間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝病的研究進(jìn)展

魏玉華（綜述），施寶民（審校）

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科，上海200065

肝病早期往往發(fā)生纖維化，如果不及時(shí)治療或控制，隨著肝纖維化程度的進(jìn)一步加重，最終可能發(fā)展為肝硬化，甚至轉(zhuǎn)化為肝癌［1］。我國(guó)的肝細(xì)胞癌發(fā)病率位列所有腫瘤的第2位，且發(fā)病率仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［2］。肝病肝纖維化形成的主要包括肝炎病毒、酒精、自身免疫等，這些病因都會(huì)引起正常肝細(xì)胞的凋亡和肝星狀細(xì)胞（HSCs）的激活，造成肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度積累和肝結(jié)構(gòu)的破壞［3］。近些年，對(duì)于肝病肝纖維化的治療，仍沒有特別有效的方法，對(duì)于已發(fā)展為終末期肝病的患者，目前最有效的治療手段是肝移植，但是供體器官短缺，免疫排斥以及費(fèi)用較高等問題，限制了肝移植治療［4］。因此，進(jìn)一步研究治療肝病的有效方法，意義重大。

目前，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治療肝病被認(rèn)為是一種很有效的治療策略，其優(yōu)點(diǎn)是具有持續(xù)的自我更新、增殖、多能分化和免疫調(diào)節(jié)活性，而且其抗原性低，可以進(jìn)行同種異體MSCs移植［5-7］。許多研究已經(jīng)開始闡明可能的機(jī)制，包括向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)免疫功能以及分泌外泌體等。

1 MSCs的來源及特性

MSCs最初由骨髓中鑒定和分離出來的，在體內(nèi)和體外都可以分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。MSCs廣泛分布于體內(nèi)組織，具有持續(xù)的自我更新和多向分化的能力［8］?，F(xiàn)在，研究發(fā)現(xiàn)多種組織中都可以分離出MSCs，包括滑膜、脂肪組織、臍帶血、羊水和胎盤等都可以作為MSCs的提取來源［8］。國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)提出了一套界定MSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)［9］：（1）可塑性黏附；（2）一套特定的細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD73，CD90，CD105），同時(shí)缺乏CD14、CD34、CD45和人白細(xì)胞抗原DR；（3）體外分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的能力。

有研究提出，MSCs傳統(tǒng)黏附單層培養(yǎng)系統(tǒng)具有許多限制，為了提高M(jìn)SCs培養(yǎng)的質(zhì)量和效率［10］。利用傳統(tǒng)的二維（2D）單層培養(yǎng)方案進(jìn)行MSCs的培養(yǎng)，不能模擬體內(nèi)原生的細(xì)胞微環(huán)境，這可能導(dǎo)致MSCs表型的改變、歸巢和遷移能力的損傷。所以，他們?cè)谔剿?D培養(yǎng)體系，將人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs），置于豬來源的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，觀察到hUC-MSCs在3D系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，其表達(dá)的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLRs）和 趨 化 因 子 受 體4型（CXCR 4）等因子發(fā)生變化。而且與2D培養(yǎng)相比，在3D培養(yǎng)中CD105陽性細(xì)胞百分比顯著降低，CD34-和CD271陽性細(xì)胞顯著增加。TLR2、TLR3、TLR4、TLR6和CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加。近年來，有研究［11］發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境培養(yǎng)出的MSCs（hypo-MSCs）比在正常氧環(huán)境下培養(yǎng)出的MSCs（nor-MSCs）具有更強(qiáng)的治療作用，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。（1）hypo MSCs產(chǎn)生更多的前列腺E合酶（PTGES）；（2）產(chǎn)生較多miR-210，減少肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的凋亡；（3）能產(chǎn)生前列腺素E2，激活抗炎巨噬細(xì)胞；（4）具有降低氧化應(yīng)激的作用。

MSCs具有很強(qiáng)的自我更新能力，是較為理想的細(xì)胞移植來源，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)方面的治療具有巨大潛能。MSCs可以分化成內(nèi)胚層細(xì)胞以及大多數(shù)中胚層和外胚層細(xì)胞［12］。MSCs還表現(xiàn)出抗炎、抗氧化、血管生成和抗纖維化作用，然而MSCs的功能分化由許多因子決定，包括趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和外泌體等。有研究證明，由成年小鼠的不同器官和組織中產(chǎn)生的MSCs都具有類似于骨髓來源MSCs的形態(tài)、生長(zhǎng)特性及免疫表型［13］。但在眾多的MSCs的來源中，人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSC）是最理想的來源［14］。因?yàn)閔UCMSCs不僅具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的共同屬性，而且具有更穩(wěn)定的生物學(xué)特性、相對(duì)容易獲得、來源豐富以及無倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，hUC-MSCs成為了目前研究的焦點(diǎn)。

