LED單色光對(duì)兔行為及同期發(fā)情影響的機(jī)理研究

潘孝青，王杏龍，楊 杰，邵 樂(lè)，秦 楓，李 健，張 霞，翟 頻

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，江蘇 南京 210014)

隨著規(guī)?；B(yǎng)兔業(yè)的興起，兔舍小氣候的控制愈加顯得重要。光照是影響家畜生長(zhǎng)、繁殖的主要環(huán)境因素之一，合理的光照對(duì)提高家兔生產(chǎn)力、控制母兔同期發(fā)情具有重要作用。不同光周期時(shí)，光信號(hào)首先作用于哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜上的光受體細(xì)胞，誘導(dǎo)黑視蛋白(melanopsin)及其編碼基因Opn4表達(dá)量增加，導(dǎo)致視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cells，ipRGCs)興奮，并由ipRGCs軸突構(gòu)成的視網(wǎng)膜下丘腦束(retinohypothalamic tract，RHT)傳導(dǎo)到哺乳動(dòng)物視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)[1-3]，調(diào)節(jié)松果體褪黑激素(melatonin，MLT)分泌。光信號(hào)通過(guò)MLT轉(zhuǎn)化為動(dòng)物體內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，從而調(diào)控動(dòng)物的多種生理功能[4]。MT主要通過(guò)結(jié)合其G蛋白偶聯(lián)膜受體MLT1(Mel1a)、MLT2(Mel1b)實(shí)現(xiàn)其功能[5-6]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，人類的情緒會(huì)受到光色的強(qiáng)烈影響[7-8]。Bourgin等[9]研究指出，光色對(duì)哺乳動(dòng)物行為的影響重要且復(fù)雜。母兔周期化繁殖效率顯著影響兔場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益。短日照季節(jié)母兔乏情現(xiàn)象明顯，群體同期發(fā)情率變異大，目前只能依靠外源性激素實(shí)現(xiàn)群體同期發(fā)情。本研究通過(guò)不同LED光色對(duì)兔選擇性停留行為及其體內(nèi)激素變化角度開(kāi)展研究，探討光色調(diào)控母兔發(fā)情的分子機(jī)制，旨在為提高家畜繁殖生產(chǎn)中光需求與利用的針對(duì)性提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)提供的5月齡新西蘭后備母兔，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(蘇)2017-0008。

1.2 行為學(xué)觀察試驗(yàn)

選用40只體質(zhì)量相近的母兔進(jìn)行行為學(xué)觀察試驗(yàn)，試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地人工光照控制室內(nèi)進(jìn)行。人工光照控制室內(nèi)正方形漏縫木地板平臺(tái)(6 m×6 m)上，四周用敞門兔籠合圍，呈回字形，每邊6個(gè)兔籠，籠內(nèi)均勻放置常規(guī)乳頭式飲水器及料槽，母兔可自由出入平臺(tái)上任一兔籠。兔籠上方60 cm處安裝LED燈帶，向下投射紅光(660 nm)、綠光(540 nm)、藍(lán)光(480 nm)和白光(400～760 nm)，采用動(dòng)態(tài)光照控制系統(tǒng)(軟著登字第1551136號(hào))，將不同顏色LED燈帶的光照強(qiáng)度與光照時(shí)間均設(shè)置為100 lx，光照制度為12 D∶12 L。每周隨機(jī)調(diào)整1次LED燈帶位置，避免固定位置的光色可能成為條件反射的因素，并排除溫度、聲音、氣味刺激等干擾。動(dòng)態(tài)光照控制系統(tǒng)在光照試驗(yàn)開(kāi)始后0.5 h及燈光關(guān)閉前0.5 h通過(guò)控制系統(tǒng)逐步調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，避免突然開(kāi)關(guān)燈導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。人工光照控制室內(nèi)溫度控制在24 ℃，并通過(guò)機(jī)械通風(fēng)方式，保證空氣質(zhì)量。平臺(tái)正上方選用夜視功能廣角高清攝像頭記錄并統(tǒng)計(jì)母兔選擇性停留行為。預(yù)試驗(yàn)期7 d，試驗(yàn)期100 d。

