長鏈非編碼RNA在急性髓系白血病發(fā)病中作用機制的研究進展

何雨晨，徐英英，葛繁梅

延安大學附屬醫(yī)院，陜西延安 716000

急性髓系白血病(AML)是一種病因?qū)W、臨床、細胞遺傳學和分子異質(zhì)性疾病，其特征是未成熟髓系祖細胞增殖失控，凋亡受阻[1]。文獻[2]報道，基因異常和表觀遺傳學改變是AML發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類對于基因表達水平具有調(diào)控作用的重要生物分子，參與了染色體失活、染色體修飾、基因印記、細胞分化調(diào)控及細胞周期調(diào)控等生物過程。lncRNA來源多種多樣[3～10]，癌癥易感性候選者15(CASC15)、長鏈非編碼RNA HOXB簇反義RNA3(HOXB-AS3)、人H19基因(H19)、homeobox反義基因RNA(HOTAIR)、INK位點反義非編碼RNA(ANRIL)、SBF2的反義RNA(SBF2-AS1)、長基因間非編碼RNA 00662(LINC00662)等lncRNA通過不同的作用機制在AML中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)就lncRNA在AML發(fā)病中的作用機制研究進展情況作一綜述。

1 CASC15在AML發(fā)病中的作用機制

盡管lncRNA的基因結(jié)構(gòu)都非常相似，但不同的lncRNA的功能卻有很大差異，它們在細胞水平上發(fā)揮著多種作用，包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯，導致基因表達的改變。其中一個功能是在順式中調(diào)控基因表達，導致lncRNA表達下調(diào)或過表達，從而使染色體鄰近基因的表達發(fā)生調(diào)控，如CASC15。CASC15是一種保守的lncRNA，編碼lncRNA的基因在基因組中表現(xiàn)出位置保守性，包含非常短的物種間高度保守序列[11]。有學者發(fā)現(xiàn)[12]，在細胞水平上CASC15調(diào)控細胞存活、增殖及其染色體鄰近基因SOX4的表達。CASC15敲低后的差異調(diào)節(jié)基因豐富了陰陽1(YY1)轉(zhuǎn)錄因子的預測轉(zhuǎn)錄靶標，且CASC15增強了YY1介導的SOX4啟動子的調(diào)控。在AML患者中，與inv(16)和DEK-NUP214易位的患者相比，RUNX1-RUNX1T1易位患者的CASC15上調(diào)；而在t(8；21)的AML病例中，CASC15的表達最高。這代表了該CASC15導致runx1易位在白血病中有一定的作用機制。實驗證實，CASC15的強制表達導致發(fā)育中的髓樣偏倚并且整體上減少了移植和菌落形成，在整個實驗過程中，CASC15表達細胞的這種表型是持久的，并且在CASC15的細胞中保持了相對的髓樣偏倚，在實驗結(jié)束時，對血淋巴器官進行了分析，發(fā)現(xiàn)整體移植減少，并且出現(xiàn)了發(fā)育中的髓樣偏倚。CASC15的表達在伴有t(8；21)的AML病例中最高，其在細胞中的表達導致造血系統(tǒng)凋亡增加、移植減少，證明CASC15表達可能限制細胞增殖。在分子水平上，CASC15通過調(diào)節(jié)SOX4的表達起作用，這可能是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(如YY1)的活性來實現(xiàn)的，這將會為lncRNA在AML中的研究開辟一條新道路。

2 HOXB-AS3在AML發(fā)病中的作用機制

HOXB-AS3是一種細胞質(zhì)lncRNA，通過增加參與細胞周期進展和DNA復制的基因表達來促進細胞增殖。HOXB-AS3是位于17q21，32染色體HOXB(人類同源基因B)簇上的lncRNA，通過選擇性剪接產(chǎn)生8個轉(zhuǎn)錄變異。HOX(同源基因)在細胞增殖、造血和白血病發(fā)生中起著重要作用[13]。Huang等[14]用慢性病毒攜帶作為對照，兩種HOXB-AS3shRNA相互作用的綠色熒光蛋白(GFP)感染髓系OCI/AML3(人急性髓細胞性白血病細胞)，然后對感染細胞進行分選增殖試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶HOXB-AS3shRNA的細胞比攜帶對照shRNA的細胞生長緩慢，這就證實了HOXB-AS3的變性有一定的抗增殖作用。如果在兩個骨髓細胞系中敲除HOXB-AS3，HOXB-AS3的下調(diào)通過降低進入S期的細胞數(shù)量，抑制OCI/AML3的增殖。HOXB-AS3的下調(diào)抑制了細胞的增殖，HOXB-AS3在不影響HOX簇表達的情況下，增強了細胞周期進展和DNA復制中幾個關(guān)鍵因子的表達。在AML中，HOXB-AS3表達高的患者生存期短于HOXB-AS3表達低的患者，高水平的HOTXB-AS3表達與較短的總體生存期明顯相關(guān)。因此，HOXB-AS3的高表達是AML患者的不良預后因素，可成為AML的一個新的治療靶點[14]。

