一株抗氧化酵母的分離、鑒定及抗氧化轉(zhuǎn)錄譜分析

王夢飛，朱 紅，焦宏亮,周 華，蔡 恒

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800)

ROS作為信號因子調(diào)控細胞多個代謝過程，同時它又是造成氧化損傷的“罪魁禍首”。因此，細胞內(nèi)ROS水平的穩(wěn)態(tài)受多種途徑嚴格控制。為維持ROS處于較低水平，細胞發(fā)展了酶系和非酶系兩大類抗氧化途徑：酶系包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶與硫氧還蛋白過氧化物酶(PRX)等[9]；非酶系如抗壞血酸(Vc)、還原型谷胱甘肽(GSH)以及一些微量元素(Se、Zn等)。哺乳動物和酵母抗氧化反應(yīng)是相似的，且酵母基因表達調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導機制與高等生物具有高度同源性，被人們視為現(xiàn)代分子和細胞生物學中的真核模式生物[10]。

隨著測序技術(shù)日益發(fā)展和研究的深入，更加方便科研工作者對具有優(yōu)良抗逆性的野生酵母進行基因挖掘。本研究中，筆者以一株從自然界篩選獲取的具有較強抗氧化能力的酵母為研究基礎(chǔ)，對其進行菌種鑒定及性狀檢測，隨后通過RNA-seq技術(shù)研究外源添加H2O2誘導的氧化脅迫對該酵母基因表達轉(zhuǎn)錄的影響，以深入了解該酵母抗氧化能力優(yōu)良的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

NCY33，一株具有較強抗氧化能力的野生酵母，以H2O2為篩選物從自然界獲取。釀酒酵母BY4741(MATa;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0)，中國普通微生物菌種保藏管理中心。

酵母培養(yǎng)使用YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L；固體加入20 g/L瓊脂，如有需要加入不同濃度H2O2。121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 酵母的分離

從含有2 mmol/L H2O2的YPD培養(yǎng)基內(nèi)獲取3株活力最強的酵母，測定抗脂質(zhì)過氧化能力[11]及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)降解率[12]，將抗氧化能力最強的一株命名為NCY33，以釀酒酵母BY4741為參照對象，在含不同濃度H2O2的YPD平板上30 ℃培養(yǎng)3 d，拍照記錄。

1.2.2 菌種鑒定

使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)序列對該菌株進行菌種鑒定，引物使用 ITS-1與ITS-4[13]。以NCY33總DNA為模板進行PCR，產(chǎn)物經(jīng)純化后送至南京金斯瑞公司完成測序。使用BLASTN搜索識別物種(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用MEGA5.0構(gòu)建菌株進化樹，完成菌種鑒定。

1.2.3 酵母氧化脅迫處理

NCY33單菌落接入10 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜，制備種子液。以2%(體積分數(shù))的接種量，將種子液接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600為0.6～0.8)。加入H2O2，終濃度為4 mmol/L，為實驗組(test)?？瞻捉M(blank)不加H2O2，培養(yǎng)30 min，離心收集菌體。

1.2.4 RNA的分離與檢測

使用Yeast RNAiso kit(TaKaRa公司)試劑盒提取總RNA。每組3個平行樣。使用1%瓊脂糖進行凝膠電泳分離鑒定；使用NanoPhotometer?分光光度計(Implen公司)檢測RNA純度；利用QuIT?RNA檢測試劑盒通過Qube?2 Flurometer(Life Technologies公司)測量RNA濃度；使用安捷倫2100(Agilent Technologies公司)檢測RNA樣品的RNA 完整(RIN)值。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄譜測序

利用磁珠富集mRNA，片段化后進行逆轉(zhuǎn)錄。雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，最后進行PCR擴增并純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。文庫構(gòu)建完成后，隨后使用Agilent 2100對文庫進行測序。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

測序所得的原始數(shù)據(jù)稱為原始測序序列(raw reads)，里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads,需要對其過濾，獲得clean reads。由于未找到合適的參考基因組，因此在獲得clean reads后，采用Trinity對clean reads進行denove拼接獲取參考基因。采用RSEM軟件(默認參數(shù))將clean reads與拼接得到的參考基因進行比對，統(tǒng)計clean reads在參考基因組上的覆蓋度,得到每個樣品對應(yīng)到每個基因上的readcount數(shù)目并進行RPKM(reads per kilobase transcriptome per million mapped reads)轉(zhuǎn)化，分析基因的表達水平(在本文中，RPKM>0.3的基因被認為是表達的)。使用DESeq(篩選閾值padj<0.05)進行分析，獲取表達差異基因并制備火山圖。使用R軟件中的聚類軟件包pheatmap進行層次聚類分析。最后進行GO富集分析及KEGG富集分析，完成基因功能注釋及代謝途徑注釋。