1.3 光色試驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)分組

選擇體質(zhì)量接近的300只純種新西蘭后備母兔，隨機(jī)分成5組(白熾燈對(duì)照組、白光組、紅光組、綠光組、藍(lán)光組)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。在秋季日照時(shí)長(zhǎng)變短后開(kāi)始試驗(yàn)，每周進(jìn)行3次補(bǔ)光，觀察不同光色對(duì)母兔同期發(fā)情的影響。預(yù)試驗(yàn)期7 d，試驗(yàn)期100 d。試驗(yàn)期間，室內(nèi)溫度控制在24 ℃，并通過(guò)機(jī)械通風(fēng)方式，保證空氣質(zhì)量，排除溫度、聲音、氣味刺激等干擾。

1.3.2 光照方案

每個(gè)處理組均采用雙層遮陽(yáng)窗簾進(jìn)行分隔，單獨(dú)隔間。母兔采取不銹鋼單籠飼養(yǎng)，兔籠規(guī)格為60 cm×60 cm×60 cm。兔籠上方60 cm處分別安裝LED燈帶，向下投射紅光(660 nm，R)、綠光(540 nm，G)、藍(lán)光(480 nm，B)和白光(400～760 nm，W)；對(duì)照組選用白熾燈(400～1 050 nm，C)照明，燈泡每隔2 m安裝1個(gè)，安裝高度為兔籠上方2.5 m處(通過(guò)testo-540照度儀監(jiān)測(cè)，此高度下光照強(qiáng)度與LED燈帶下的光照強(qiáng)度一致)。正式試驗(yàn)中，每周五至周日18:00至次日06:00，光照周期為12 D∶12 L，其他時(shí)間打開(kāi)遮陽(yáng)窗簾，不進(jìn)行任何補(bǔ)光處理，每組內(nèi)光線隨自然環(huán)境改變同步變化并保持一致。LED燈帶與白熾燈對(duì)照組采用動(dòng)態(tài)光照控制系統(tǒng)(軟著登字第1551136號(hào))控制，光照強(qiáng)度為100 lx。光照試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，每周通過(guò)照度儀監(jiān)測(cè)光照強(qiáng)度，保證各組間光照強(qiáng)度一致。開(kāi)始后0.5 h及燈光關(guān)閉前0.5 h，通過(guò)控制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)光強(qiáng)度0～100 lx和100～0 lx過(guò)渡期，以避免突然開(kāi)關(guān)燈產(chǎn)生應(yīng)激。

1.3.3 樣本采集

正式試驗(yàn)期內(nèi)，每個(gè)處理共分6次，每組分別選擇5只發(fā)情母兔，于14、28、42、56、78、90 d的23:30至次日00:30進(jìn)行耳緣靜脈采血，進(jìn)行MLT濃度及血清類激素測(cè)定。在LED光處理后的第91天早晨，在每組試驗(yàn)兔中選擇體質(zhì)量接近、處于同一生理階段(處于發(fā)情中后期，外陰顏色為深紅或紫紅)母兔各5只進(jìn)行屠宰。屠宰時(shí)每只母兔右側(cè)卵巢取出，放入4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 7.4)中固定48 h后制成常規(guī)石蠟切片進(jìn)行觀察。同時(shí)迅速取下每組母兔視網(wǎng)膜、SCN、松果體、下丘腦、垂體、卵巢分別進(jìn)行液氮保存，以待后期試驗(yàn)。試驗(yàn)兔屠宰操作在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)的規(guī)定下執(zhí)行。

1.3.4 飼養(yǎng)管理與營(yíng)養(yǎng)水平

試驗(yàn)期內(nèi)母兔均為自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理按常規(guī)進(jìn)行。水、飼料、飼養(yǎng)人員、飼養(yǎng)管理各組均一致。按照NRC兔營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼料配置并制成全價(jià)顆粒飼料，飼料配方見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

預(yù)混料為每1 kg飼糧提供VA 300 000 IU， VD3200 000 IU， VE 4 000 mg， VK350 mg， VB1400 mg， VB2500 mg， VB6200 mg， VB124.2 mg，葉酸 50 mg，泛酸 2 200 mg，生物素 1 600 mg， 氯化膽堿 120 mg， VC 12 000 mg， Fe 4 000 mg， Zn 3 200 mg，Mn 1 600 mg， I 80 mg， Se 12 mg， Cu 500 mg。粗蛋白質(zhì)、粗纖維、消化能均為測(cè)定值。