3 H19在AML發(fā)病中的作用機制

H19編碼了一個2.3 kb的lncRNA，在胚胎發(fā)育和生長控制中起至關(guān)重要的作用。H19與鄰近基因IGF2相互印跡，導致H19與母體等位基因差異表達，IGF2與父本等位基因差異表達，H19的異常表達或印跡缺失與多種癌癥包括血液學惡性腫瘤有關(guān)[15]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)，AML患者H19表達明顯高于對照組。因H19是一個印跡基因，并受DMR/ICR(差異甲基化區(qū)域/印跡控制區(qū)域)中甲基化模式的控制，所以Zhang等利用RT-qMSP(特異檢測DNA甲基化修飾的定量PCR)發(fā)現(xiàn)H19在AML中的DMR/ICR甲基水平與對照組相似，并從醫(yī)學癌癥(TGGA)數(shù)據(jù)庫中對H19甲基化和表達的進行了獨立評估，進一步證實了AML中H19過表達不依賴于H19甲基化。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)H19在白血病中與細胞增殖、分裂、分化、凋亡、造血等有關(guān)。在體外實驗中，Zhang等驗證了H19對AML的促白血病作用，因此所有白血病細胞都出現(xiàn)H19表達增加。若敲除H19，發(fā)現(xiàn)細胞的增殖顯著減少，凋亡顯著增加，證明H19在白血病細胞中具有促增殖和抗凋亡的作用。總之，H19在白血病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，可作為AML的預后和生物標志物，成為潛在的治療靶點。

4 HOTAIR在AML發(fā)病中的作用機制

HOTAIR參與了多種腫瘤的發(fā)生，如HOTAIR的上調(diào)和HOXA5的甲?；谌橄侔┑陌l(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[17]。HOTAIR與homeoboxA5(HOXA5)相互協(xié)同作用，與非小細胞肺癌的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。目前發(fā)現(xiàn)HOTAIR是AML患者復發(fā)診斷和預后不良的潛在預測因子，而且高表達HOTAIR可能通過調(diào)控細胞增殖和凋亡來參與AML的進展。Wang等[19]做了以下驗證。首先，在AML樣品和收集的細胞中檢查HOTAIR的表達；接下來，在AML細胞中進行功能增強或喪失功能實驗，以探索HOTAIR對AML的作用；然后，測量HOXA5啟動子甲基化，HOTAIR和Dnmt3b(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)之間的關(guān)系，還檢測了HOXA5的表達和細胞增殖/凋亡相關(guān)基因；最后，進行體內(nèi)試驗以評估裸鼠中的腫瘤形成，以研究HOTAIR和HOXA5在細胞凋亡和增殖中的作用。最后得出結(jié)論，發(fā)現(xiàn)HOTAIR在AML中上調(diào)；當HOTAIR沉默、HOXA5過表達時，AML細胞增殖減少，凋亡增加；HOTAIR被觀察到招募Dnmt3b和增加HOXA5啟動子甲基化；且在體內(nèi)沉默HOTAIR和上調(diào) HOXA5的表達均可誘導AML細胞凋亡，減少其增殖。綜上，HOTAIR在AML中過表達，而沉默HOTAIR可通過降低Dnmt3b抑制 HOXA5啟動子的甲基化，從而抑制AML細胞的增殖，誘導細胞凋亡。因此，下調(diào)HOTAIR是一個治療AML的潛在靶點。

5 ANRIL在AML發(fā)病中的作用機制

ANIRIL在多種癌癥[20]已被發(fā)現(xiàn)表達異常，近來發(fā)現(xiàn)其在AML患者中表達明顯增高，并調(diào)控其細胞存活。Sun等[21]發(fā)現(xiàn)，ANRIL在AML患者發(fā)病時升高，在完全緩解后下降。在功能上，ANRIL表達的降低導致糖攝取下降，抑制AML細胞在體內(nèi)外的維持；在機制上，ANRIL被發(fā)現(xiàn)可以抑制脂聯(lián)素受體(AdipoR1)的表達，這是葡萄糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。ANRIL和AdipoR1基因敲除均降低了AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)和沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的磷酸化表達水平，即存在一個ANRIL-AMPK/SIRT1信號通路，使ANRIL通過調(diào)節(jié)AdipoR1來觸發(fā)AML細胞的存活，沉默AdipoR1表達可促進細胞衰老、凋亡和抑制細胞增殖。與ANRIL的作用相似，表明ANRIL調(diào)控AML中的AdipoR1的表達。ANRIL的下調(diào)或過表達導致AdipoR1蛋白水平下調(diào)或上調(diào)，揭示了ANRIL與AdipoR1在AML中的相關(guān)性，ANRIL通過AdipoR1/AMPK/SIRT1的糖代謝途徑調(diào)控細胞存活。敲低ANRIL和AdipoR1導致細胞對葡萄糖的攝取下降。綜上，ANRIL的功能是通過在AML中調(diào)控葡萄糖代謝關(guān)鍵調(diào)控因子AdipoR1及其下游因子AMPK、SIRT1實現(xiàn)的，說明ANRIL可促進惡性細胞存活和細胞葡萄糖代謝，加速AML進展，它將為AML的治療提供新的思路。