1.2.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對DPPH降解率及抗脂質(zhì)過氧化能力進行數(shù)據(jù)分析，每組數(shù)值采用均數(shù)±標準差表示。多組間均數(shù)采用單因素方差分析(ANOVA)，p<0.05認為差異有顯著性。使用Origin 8.0完成作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株抗氧化能力的檢測

DPPH·是一種穩(wěn)定有機自由基，在517 nm處有一強吸收峰，可用來檢測某種物質(zhì)的抗氧化能力。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物，其含量在一定程度上可間接反映物質(zhì)的抗氧化能力。測定菌體密度為108cfu/mL時，菌液的DPPH·降解率和抗脂質(zhì)過氧化率，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知：初篩獲得的3株菌，DPPH降解率分別為38.60%±1.91%、30.88%±1.54%和26.40%±1.32%，抗脂質(zhì)過氧化率分別為67.15%±3.22%、53.34%±2.66%和40.78%±2.02%。其中，菌1抗氧化能力最強(p<0.05)，將其命名為NCY33。

圖1 3株菌對DPPH·降解率及抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ratio and anti-lipid peroxidation ability of three strains

NCY33與BY4741在不同濃度H2O2下的生長情況見圖2。

圖2 BY4741、NCY33在不同濃度H2O2下的生長情況Fig.2 Growth of BY4741 and NCY33 with H2O2

由圖2可知：與正常情況相比，2 mmol/L H2O2對兩株菌基本無影響；在4 mmol/L H2O2處理條件下，兩者生長明顯受到抑制，但與BY4741相比，NCY33受到影響較??；在6 mmol/L H2O2處理條件下，BY4741完全無法生長，而NCY33仍能少量生長。因此NCY33抗氧化能力要高于BY4741。

2.2 NCY33的菌種鑒定

ITS序列經(jīng)南京金斯瑞公司測序后，使用BLASTN及MEGA 5.0構(gòu)建出菌種進化樹(標準標尺為0.02)，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，該酵母為漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。

圖3 菌株NCY33基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partial ITS sequences of NCY33

2.3 RNA樣品質(zhì)量檢測

使用1%瓊脂糖凝膠電泳對RNA樣品進行檢測，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，18S rRNA與25S rRNA條帶清晰明亮，無拖尾。RNA樣品的純度、濃度以及完整性(RIN值)詳情見表1。由表1可知，OD260/OD280均為2.0～2.2，RIN值為6.9～8.9。這6個RNA樣品質(zhì)量合格，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄譜測序。

圖4 NCY33總RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of total RNA from NCY33

表1 RNA樣品整體質(zhì)量Table 1 RNA sample overall quality

2.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

測序所得的原始數(shù)據(jù)稱為raw reads，需對其進行過濾，獲得clean reads，結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過濾后，每個樣品獲得超過4G數(shù)據(jù)，其中Q30的clean reads占總體的91%以上。樣品GC含量基本相同，基本維持在39.5%左右。數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

表2 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Statistics of sample sequencing data

2.5 參考序列的拼接及比對

由于該菌株測序結(jié)果與已公布的多個酵母的基因組配對率較低，僅為10%左右，因此本研究將對測序結(jié)果進行無參分析。將clear datas與拼接得到的參考基因進行比對，結(jié)果見表3。由表3可知，這6個樣品的比對率均超過87%，數(shù)據(jù)符合要求(比對率(mapping rate)>80%)，可進行下一步分析。

表3 Reads與參考序列比對情況一覽表Table 3 Reads and reference sequence comparison list

2.6 差異表達基因的篩選

使用DESeq(閾值padj<0.05)篩選差異表達基因，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在4 mmol/L H2O2誘導的氧化脅迫環(huán)境中，NCY33共有2 387個基因出現(xiàn)顯著的差異表達，其中有1 286個上調(diào)(紅色)，1 101個下調(diào)(綠色)。

注：橫坐標代表表達倍數(shù)變化；縱坐標代表差異顯著程度圖5 實驗組與空白組之間的差異表達基因Fig.5 Differential expressed genes between test and blank