The premix provided the following component per kg of diets: VA 300 000 IU， VD3200 000 IU， VE 4 000 mg， VK350 mg， VB1400 mg， VB2500 mg， VB6200 mg， VB124.2 mg ，folic acid 50 mg， pantothenic acid 2 200 mg， biotin 1 600 mg， choline chloride 120 mg， VC 12 000 mg， Fe 4 000 mg， Zn 3 200 mg， Mn 1 600 mg， I 80 mg， Se 12 mg， Cu 500 mg. Crude protein， crude fiber and DE were measured values.

1.3.5 基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

使用Trizol法提取樣品組織總RNA，并用瓊脂糖電泳檢測(cè)。將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取0.2 mL PCR管，加入含2 μg RNA的溶液，加入1 μL oligo (dT) 18，用去離子水補(bǔ)足至12 μL，于PCR儀上70 ℃保溫5 min后迅速置于冰上冷卻。依次加入4 μL 5×buffer、2 μL 10 mmol·L-1dNTPs、1 μL RNA抑制劑和1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，混勻后于PCR儀上42 ℃保溫60 min，結(jié)束后80 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

用于基因表達(dá)檢測(cè)的引物及其序列見(jiàn)表2。取0.2 mL PCR管，配制如下反應(yīng)體系(每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管)：12.5 μL 2×qPCR Mix、2 μL 7.5μmol·L-1基因引物、2.5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、8.0 μL ddH2O。將cDNA原液稀釋20倍，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因的mRNA表達(dá)。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR?Green Real-time PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，補(bǔ)足ddH2O至10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火22 s，72 ℃延伸20 s，共24個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)1次，每板做1個(gè)用ddH2O和不加cDNA陰性模版的擴(kuò)增，以檢測(cè)水和試劑是否被污染。

1.4 血清類激素及MLT測(cè)定

血清類激素β-內(nèi)啡肽(β-endorphin，β-EP)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、乙酰膽堿(acetyl choline，ACH)、皮質(zhì)醇(cortisol)及MLT濃度均按照試劑盒(南京建成)規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

選擇性停留率：統(tǒng)計(jì)母兔選擇性停留在不同光色下的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)時(shí)間段為光照周期的亮燈時(shí)間段，暗燈時(shí)段不參與統(tǒng)計(jì)?？偣步y(tǒng)計(jì)30次，每次統(tǒng)計(jì)時(shí)間為24 h，期間采用監(jiān)控方式，每隔10 min觀察記錄1次母兔停留在不同光色下的數(shù)量。同期發(fā)情率統(tǒng)計(jì)：在LED光處理后的第14、28、42、56、78、90天上午，采用外陰檢查法對(duì)母兔進(jìn)行同期發(fā)情效果鑒定，當(dāng)外陰出現(xiàn)大紅或深紅色則統(tǒng)計(jì)為發(fā)情，登記并統(tǒng)計(jì)發(fā)情母兔占該組試驗(yàn)兔的比率即為同期發(fā)情率。選擇性停留率和同期發(fā)情率均采用SPSS 18.0軟件One-Way ANOVA法進(jìn)行方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析用2-ΔΔCt法進(jìn)行，將目的基因的Ct值用內(nèi)參基因mRNA的Ct值進(jìn)行校對(duì)，計(jì)算目的基因的相對(duì)量。計(jì)算公式如下：

表2 基因表達(dá)檢測(cè)用引物信息

ΔΔCt=(CtTarget-CtTBP)X-(CtTarget-CtTBP)control。

(1)

式(1)中：以對(duì)照組的目的基因CtTarge和內(nèi)標(biāo)基因CtTBP差值的平均值為參照進(jìn)行計(jì)算；X表示任意1個(gè)樣本。通過(guò)式(1)計(jì)算出每1個(gè)樣本目標(biāo)基因的表達(dá)，通過(guò)內(nèi)標(biāo)基因校正后相對(duì)于目的基因表達(dá)的倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同LED光色對(duì)母兔選擇性停留行為的影響