2 MSCs治療肝病的效果

近年來，有很多研究者將MSCs用于肝病的治療，包括基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究，其治療的有效性及安全性逐漸被證明［5，15-20］。Sang等［5］對(duì)包括717名肝硬化患者的14項(xiàng)試驗(yàn)，進(jìn)行了meta分析，其中研究證明了MSCs聯(lián)合傳統(tǒng)藥物治療組與單用傳統(tǒng)藥物治療組相比，MSCs聯(lián)合傳統(tǒng)藥物有更好的治療效果，肝功能明顯改善，體現(xiàn)在總膽紅素、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、凝血酶原時(shí)間等指標(biāo)明顯降低，而血清白蛋白、膽堿酯酶、凝血酶原活性等明顯升高。Liang等［7］進(jìn)行臨床試驗(yàn)，包括肝硬化患者26例。通過外周靜脈移植同種異體MSCs，其中移植臍帶MSCs 23例，臍血MSCs 2例，骨髓MSCs 1例。隨訪6個(gè)月后，總膽紅素和凝血酶原時(shí)間均值下降；血清白蛋白水平有所升高；在6個(gè)月后，進(jìn)行終末期肝?。∕ELD）評(píng)分也有所改善。Fang等［19］進(jìn)行的臨床試驗(yàn)表明，對(duì)失代償期肝硬化患者，經(jīng)靜脈移植注射骨髓MSCs后，患者的血清白蛋白，總膽紅素以及凝血酶原時(shí)間都得到了明顯改善。MSCs組患者治療后的Child-Pugh評(píng)分也明顯優(yōu)于對(duì)照組，而且MSCs組的死亡率要低于對(duì)照組。有臨床試驗(yàn)對(duì)MSCs治療乙肝相關(guān)肝病的效果進(jìn)行研究，110名乙肝相關(guān)ACLF患者被納入這項(xiàng)開放標(biāo)簽、非盲隨機(jī)對(duì)照研究［20］。對(duì)照組（n=554）僅采用標(biāo)準(zhǔn)藥物治療（SMT）；實(shí)驗(yàn)組（n=556）輸注異基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞4周，觀察24周。MSCs組的累積生存率為73.2%；SMT組為55.6%。在隨訪的第5～24周，輸注MSCs患者沒有與輸液相關(guān)的副作用，但與SMT患者相比，發(fā)熱更為頻繁。兩組試驗(yàn)患者均未發(fā)生腫瘤。與對(duì)照組相比，異基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療顯著改善了血清總膽紅素和終末期肝病評(píng)分模型等臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。而且MSCs組多器官衰竭和嚴(yán)重感染的死亡率低于SMT組（17.9%對(duì)37.0%）。這些研究都證明了外周靜脈行同種異體MSCs移植治療肝病的有效性。

3 MSCs治療肝病的作用機(jī)制

3.1 MSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞

MSCs移植注射到體內(nèi)后，分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞（HLCs），可能是MSCs移植治療肝病的機(jī)制之一［21］。有研究發(fā)現(xiàn)，使用CCl4建立大鼠肝纖維化和肝硬化模型，然后輸注人源性hUC-MSCs后，觀察小鼠肝纖維化的相關(guān)指標(biāo)，檢測(cè)產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)出現(xiàn)人源性ALB、AFP、CK18和CK19，但未檢測(cè)到鼠源性ALB、AFP、CK18和CK19［22］。說明hUC-MSCs可以在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞，MSCs可被誘導(dǎo)分化為HLCs。而且，MSCs可以在體外被誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生iPSCs，iPSCs再被誘導(dǎo)分化產(chǎn)生HLCs，且由MSCs誘導(dǎo)分化的iPSCs端粒酶活性較高、有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力及對(duì)炎癥細(xì)胞因子敏感性更低［21］。由iPSCs分化產(chǎn)生的肝細(xì)胞與人體肝組織細(xì)胞相似性極高，體外培養(yǎng)的MSCs可以被誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生多能干細(xì)胞（iPSCs），然后，iPSCs再分化為HLCs。所以，MSCs可作為HLCs理想的細(xì)胞來源［23］。雖然，通過MSCs誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的HLCs，具有一定的肝細(xì)胞相關(guān)功能和生物活性，但有研究認(rèn)為其表達(dá)水平要低于原肝細(xì)胞的表達(dá)水平。所以，在考慮用HLCs替代全肝細(xì)胞功能時(shí)應(yīng)慎重［23］。

