動物疫病采樣技術(shù)規(guī)范

1 范圍

本規(guī)范規(guī)定了動物疫病檢驗的樣品采集、采樣前準(zhǔn)備、廢棄物處置、采樣記錄、運(yùn)送等技術(shù)。本規(guī)范適用于四川省行政區(qū)域內(nèi)動物疫病病原學(xué)、病理組織學(xué)、血清學(xué)、免疫學(xué)等實驗室檢驗所需樣品的采集。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T 16569-1996 畜禽產(chǎn)品消毒規(guī)范

GB/T 18635-2002 動物防疫基本術(shù)語

GB/T 18935-2003 口蹄疫診斷技術(shù)

NY/T 541-2002 動物疫病實驗室檢驗采樣方法

病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號）

《中華人民共和國動物防疫法》

《病原微生物實驗室生物安全管理條例》

《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》

《高致病性動物病原微生物菌（毒）種或者樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范》

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 樣品 取自動物或環(huán)境，擬通過檢驗反映動物個體、群體或環(huán)境有關(guān)狀況的材料或物品。

3.2 病料 來自患病或可疑患病動物的被（待）檢材料。

3.3 采集 通過一定的方法，按照特定的程序和要求，對樣品進(jìn)行收集、處理及整理的過程。

4 樣品采集原則

4.1 先排除后采樣 凡發(fā)現(xiàn)急性死亡的動物，懷疑患有炭疽時，不得解剖。應(yīng)先按NY/T 561-2015 中2.2 的規(guī)定采集血樣，進(jìn)行血液抹片鏡檢。確定不是炭疽后，方可解剖采樣。

4.2 采集數(shù)量 進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、抗體監(jiān)測、動物群體健康評估或環(huán)境衛(wèi)生檢測時，樣品數(shù)量應(yīng)滿足生物統(tǒng)計學(xué)的要求。

4.3 采樣時限 健康動物和瀕臨死亡動物根據(jù)樣品采集需求及時采樣；病死后的動物要立即采集樣品，夏季不超過6 h，冬季不超過24 h。

4.4 無菌操作 采集過程中應(yīng)該注意無菌操作，刀、剪、鑷子、器皿、注射器、針頭等采樣用具應(yīng)事先嚴(yán)格滅菌，每種樣品應(yīng)單獨(dú)采集。

4.5 盡量減少應(yīng)激和損害 活體動物采樣時，應(yīng)避免過度刺激或損害動物；也應(yīng)避免對采樣者的危害。

4.6 生物安全防護(hù) 采樣人員應(yīng)加強(qiáng)個人防護(hù)，嚴(yán)格遵守生物安全操作的相關(guān)規(guī)定，嚴(yán)防人獸共患病感染；同時應(yīng)做好環(huán)境消毒及動物或組織的無害化處理，避免污染環(huán)境，防止疫病傳播。

5 采樣前準(zhǔn)備

5.1 采樣人員 采樣人員應(yīng)熟悉動物防疫的有關(guān)法律法規(guī)，具有一定的專業(yè)技術(shù)知識，熟練掌握采樣工作程序和采樣操作技術(shù)。采樣前，應(yīng)做好個人安全防護(hù)（穿戴手套、口罩、一次性防護(hù)服、鞋套等，遇到高風(fēng)險傳染病時戴護(hù)目鏡或面罩），嚴(yán)格遵守生物安全操作的相關(guān)規(guī)定，避免對樣品、環(huán)境的污染和對采樣人員的傷害。

5.2 采樣工具和器皿

5.2.1 應(yīng)根據(jù)采集樣品種類和數(shù)量的需要，選擇不同的采樣工具、器械及容器等，并進(jìn)行適量包裝。

5.2.2 金屬器械可采用103 kPa 高壓30 min，或160 ℃干烤2 h 滅菌、煮沸消毒30 min。臨用時75%酒精拭擦，或用時進(jìn)行火焰消毒。

5.2.3 器皿（玻制、陶制等）經(jīng)高壓、干熱滅菌（同5.2.2），或經(jīng)0.5%～1%碳酸氫鈉水中煮沸10～15 min，再用無菌紗布擦干，無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

5.3 保存液 應(yīng)根據(jù)所采樣品的種類和要求，準(zhǔn)備不同類型并分裝成適量的保存液，如PBS 緩沖液、30%甘油磷酸鹽緩沖液、滅菌肉湯和運(yùn)輸培養(yǎng)基等。