通過(guò)連續(xù)攝像的方式，獲得不同LED光色環(huán)境下母兔對(duì)活動(dòng)空間選擇性停留的觀察數(shù)據(jù)。LED紅光組、LED綠光組、LED藍(lán)光組和LED白光組選擇性停留率分別為(15.70±1.41)%、(2.60±1.34)%、(4.10±0.56)%、(8.90±1.19)%。不同LED光色能夠影響母兔活動(dòng)空間的選擇，LED紅光環(huán)境更易被母兔接受并停留，其停留頻率分別比LED綠光、LED藍(lán)光高13.1%和11.6%，差異顯著(P<0.05)；與LED白光組相比，LED紅光環(huán)境中母兔的選擇性停留率高6.8%，差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同LED光色對(duì)后備母兔血清類激素含量的影響

如表3所示，LED紅色光及白熾燈組后備母兔血清中的β-內(nèi)啡肽、5-羥色胺濃度顯著(P<0.05)高于LED綠光組和LED藍(lán)光組，但與LED白光組差異不顯著(P>0.05)；血清乙酰膽堿在各處理間差異不顯著；LED紅光環(huán)境中皮質(zhì)醇濃度顯著(P<0.05)高于LED綠光組。

表3 不同LED光色環(huán)境下后備母兔血清類激素差異(n=30)

2.3 不同LED光色對(duì)母兔同期發(fā)情的影響

母兔同期發(fā)情率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，LED紅光組、LED綠光組、LED藍(lán)光組、LED白光組和白熾燈對(duì)照組同期發(fā)情率分別為(85.64±6.59)%、(80.98±8.34)%、(78.31±7.23)%、(75.13±9.66)%、(64.75±5.33)%，LED紅光組母兔同期發(fā)情率顯著(P<0.05)高于白熾燈對(duì)照組和LED白光組，其他處理差異不顯著。

2.4 不同LED光色對(duì)母兔視網(wǎng)膜黑視蛋白編碼基因Opn4 mRNA表達(dá)的影響

如圖1所示，母兔視網(wǎng)膜內(nèi)Opn4基因的轉(zhuǎn)錄受到LED不同光色的影響，LED紅光組母兔視網(wǎng)膜內(nèi)Opn4基因表達(dá)量顯著(P<0.05)高于白熾燈組和LED綠光組，但與LED白光組及藍(lán)光組相比差異不顯著。

不同柱上無(wú)相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同。Bars marked without the same letters indicated significant difference within treatment at P<0.05. The same as below.圖1 不同LED光色對(duì)母兔視網(wǎng)膜黑視蛋白Opn4 mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effect of different light colors of LED on expression of Opn4 mRNA in retina of female rabbit

2.5 不同LED光色對(duì)母兔MLT分泌及其合成限速酶Aanat mRNA表達(dá)的影響

如圖2所示，不同LED光色對(duì)特定時(shí)間段(23:30至00:30)母兔血清MLT含量有影響。與LED綠光組相比，LED紅光組母兔血清MLT含量顯著(P<0.05)降低，與其他處理差異不顯著。如圖3所示，松果體內(nèi)MLT合成限速酶AanatmRNA的表達(dá)受到LED不同光色的影響。與LED白光相比，LED紅光能顯著(P<0.05)抑制松果體內(nèi)AanatmRNA表達(dá)。

圖2 不同LED光色對(duì)母兔血清MLT含量的影響Fig.2 Effect of different light colors of LED on serum MLT content of female rabbits

圖3 不同LED光色對(duì)母兔松果體MLT合成限速酶Aanat mRNA表達(dá)影響Fig.3 Effect of different light colors of LED on expression of Aanat mRNA in female pineal gland

2.6 母兔MLT受體mRNA表達(dá)譜

如圖4所示，母兔MLT受體Mel1amRNA在母兔視網(wǎng)膜、SCN、松果體、下丘腦、垂體、卵巢均有表達(dá)，并且與其他組織相比，在松果體中的表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)；MLT受體Mel1bmRNA在母兔視網(wǎng)膜、SCN、松果體、下丘腦、垂體、卵巢表達(dá)。

