微生物菌群被廣泛應用前，必須解決群體中各菌群的比例不穩(wěn)定、群體進行增值化合物生產時產率低下等關鍵技術問題。除了需要改進菌群的生產參數(shù)外，還必須開發(fā)一些工藝參數(shù)，包括穩(wěn)定保存聯(lián)合體的措施以及在生物反應器生產過程中維持微生物菌群穩(wěn)定性的方案。因此，一種微流體共培養(yǎng)系統(tǒng)被設計，并對其進行表征以便在單細胞分辨率下分析微生物群落的生長和相互作用[22]。雖然在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，2種不同微生物在相鄰微腔室內是空間分離的，但可以通過連接納米通道使代謝物得到充分交換，在培養(yǎng)室內，可以通過活細胞成像以高時空分辨率觀察細胞生長[22]，在常規(guī)方法中，單細胞活性通常會被平均總體行為完全掩蓋，與常規(guī)方法相反，微流體培養(yǎng)室的小尺寸可實現(xiàn)精確的環(huán)境控制和完整時空分辨率的細胞間相互作用觀察[22]。

3 合成微生物菌群用于復雜的生物合成途徑

合成微生物菌群也被開發(fā)用于代替利用整合復雜代謝途徑的單一微生物菌株合成單個產品的生物合成，因為這種模塊化方法可降低單個微生物細胞的代謝負擔[35-36]。單一菌群培養(yǎng)時，產品濃度和產量較低，如果這是由于合成過程中高代謝負擔造成的，那么合成微生物菌群則能克服這樣的瓶頸。相對于單一菌群，聯(lián)合體可以實現(xiàn)更多的基因修改，不同品系或物種的特定特征可以一種協(xié)調的方式結合起來[23,29]。微生物菌群能利用幾種物種來生產小分子，包括真菌和酵母，如T.reesii[20]、P.pastoris[30]或S.cerevisiae[37]以及細菌，如梭菌[17]、鏈霉菌[29]等(表1)。然而，大多數(shù)合成菌群依賴于E.coli的生長，當復雜的生物合成路線被細分，由一個菌群來實現(xiàn)時，這一點尤為突出(表1)。為了在一個聯(lián)合體的不同合作伙伴之間分配勞動，必須制定出詳細的復雜生物合成路線。其中，這些具體的路徑能以目標產品的合成途徑中的關鍵中間體為節(jié)點，兼顧合成過程中的物質、能量交換途徑的中間體轉運蛋白以及NADPH或ATP提供的子途徑不同的生化要求或對中間體或副產物積累的耐受性等因素。

合成微生物菌群的生產性能優(yōu)于單一培養(yǎng)的微生物，例如合成微生物菌群能實現(xiàn)賴氨酸生產和賴氨酸脫羧反應的分離[23]；可以避免混雜的羥化酶HpaBC將L-酪氨酸轉化為不穩(wěn)定的中間產物左旋多巴(levodopa)，使其完全轉化為咖啡醇(caffeoyl alcohol)[24]；或者利用模塊化甲羥戊酸途徑來獲得異戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate)[38]。香豆酸(p-coumaric acid)被轉化為幾種苷元并進行糖基化的生產已在幾個合成菌群中被成功分離出來[25-27,39]。微生物菌群的強化過程需要不同菌株之間的相互依賴，這可以通過設置營養(yǎng)缺陷體和交互共生來實現(xiàn)，例如在2個E.coli菌株的二元合成體中，其中一個菌株對氨基酸Ⅰ營養(yǎng)缺陷，但過量生產氨基酸Ⅱ，另一株菌則表現(xiàn)相反特性[32]。此外，還有一個不同在于它們利用碳源的潛力：一株菌能利用葡萄糖，但不能利用木糖，而另一株對葡萄糖和木糖為碳源都有排他性[32]。