5.4 采集樣品種類

5.4.1 根據(jù)不同的檢驗要求進(jìn)行樣品采集，采取包括相應(yīng)的組織器官、內(nèi)容物、分泌物、排泄物或其他材料。

5.4.2 結(jié)合流行病學(xué)特點、臨床癥狀和剖檢變化，根據(jù)疫病的特點和需采取的檢查方法，采集相關(guān)部位的病料?？谔阋弑O(jiān)測，可取水皰皮和水皰液檢查，屠宰后采取淋巴結(jié)、脊髓或肌肉等；結(jié)核病監(jiān)測可采取痰、乳、精液、子宮分泌物、尿和糞便等，死畜可采取淋巴結(jié)或其他組織；禽流感監(jiān)測，可取咽拭子或泄殖腔拭子和血清樣品。

5.4.3 無法估計病因時，可對組織器官、分泌物和排泄物進(jìn)行系統(tǒng)全面的采集。

6 樣品采集

6.1 血樣

6.1.1 采血部位 根據(jù)動物種類確定采血部位。牛、馬、羊常采用頸靜脈、尾靜脈；豬常采用耳靜脈、前腔靜脈、尾靜脈；毛皮動物小量采血穿刺耳尖或廓外靜脈，多量采血在頸靜脈采集，或用劃破趾墊0.5 cm 深度、剪斷尾尖部采血。嚙齒類動物尾尖采血，或眼窩血管叢采血。兔耳背靜脈、頸靜脈或心臟采血。禽類翅靜脈采血，或心臟采血，鴨采用跖內(nèi)側(cè)靜脈采血。

6.1.2 血液樣品的處理

6.1.2.1 全血 樣品容器中需加入0.1%肝素鈉或阿氏液或枸櫞酸鈉（3.8%～4%的枸櫞酸鈉0.1 mL，可抗1 mL 血液）或乙二胺四乙酸（EDTA，PCR 檢測血樣的首選抗凝劑）等抗凝劑，采血后充分混勻。

6.1.2.2 脫纖血 應(yīng)將血液置入裝有玻璃珠的容器內(nèi)，反復(fù)振蕩，待纖維蛋白凝固后，即可制成脫纖血樣品，經(jīng)密封后貼上標(biāo)簽，以冷藏狀態(tài)立即送實驗室。

6.1.2.3 血清 將血樣在室溫下傾斜30°靜止2～4 h，待血液凝固，有血清析出時，無菌剝離血凝塊，然后置4 ℃冰箱過夜，待大部分血清析出后，分離血清，必要時可低速離心（1 000 g，10～15 min）分離血清，若需長時間保存，則將血清置-20 ℃以下保存，但要盡量減少反復(fù)凍融。

6.1.2.4 血漿 應(yīng)在樣品容器內(nèi)先加入抗凝劑（見6.1.2.1），血液采集完后，將血液與抗凝劑充分混合，然后靜止，待紅細(xì)胞自然下沉或離心沉淀后，輕輕吸取上層血漿。

6.2 組織樣品

6.2.1 病原學(xué)檢測樣品 用常規(guī)解剖器械剝離動物的皮膚，體腔用消毒器械剝開，所需樣品按無菌操作方法采集。做病原分離用，如進(jìn)行細(xì)菌、病毒、原蟲等病原分離所用的組織塊的采集，均用新消毒的器械切取所需器官的組織塊，每個組織單獨(dú)放在已消毒處理的容器中，注明采樣動物、日期、組織名稱，防止相互污染。

6.2.2 組織病理學(xué)檢查樣品 采集包括病灶及臨近正常組織的組織塊，立即放入不低于10倍于組織塊的10%的中性福爾馬林溶液中固定，固定時間一般為16～24 h。組織厚度不超過0.5 cm，長寬不超過1.5 cm×1.5 cm大小（檢查狂犬病則需要較大組織塊）。組織塊切忌擠壓、刮摸和用水洗。如做冰凍切片，則將組織放在0～4 ℃容器中，送往實驗室檢驗。

6.2.3 皮膚樣品 有水泡或皮膚病變疾病的動物，應(yīng)直接從病變部位采集。病變皮膚的碎屑、未破裂水泡液、水泡皮作為樣品。

6.2.4 腸內(nèi)容物和糞樣 腸道只需選擇病變最明顯的部分，將其中的內(nèi)容物棄去，用生理鹽水輕輕沖洗；無菌截取腸道組織，置于滅菌容器或塑料袋中送檢。取腸道內(nèi)容物時，應(yīng)燒烙腸壁表面，用吸管扎穿腸壁，從腸腔中吸取內(nèi)容物，將腸內(nèi)容物放在盛有滅菌的30%甘油生理鹽水緩沖液中保存送檢?；?qū)в袃?nèi)容物的腸管兩端結(jié)扎，從兩端剪斷送檢。