*和**分別表示顯著性差異P<0.05和P<0.01。*， ** indicated significant differences at P<0.05 and P<0.01， respectively.圖4 MLT受體mRNA表達(dá)譜分析Fig.4 Analysis of MLT recepto mRNA expression profile

2.7 不同LED光色對(duì)Mel1a/b mRNA表達(dá)的影響

檢測(cè)MLT受體Mel1a/bmRNA在視網(wǎng)膜、SCN、松果體、HPG軸中的表達(dá)譜之后，選擇母兔視網(wǎng)膜、SCN、松果體、下丘腦部位，觀察不同LED光色對(duì)上述部位MLT受體Mel1a/bmRNA表達(dá)的影響。如圖5所示，LED紅光組母兔松果體中Mel1amRNA表達(dá)量顯著(P<0.05)高于LED綠光組和藍(lán)光組，但與白熾燈組和LED白光組相比差異不顯著；不同光色對(duì)Mel1a基因在母兔視網(wǎng)膜、SCN、下丘腦部位的表達(dá)影響差異不顯著；不同光色下Mel1b基因在母兔視網(wǎng)膜、SCN、松果體、下丘腦部位的表達(dá)差異不顯著。

圖5 LED不同光色對(duì)母兔視網(wǎng)膜、SCN、松果體、下丘腦部位MLT受體Mel1a/b mRNA表達(dá)影響Fig.5 Effect of different light colors on expression of MLT receptor Mel1a/b mRNA in retina， SCN， pineal gland and hypothalamus of female rabbits

3 討論

3.1 不同LED光色對(duì)母兔行為的影響

不同光環(huán)境能引起哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律、激素和行為的變化，如生物鐘調(diào)整、抑制褪黑激素分泌、視網(wǎng)膜及瞳孔變化和生理參數(shù)的改變等[10]。這一系列光照的影響被稱為非視覺(jué)生物效應(yīng)，主要由被稱為感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(ipRGCs)來(lái)調(diào)節(jié)。這類感光細(xì)胞不同于傳統(tǒng)的視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞，在未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(ipRGCs)之前，不同學(xué)者對(duì)于兔在不同顏色環(huán)境中的行為差異有不同的研究結(jié)論，研究觀點(diǎn)普遍認(rèn)為哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中的視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞數(shù)量差異是引起哺乳動(dòng)物顏色視覺(jué)行為差異的主要因素。唐建榮等[11]對(duì)11只家兔進(jìn)行色覺(jué)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)限制方位、光強(qiáng)等條件刺激因素，并排除聲音、氣味等干擾，結(jié)果顯示，家兔具有紅綠色覺(jué)分辨條件反射。與其他哺乳動(dòng)物不同，兔具有夜行性行為特征，因此不能以其他哺乳動(dòng)物的視覺(jué)特點(diǎn)對(duì)家兔進(jìn)行顏色視覺(jué)的判定，而是需要根據(jù)對(duì)家兔行為特點(diǎn)進(jìn)行研究。本研究結(jié)果表明，不同LED光色顯著影響母兔活動(dòng)空間的選擇，LED紅光環(huán)境更易被母兔接受并停留。此外，考慮到光照的非視覺(jué)生物效應(yīng)取決于不止一種感光細(xì)胞，還取決于不同顏色LED光所攜帶的能量，光波長(zhǎng)越短，光子能量越大。白熾燈波長(zhǎng)為400～1 050 nm，LED紅光波長(zhǎng)為660 nm，推測(cè)對(duì)于兔這種夜行性敏感動(dòng)物而言，與LED紅光組相比，其他組較高能量的LED光可能會(huì)引起兔的應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致其選擇性停留行為向光子能量較低的LED紅光區(qū)域靠近，以緩解由于光色不同造成的警覺(jué)程度。