線性二元、三元、甚至四元的微生物菌群已經(jīng)被用于更復雜的線性生物合成途徑。在一項重要研究中，酶和轉錄因子15個基因的過表達在4個獨立的E.coli菌株中實現(xiàn)(圖3)，以此來減少菌株代謝負擔，使獨立菌株針對特定模塊的需求進行優(yōu)化[28]。此外，設計非線性、聚合的生物合成途徑是可能的。例如在一個聚合的三元微生物群落中，2個菌株產生2種前體咖啡酸(caffeic acid)和丹參酸(salvianic acid A)，第3種則將這些前體轉化成迷迭香酸(rosmarinic acid)，其生物活性比單一菌株培養(yǎng)高出38倍[31]。迄今為止，2個或2個以上重組菌株的合成微生物菌群已成為研究熱點，當然也會從環(huán)境中選擇執(zhí)行特殊任務的群體，如P.fuscum和P.camembertii/P.clavigerum在共培養(yǎng)時會產生一種新的大環(huán)內酯類抗生素，即伯克利內酯[33]。

圖3 4種不同大腸桿菌參與的線性生物合成途徑示意(修改自文獻[28])Fig.3 Schematic diagram of a linear biosynthetic pathway involving four different E. coli strains(adapted from reterence [28])

4 適應性實驗室進化對于合成微生物菌群的改善

目前，在利用微生物菌群方面的一個大挑戰(zhàn)是，除了具有與單一栽培方法相當?shù)漠a量效價外，還要提高微生物菌群的性能，并使其在各種生長條件下保持穩(wěn)定。適應性實驗室進化(ALE)是利用可選擇的壓力作為選擇表型增強突變體的動力，在微生物合成生物學領域廣泛應用于開發(fā)新的生物學功能和研究菌株改良的一種工具[40]。ALE不但對單一培養(yǎng)中菌株/物種的代謝工程有巨大的貢獻，而且也可用于生產性能優(yōu)異的合成微生物菌群。R?der等[41]研究發(fā)現(xiàn)，ALE可增強細菌對生物膜形成的互惠性，在靜態(tài)環(huán)境下，溶淀粉芽孢桿菌(Paenibacillusamylolyticus)與反屈黃單胞菌(Xanthomonasretroflexus)共培養(yǎng)會表現(xiàn)出兼性互惠的交互作用，在此過程中，新的適應表型變異X.retroflexus出現(xiàn)。盡管此變體的出現(xiàn)與P.amylolyticus的存在并不直接相關，但這種突變刺激了生物膜的形成，從而提高了2個物種的生產力。ALE還可以改善小鼠胃腸道生物膜中菌群的共生依賴性[42]，這也可以應用于有益微生物在腸道中的定殖，若腸道微生物菌群成員和傳入的益生菌維持共棲或互惠的關系則可能增強其定殖能力，從而促進對腸道微生物菌群的系統(tǒng)調節(jié)，以改善健康。除此之外，ALE還可能增強菌群對環(huán)境的抗逆性。Liu等[43]研究發(fā)現(xiàn)，ALE可以改善微生物菌群對酸的抵抗力，從而擴大了嗜熱嗜酸性的應用范圍。隨著合成生物學不斷發(fā)展，ALE在合成菌群中的應用也會越來越多，并且ALE也可能與其他生物學手段相結合對微生物菌群進行修飾，以此提高微生物菌群的生產力，增加其產物多樣性，穩(wěn)定菌群構成。因此，ALE可能是推動從單一培養(yǎng)向微生物群落轉變的新策略。

5 結論

兩個或多個物種共同培養(yǎng)的生物技術已經(jīng)被用于發(fā)酵食品或經(jīng)典維生素C的生產中。代謝工程將這一概念提升到一個全新的水平，并且已經(jīng)在許多合成微生物菌群的驗證實例中得到驗證，且目前也已經(jīng)在實驗室規(guī)模上得到了證明，但是要在實際生產中應用這些共生群體，需要關注一些問題：第一，要求建立一個數(shù)據(jù)庫，對微生物的營養(yǎng)、培養(yǎng)和代謝特征的完整信息進行排序，以便在設計菌群的過程中對微生物進行選擇；第二，新技術的開發(fā)要提供聯(lián)合培養(yǎng)中微生物相互作用的概況；第三，需要新方法來適當?shù)亻L期保存和儲存混合微生物培養(yǎng)物；第四，擴大規(guī)模需要開發(fā)新的應變開發(fā)和過程控制策略，才能實現(xiàn)產業(yè)化。