6 SBF2-AS1在AML發(fā)病中的作用機制

SBF2-AS1是SBF2的一個2708nt的反義RNA，位于11p15.1位點[22]，與多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[23]。Tian等[24]發(fā)現(xiàn)，SBF2-AS1可能在AML進展中扮演一種致癌lncRNA的角色。他們通過GEPIA(基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析)數(shù)據(jù)庫測定了SBF2-AS1在AML中的表達，結(jié)果顯示與正常樣本比較SBF2-AS1在AML樣本中的表達顯著增加，且其高表達與AML患者總體生存率差呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。他們進一步用qRT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄定量PCR)測定SBF2-AS1在AML細胞中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與HS-5(人骨髓基質(zhì)細胞)細胞相比，AML系(THP-1(單核巨噬細胞)、U937(人組織細胞淋巴瘤細胞)和HL60)SBF2-AS1的表達顯著增加。下調(diào)SBF2-AS1在THP-1和HL60細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)SBF2-AS1的抑制顯著降低了AML細胞增殖。采用流式細胞術(shù)研究SBF2-AS1對AML細胞凋亡及細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)SBF2-AS1的抑制顯著增加了THP-1和HL60細胞的凋亡率，且減少SBF2-AS1的表達顯著抑制了G0/G1期的THP-1和HL60細胞的增殖。SBF2-AS1的靶點是miR-188-5p，SBF2-AS1的抑制顯著增加了AML細胞中miR-188-5p的表達，而miR-188-5p的直接靶點是ZFP91。研究發(fā)現(xiàn)，SBF2-AS1的抑制顯著降低了AML細胞中mRNA和蛋白水平上ZFP91的表達，而miR-188-5p的抑制劑可以消除這種抑制作用，即SBF2-AS1可以通過調(diào)控miR-188-5p的表達來激活ZFP91(鋅指蛋白91)。這說明AML中SBF2-AS1的升高降低了miR-188-5p的活性，增加了ZFP91的表達，最終促進了AML細胞的增殖。綜上，SBF2-AS1主要通過調(diào)控miR-188-5p/ZFP91信號通路促進AML的進展，下調(diào)SBF2-AS1的表達將會作為AML新的治療靶點。

7 LINC00662在AML發(fā)病中的作用機制

LINC00662位于染色體19q11和2085 bp，是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，參與調(diào)控口腔鱗狀細胞癌[25]、肺癌[26]、胃癌[27]等腫瘤細胞的生物學功能。Liu等[28]檢測了LINC00662在AML患者和正常對照組骨髓中的表達水平。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，AML患者骨髓組織中LINC00662表達明顯高于正常對照組，證明了LINC00662在AML組織和細胞系中均有高表達。轉(zhuǎn)染LINC00662shRNA后AML細胞中LINC00662的表達顯著減少。實驗數(shù)據(jù)顯示，LINC00662基因的下調(diào)顯著降低了AML細胞的增殖，且LINC00662的抑制抑制了AML細胞集落形成。此外，沉默LINC00662可顯著增加AML細胞凋亡?？傊@些結(jié)果表明，LINC00662的抑制對AML細胞生長具有抑制作用。miR-340-5p(一個腫瘤抑制miRNA)是LINC00662的靶miRNA，實驗結(jié)果顯示敲除LINC00662可上調(diào)miR-340-5p在AML細胞中的表達，而過表達LINC00662可下調(diào)miR-340-5p在AML細胞中的表達。總之，LINC00662與 miR-340-5p相互作用，調(diào)控其在AML細胞中的表達。生物信息學分析表明，ROCK1(RHO相關(guān)的含卷曲螺旋蛋白激酶1)是miR-340-5p的靶基因，通過熒光酶聯(lián)實驗證實miR-340-5p直接與ROCK1的3′-UTR結(jié)合，負調(diào)控AML細胞中ROCK1的表達，ROCK1 基因敲除顯著降低了AML細胞的增殖，而增加了AML細胞的凋亡。提示通過上調(diào)miR-340-5p下調(diào)ROCK1，抑制LINC00662的表達，從而抑制AML細胞的增殖。

綜上所述，lncRNA作為一種新的、早期的、較敏感的生物標記物，不僅可以用于早期篩查AML，而且可以通過修飾其不同的作用的靶點用于疾病的靶向性治療。CASC15、H19、HOTXB-AS3、HOTAIR、ANRIL、SBF2-AS1、LINC00662均可促進AML細胞的增殖，但作用機制復雜，要將其應(yīng)用于臨床研究還需要更多的學者對其的確切分子機制進行更加深入地研究。