2.7 差異表達基因GO富集分析

為獲得基因的功能信息，使用GO數(shù)據(jù)庫完成基因注釋，包括同源蛋白注釋，結(jié)果見圖6?；谛蛄型葱裕凶R別到的基因可以通過一些共同的生物學特性而被歸類。根據(jù)GO功能大致可分為生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大類29分支。由圖6可知，生物過程中，主要是細胞代謝過程、有機物代謝過程、單細胞生物過程和初級代謝的基因發(fā)生變化。細胞組分中，差異基因主要集中于細胞質(zhì)以及膜結(jié)構(gòu)方面，另外，所有參與蛋白酶體的基因全部上調(diào)。分子功能中，參與有機環(huán)化合物結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、離子結(jié)合的基因大多差異表達。

圖6 NCY33在氧化脅迫下的差異表達基因的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of the differential expressed genes of NCY33 under oxidation condition

2.8 氧化應(yīng)激耐受的代謝途徑

H2O2誘導的氧化脅迫導致胞內(nèi)多種代謝途徑發(fā)生明顯改變，圖7展示了富集途徑中變化最明顯的20條代謝途徑。在此基礎(chǔ)上，為詳細了解該酵母的抗氧化機制，筆者將從多個方向進行深入解析。

圖7 KEGG pathway富集散點Fig.7 KEGG pathway enrichment scatter plot

2.8.1 抗氧化系統(tǒng)

圖8 抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄變化Fig.8 Transcriptic changes of antioxidant enzymes under H2O2

2.8.2 DNA修復途徑

ROS會對基因造成多種損傷，包括堿基氧化、堿基位點脫落和DNA鏈斷裂[18]。ROS造成的損傷主要是通過堿基切除途徑進行修復，且該途徑分為短片段和長片段兩種[19]。圖9為堿基切除修復途徑中基因轉(zhuǎn)錄的變化情況。由圖9可知，涉及長片段修復途徑的差異基因全部上調(diào)，ALKA編碼的3-甲基腺嘌呤糖基化酶Ⅱ識別受損堿基，將其切除形成AP位點，該位點被AP核酸內(nèi)切酶(未檢測到變化)處理，形成核苷酸缺口[20]，在POLE1、POLE2和POLD1、POLD2編碼的4個亞基構(gòu)成的DNA聚合酶作用下完成修補。但是多個核苷酸的連接導致原DNA 鏈以單鏈懸臂或者帽子結(jié)構(gòu)暴露出來，這就需要FEN1編碼的皮瓣內(nèi)切酶將其切除。最后在Lig1編碼的DNA連接酶的作用下連接DNA片段，完成修復。PCNA編碼的增殖細胞核抗原起到調(diào)控DNA聚合酶的作用。而在短鏈BER途徑中，編碼DNA-甲氨基嘧啶糖基化酶的FPG和編碼內(nèi)切酶3的NTH轉(zhuǎn)錄水平均下調(diào)，這一結(jié)果將限制短鏈BER途徑的效率，其原因可能在氧化脅迫下，DNA發(fā)生大規(guī)模損傷，而短鏈修復途徑效率過低，細胞此時主要依賴于長鏈途徑對受損DNA進行高效修復。

圖9 堿基切除修復途徑中基因轉(zhuǎn)錄變化情況Fig.9 Transcriptic changes of genes in base excision repair

2.8.3 錯誤蛋白的降解途徑

ROS直接對蛋白質(zhì)進行修飾，可造成DNA突變和MDA(丙二醛)的產(chǎn)生，間接引起蛋白質(zhì)錯誤折疊并聚集。細胞通過泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)(UPP)和自噬途徑清除錯誤蛋白。泛素化-蛋白酶體途徑需要Ube1(泛素活化酶E1)激活泛素(Ub)，在其甘氨酸殘基和半胱氨酸殘基的活性位點處形成一個硫脂鍵，Ube2(泛素結(jié)合酶)通過硫脂鍵反應(yīng)獲得激活的Ub，隨后Ube3(泛素連接酶)引導激活的Ub從E2轉(zhuǎn)移到蛋白底物，這些被泛素標記的蛋白底物在26S蛋白酶體中降解[21]。圖10為涉及蛋白質(zhì)降解途徑的多基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。由圖10可以看到，UBE1、UBE2和3種UBE3轉(zhuǎn)錄水平均升高，蛋白酶體內(nèi)的多個RPN與RPT調(diào)節(jié)亞基以及PSM組成亞基轉(zhuǎn)錄水平均升高了1倍以上，泛素化-蛋白酶體途徑整體增強。細胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)都是由泛素化-蛋白酶體途徑完成降解[22]。當?shù)鞍踪|(zhì)聚集體過大時，蛋白酶體無法將其降解，細胞啟動自噬途徑進行清除[23]。本實驗中ATG1、ATG11、LC3轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生上調(diào)。ATG1是自噬途徑的調(diào)控基因，控制著自噬的啟動。Atg11作為選擇性自噬中的適配蛋白,協(xié)助受體蛋白將目標蛋白運送至降解位點[24]。LC3編碼γ-氨基丁酸(A)受體相關(guān)蛋白，其活性直接影響形成自噬體的數(shù)量[25]。自噬的適度增強不僅可清除受損蛋白質(zhì)與細胞器，還可為細胞的生命活動提供能量與原料。在人體中，迄今已發(fā)現(xiàn)20多種蛋白質(zhì)的錯誤折疊與諸多神經(jīng)退性疾病有關(guān)，如AD、PD、亨廷頓病(HD)和肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)等[26]。如何增強人體清除錯誤蛋白的能力，是治療多種神經(jīng)退性疾病的一大方向。以酵母作為生物模型，通過研究氧化脅迫下，該酵母參與降解錯誤蛋白的主要途徑及關(guān)鍵基因，進一步了解降解機制，為治療神經(jīng)退性疾病提供新靶點。