取糞便時應(yīng)將消毒拭子插入動物肛門或泄殖腔中，旋轉(zhuǎn)2～3 圈刮取直腸粘液或糞便，放入裝有30%甘油磷酸鹽緩沖液或者半固體培養(yǎng)基中送檢，若檢查消化系統(tǒng)寄生蟲，則需采取適量新鮮糞便。

6.2.5 體液樣品

6.2.5.1 乳汁、精液及尿液 用消毒水清洗乳頭周邊及乳頭，并把乳房附近的毛刷濕，棄去3～4把奶液后進(jìn)行采集，采集的奶液裝于無菌試管中。精液樣品易用假陰道擠壓陰莖或人工刺激的方法采集。所采樣品應(yīng)包括“富精”部分，盛裝于無菌試管中，避免防腐劑污染。在動物排尿時，用潔凈的容器直接接取中段尿液，也可使用自封袋，固定在雌畜外陰部或雄畜的陰莖下接取尿液，采集尿液應(yīng)早晨進(jìn)行。

6.2.5.2 子宮陰道內(nèi)分泌物或外生殖器包皮內(nèi)分泌物的采集 將消毒好的特制吸管插入子宮頸口或陰道內(nèi)，向內(nèi)注射少量營養(yǎng)液或生理鹽水，用吸球反復(fù)抽吸幾次后吸出液體，注入培養(yǎng)液中。用軟膠管插入公畜的包皮內(nèi)，向內(nèi)注射少量的營養(yǎng)液或生理鹽水，多次揉搓，使液體充分沖洗包皮內(nèi)壁，收集沖洗液注入無菌容器中。

6.2.5.3 胃液及呼吸道分泌物 胃液可用多孔的胃管抽取，將胃管送入胃內(nèi)，其外端接在吸引器的負(fù)壓瓶上，加負(fù)壓后，胃液即可自動流出。反芻動物在反芻時，當(dāng)食團(tuán)從食道逆入口腔時，立即開口拉住舌頭，伸入口腔即可取出少量的瘤胃內(nèi)容物。呼吸道可用滅菌棉拭子采集鼻腔、咽喉或氣管內(nèi)的分泌物，然后將拭子浸入保存液中，密封低溫保存。常用的保存液有pH 7.2～pH 7.4 的滅菌肉湯或磷酸鹽緩沖液鹽水。如準(zhǔn)備將待檢樣本接種組織培養(yǎng)，則保存于含0.5%乳蛋白水解物的漢克氏液中，一般每只拭子需保存液5 mL。

6.2.5.4 腦、脊髓液 頸椎穿刺法：穿刺點為環(huán)樞孔，將動物實施站立或橫臥保定，使其頭部向前下方屈曲，術(shù)部經(jīng)剪毛消毒后，穿刺針與皮膚面呈垂直緩慢刺入，將針體刺入蛛網(wǎng)膜下腔，立即拔出針芯，腦脊液自動流出或點滴狀流出，盛入消毒容器中。大型動物頸部穿刺一次采集量為35～70 mL。

腰椎穿刺法：穿刺部位為腰薦孔，將動物站立保定，術(shù)部經(jīng)剪毛消毒后，用專用的穿刺針刺入，當(dāng)刺入蛛網(wǎng)膜下腔時，即有脊髓液滴狀滴出或用消毒注射器抽取，裝入消毒容器中。大型動物腰椎穿刺一次采集量為15～30 mL。

6.2.5.5 其他液體 采集膽汁、膿、黏液和關(guān)節(jié)液等樣品時，用燙烙法消毒采集部位，用滅菌吸管、毛細(xì)吸管或注射器經(jīng)燙烙部位插入，吸取內(nèi)部液體病料注入滅菌的試管中，塞好棉塞送檢。也可用接種環(huán)經(jīng)消毒后的部位插入，提取病料直接接種到培養(yǎng)基或涂布到玻片上。

6.2.6 胚胎及胎兒 選取無腐敗的胚胎、胎兒或胎兒的實質(zhì)器官，裝入適宜容器內(nèi)立即送檢。如果在24 h 內(nèi)不能將樣品送達(dá)實驗室，應(yīng)冷凍運(yùn)送。

6.2.7 腦、脊髓 將采集的腦、脊髓浸入30%甘油生理鹽水等保存液中送檢，或根據(jù)要求送檢。

6.3 其他

6.3.1 對于重大動物疫病如新城疫、口蹄疫、禽流感、豬瘟、高致病性藍(lán)耳病的樣品采集按照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