3.2 MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)特性，通過多種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)［25］。Yousefifard等［26］認(rèn)為，MSCs是通過充當(dāng)“轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞”來影響各種“效應(yīng)細(xì)胞”，例如T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。MSCs可以分泌多種生物活性分子，包括多種細(xì)胞因子、HGF和IL-10。IL-10是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，具有抑制血清中炎癥細(xì)胞因子的功能，包括IL-6、TNF-1、干擾素-γ等，可以改善肝硬化大鼠的肝組織中淋巴細(xì)胞增殖，可促進(jìn)肝臟修復(fù)，抑制肝硬化的發(fā)生。在注射MSCs后，失代償期肝硬化患者的外周血中Treg細(xì)胞、TGFβ和IL-10水平明顯升高，而血清IL-6、TNF-α和CD8-T細(xì)胞水平顯著下降［19］。MSCs可以通過上調(diào)TGF-1和Treg細(xì)胞，顯著降低小鼠外周血中的CD4+T和CD8+T細(xì) 胞。Luo等［27］研 究 采 用 靜 脈 移 植 骨 髓MSCs，發(fā)現(xiàn)移植后，肝組織中F4/80+、CD206+活化的M2巨噬細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP 13）表達(dá)明顯增加，而F4/80+、iNOS+活化的M1巨噬細(xì)胞表達(dá)明顯受到抑制。IL-10基因表達(dá)升高，IL-12b、IFN-γ、TNF-α和IL-6基因表達(dá)降低。BM-MSC條件培養(yǎng)基處理的JS1細(xì)胞（肝星狀細(xì)胞株的TGF-β1）和膠原-1分泌減少，caspase-3分泌增加。而且，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能有效抑制肝內(nèi)與肝纖維化呈正相關(guān)的α-SMA、天狼星紅和膠原-1的表達(dá)。這說明骨髓MSCs移植可促進(jìn)表達(dá)MMP13的M2巨噬細(xì)胞活化，抑制M1巨噬細(xì)胞進(jìn)一步抑制肝星狀細(xì)胞（HSCs），有效減輕肝纖維化。

最近，Wang等［28］研究認(rèn)為TSG-6是MSCs的主要抗纖維化細(xì)胞因子。MSCs表達(dá)產(chǎn)生的腫瘤壞死因子（TNF）刺激基因6（TSG-6）。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，外源性單用TSG-6就可減輕肝纖維化，而TSG-6被敲除的MSCs（Lv-TSG-6mscs）則無抗纖維化作用。而且實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的研究證實(shí)了TSG-6可以通過調(diào)節(jié)M2巨噬細(xì)胞和增加基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP12）的表達(dá)來抗纖維化。他們發(fā)現(xiàn)TSG-6、MMP12和促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）之間存在一個(gè)反饋環(huán)，可能有助于進(jìn)一步了解肝硬化的加重過程，以及TSG-6和MSCs的抗纖維化機(jī)制。

3.3 MSCs衍生的外泌體

MSCs衍生的外泌體也被認(rèn)為是促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、維持肝細(xì)胞功能的主要作用機(jī)制之一［29］。最近，MSCs的外泌體對(duì)肝纖維化的治療作用引起人們的重視［30］。MSCs外泌體還有一定的優(yōu)勢(shì)，外泌體比其母細(xì)胞小，易于生產(chǎn)和儲(chǔ)存，膜表面蛋白含量較低，其免疫原性也低于其母細(xì)胞，特別是，不存在腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)［31］。因此，MSCs產(chǎn)生的外泌體，有希望成為替代MSCs細(xì)胞移植的治療方法，作為一種新型的無細(xì)胞治療手段［32］。

MSCs的旁分泌功能是通過分泌可溶性因子和釋放細(xì)胞外小泡（EVs）來發(fā)揮的，主要含外泌體（Exosome）。外泌體主要由miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等構(gòu)成，可以從分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞發(fā)揮作用［33-34］。miRNA是構(gòu)成外泌體含量的重要部分，也是外泌體發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵。外泌體的主要功能是作為載體將miRNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。外泌體作為載體，通過轉(zhuǎn)移生物活性分子來介導(dǎo)細(xì)胞間的溝通，其含有的miRNA具有特定的基因序列，可以調(diào)控靶細(xì)胞的表達(dá)［35］。所以，外泌體對(duì)于細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊至關(guān)重要。YIN等［14］研究證明了通過MSCs衍生的外泌體，治療不同疾病的有效性，包括缺血性心臟病，肝纖維化和腦血管疾病。有研究［31］認(rèn)為，輸注MSCs產(chǎn)生的外泌體有利于促進(jìn)肝損傷修復(fù)，改善肝功能。所以，他們認(rèn)為MSCs分泌的具有生物活性的細(xì)胞因子才是促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)的主要原因。

4 問題與展望

MSCs體外培養(yǎng)分化誘導(dǎo)后再移植到體內(nèi)對(duì)治療肝病的有效性已得到證實(shí)，但仍存在一些問題，如MSCs直接注射或在肝臟中植入的長(zhǎng)期有效性、干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在風(fēng)險(xiǎn)［36］以及體內(nèi)治療的效率和能力等。以前，大部分研究都集中在體外培養(yǎng)MSCs，再將MSCs移植到動(dòng)物模型或者肝病患者體內(nèi)，隨后評(píng)估肝功能指標(biāo)的變化用于證明MSCs治療肝病作用。但近來，有研究［33，37］證明，損傷部位的功能改善與MSCs細(xì)胞植入或分化之間缺乏相關(guān)性。MSCs主要作用機(jī)制不是細(xì)胞本身到達(dá)受損肝臟組織，而是通過其分泌的外泌體，轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)組織修復(fù)功能［38］。

綜上，MSCs是一種非常有前景的治療肝病的方法，而且其有效性已經(jīng)得到證實(shí)。但其安全性、具體作用機(jī)制還不明確，以及如何提高其治療效果和治療效率等問題還有待解決。