圖10 涉及蛋白質(zhì)降解途徑的多個基因變化情況Fig.10 Transcriptic changes of genes relating to protein degradation

2.8.4 能量合成途徑

能量是生物進行生命活動的基本要求，真核需氧生物利用葡萄糖通過糖酵解、三羧酸循環(huán)(TCA)、氧化磷酸化以及脂肪酸氧化途徑產(chǎn)生能量，在氧化脅迫環(huán)境中，這些途徑均發(fā)生變化。圖11為能量合成途徑中多個關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。由圖11可知，在氧化脅迫下，該酵母糖酵解上游多個基因發(fā)生下調(diào)，如HK(己糖激酶)、GPI(6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶)基因，而磷酸戊糖途徑中2個限速酶G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、PGD(6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶)明顯上調(diào)，其結(jié)果是葡萄糖將主要進入磷酸戊糖途徑進行初步代謝，最終生成3-磷酸甘油醛重新進入糖酵解，隨后在PGAM(磷酸甘油酸變位酶)、ENO(烯醇化酶)和PK(丙酮酸激酶)等酶的作用下生成丙酮酸。這一變化既減少了ATP的消耗又產(chǎn)生了大量NADPH用于抗氧化過程。在脂肪酸β氧化過程中，除編碼?；o酶A脫氫酶的ACADM外都發(fā)生明顯下調(diào)。ACOX編碼脂酰輔酶A氧化酶催化脂酰輔酶A脫氫后，與O2結(jié)合生成H2O2而不是H2O[27]。細胞可能為避免更多H2O2的生成主動減弱該過程的進行。在三羧酸循環(huán)中，基因表達變化的結(jié)果將導致α-酮戊二酸積累，α-酮戊二酸可直接參與H2O2的清除，同時也能增強谷胱甘肽的合成增加抗氧化能力[28]。另外，在電子傳遞鏈中幾乎所有差異基因均發(fā)生下調(diào)，尤其是編碼復合體Ⅰ和復合體Ⅲ亞基的基因(數(shù)據(jù)未顯示)。二者均是ROS的主要產(chǎn)生位點[29]，這可能與ACOX下調(diào)的原因一致。在氧化脅迫下，該細胞通過對代謝的整體調(diào)控，維持胞內(nèi)代謝的基本運行，避免ROS大量產(chǎn)生的同時，保證ATP的基本供應(yīng)，產(chǎn)生大量的[H]用于清除ROS，保證細胞能夠在氧化脅迫下繼續(xù)存活。

圖11 能量合成途徑多個關(guān)鍵基因變化情況Fig.11 Transcriptic changes of genes participating in energy synthesis

3 結(jié)論

從自然界中篩選得到1株DPPH降解能力及抗脂質(zhì)過氧化能力分別為38.60%±1.91%、 67.15%±3.22%且可耐受6 mmol/L H2O2的德巴利漢遜酵母，命名為NCY33。該酵母在H2O2誘導的氧化脅迫下，共有1 286個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，1 101個下調(diào)。通過對可能會影響細胞抗氧化能力的途徑進行分析發(fā)現(xiàn)：該酵母處于氧化脅迫下，調(diào)整能量代謝方式，在維持能量供應(yīng)的同時避免ROS的產(chǎn)生；增強抗氧化系統(tǒng)，用于清除ROS；增強自噬及泛素化途徑，清除錯誤蛋白；提高堿基切除修復系統(tǒng)對受損DNA進行修復。