6.3.2 監(jiān)測環(huán)境衛(wèi)生或調(diào)查疾病，可從遺棄物、通風(fēng)管、下水道、孵化場或屠宰場采集有代表性的樣品。

7 樣品包裝及采樣現(xiàn)場廢棄物處理

7.1 樣品包裝

7.1.1 禽流感、口蹄疫、豬瘟、高致病性藍(lán)耳病、新城疫等重大動物疫病采樣按照《高致病性動物病原微生物菌（毒）種或者樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范》執(zhí)行。

7.1.2 每個組織樣品應(yīng)仔細(xì)分別包裝，在樣品袋或平皿外貼上標(biāo)簽，做好標(biāo)記，注明樣品名、樣品編號和采樣日期等，再將樣品分類包裝。

7.1.3 拭子樣品的小塑料離心管應(yīng)放在規(guī)定離心管塑料盒內(nèi)。

7.1.4 血清樣品裝于小瓶時應(yīng)用鋁盒或塑料盒盛放，盒內(nèi)加填塞物避免小瓶晃動。若裝于小塑料離心管中，則應(yīng)置于離心管塑料盒內(nèi)。

7.1.5 樣品外包裝須貼上封條，封條上應(yīng)有采樣人的簽章，并應(yīng)注明貼封日期、標(biāo)注放置方向。

7.2 采樣現(xiàn)場廢棄物處理

7.2.1 采樣使用過的器械，如一次性器械應(yīng)進(jìn)行生物安全無害化處理；可重復(fù)使用的器械應(yīng)先消毒后清洗再消毒后才能使用，檢查過疑似牛羊海綿狀腦病的器械要放在2 mol/L 的氫氧化鈉溶液中浸泡2 h以上，才可再次使用。

7.2.2 采樣產(chǎn)生的其他廢棄物、剩余組織和動物尸體處置應(yīng)按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行無害化處理。

8 樣品記錄

8.1 每份樣品均須貼上標(biāo)簽，并注明采樣時間、地點、名稱、送檢編號。

8.2 送往實驗室的樣品應(yīng)有一式二份的送檢單，一份隨樣品送實驗室，一份備案。樣品記錄內(nèi)容包括：動物場（戶）地址、飼養(yǎng)動物種類、品種、數(shù)量、年齡、發(fā)病日期及分布、臨床癥狀、治療用藥、飼料種類、產(chǎn)蛋產(chǎn)奶記錄、送檢清單及說明、進(jìn)行何種檢驗、畜主姓名、地址、電話、送檢人、地址及聯(lián)系、送檢日期等。

8.3 采集樣品時同時記錄首發(fā)病例和繼發(fā)病例日期及造成的損失、感染動物在畜群中的分布情況、動物場（戶）的存欄數(shù)、死亡動物數(shù)、出現(xiàn)臨床癥狀的動物數(shù)量及其日齡、動物的免疫和用藥情況等，隨樣品送達(dá)實驗室。

9 樣品保存

9.1 采集的樣品在無法于12 h內(nèi)送檢的情況下，根據(jù)不同的檢驗要求，應(yīng)將樣品按所需溫度分類保存于不同冰箱、冰柜中。

9.2 血清放-20 ℃凍存，全血暫時放4 ℃冰箱保存。

9.3 供細(xì)菌檢驗的樣品應(yīng)4 ℃保存，或可用滅菌后的30%～50%的甘油生理鹽水保存。

9.4 供病毒檢驗的樣品應(yīng)在0 ℃以下低溫保存，也可以用滅菌后的30%～50%滅菌甘油生理鹽水0 ℃以下低溫保存。

9.5 采集的樣品應(yīng)立即送檢，無法達(dá)到檢測要求的樣品作無害化處理，按照GB 16548、《病原微生物實驗室生物安全管理條例》和《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》執(zhí)行。

10 樣品運(yùn)送

10.1 所采集的樣品以最快最直接的方式送往實驗室。如果樣品能在24 h 內(nèi)送達(dá)，則可存放于4 ℃左右的保溫容器中運(yùn)送，容器內(nèi)加墊緩沖材料防止破裂。保溫容器應(yīng)密封，防止?jié)B漏，保溫容器外貼上封條。封條有貼封人（單位）簽字（蓋章），并注明帖封日期。

10.2 制成的涂片、觸片、玻片上注明編號，并另附說明。玻片應(yīng)放入專門的病理切片盒內(nèi)，在保證不被壓碎的條件下運(yùn)送。

10.3 航空運(yùn)輸?shù)臉悠穮⒄障嚓P(guān)航空管理條例執(zhí)行。