3.2 不同LED光色對(duì)母兔血清類激素的影響

Bourgin等[12]研究認(rèn)為，光對(duì)哺乳動(dòng)物生理和行為的影響取決于波長(zhǎng)、輻照度、持續(xù)時(shí)間和光照時(shí)間。特定顏色的光環(huán)境對(duì)人類和其他動(dòng)物的生理和新陳代謝具有影響。如在人體實(shí)驗(yàn)中，早上和晚上藍(lán)光暴露均會(huì)嚴(yán)重改變健康成年人的葡萄糖代謝，而這些觀察結(jié)果可能是由交感神經(jīng)活性的增加和/或血漿褪黑激素的變化介導(dǎo)的[13]。此外，Opperhuizen等[14]在大鼠上研究表明，夜間急性暴露于綠光環(huán)境下能夠誘發(fā)大鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)下降，除了營(yíng)養(yǎng)信號(hào)外，光的顏色在機(jī)體外周代謝的調(diào)節(jié)中起著重要作用。而關(guān)于不同LED光色對(duì)血清類激素分泌的影響主要圍繞人的研究展開(kāi)，F(xiàn)igueiro等[15]研究發(fā)現(xiàn)，生理系統(tǒng)對(duì)短波長(zhǎng)光(藍(lán)色)最為敏感；相比于含短波長(zhǎng)光比較少的光源(黃白色光)，在白天暴露于合適劑量的強(qiáng)短波長(zhǎng)光下(青白色光)能更積極地、客觀地影響阿爾茨海默病癡呆患者的睡眠和行為。此外，Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，LED光能通過(guò)抑制人體褪黑素分泌刺激腎上腺分泌皮質(zhì)醇進(jìn)而改變生理節(jié)律，調(diào)節(jié)人體警覺(jué)度和生物鐘。

本研究結(jié)果表明，不同LED光色環(huán)境對(duì)母兔血清類激素濃度影響差異顯著，在LED紅色光及白熾燈環(huán)境中，母兔血清中的β-EP、5-HT濃度顯著高于LED綠光組及LED藍(lán)光組。β-EP致欣快與滿足感，可以調(diào)節(jié)焦慮情緒的發(fā)生。5-HT能改善睡眠，減少急躁情緒，增強(qiáng)免疫機(jī)能，紅光環(huán)境減少了母兔的警覺(jué)程度，更易讓母兔接受并停留。皮質(zhì)醇在操縱情緒等方面具有重要作用，母兔在LED紅色光環(huán)境中血清皮質(zhì)醇濃度顯著高于LED綠光組及LED藍(lán)光組。紅色環(huán)境氛圍下，母兔表現(xiàn)出顯著愉悅感，并且在處理一段時(shí)間后，由于發(fā)情促動(dòng)，母兔體內(nèi)皮質(zhì)醇含量顯著提高，表現(xiàn)出躁動(dòng)不安的情況。

3.3 不同LED光色對(duì)母兔同期發(fā)情影響

已有關(guān)于光色對(duì)兔繁殖性能的影響的研究相對(duì)較少。宋亞鵬[17]研究發(fā)現(xiàn)，白色LED燈對(duì)提高母兔繁殖性能的效果要優(yōu)于白熾燈，說(shuō)明LED光源控制母兔同期發(fā)情技術(shù)可應(yīng)用于商品肉兔繁殖生產(chǎn)中。李士棟[18]采用不同補(bǔ)光方式對(duì)哺乳期母兔的生產(chǎn)性能進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在夏季使用LED燈后，母兔受胎率和產(chǎn)仔率比使用節(jié)能燈的母兔高5%。崔雙保等[19]研究發(fā)現(xiàn)，LED光源顯著提高了母兔同期發(fā)情率、受胎率、產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、出生窩質(zhì)量和斷奶窩質(zhì)量。Kalaba等[20]研究發(fā)現(xiàn)，紅光可增加母兔繁殖性能及仔兔存活率。本試驗(yàn)中，LED紅光組母兔同期發(fā)情率顯著高于白熾燈組和LED白光組，說(shuō)明LED光可用在規(guī)模兔場(chǎng)周期化繁殖生產(chǎn)模式中，并且能夠提高母兔的繁殖性能。

3.4 不同LED光色對(duì)母兔視網(wǎng)膜黑視蛋白Opn4 mRNA表達(dá)的影響

在光周期影響哺乳動(dòng)物繁殖行為的研究中，前期研究主要圍繞視錐和視桿細(xì)胞2個(gè)方向，但是近年來(lái)對(duì)視錐和視桿細(xì)胞缺失的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，還存在光信號(hào)的黑視蛋白調(diào)節(jié)途徑。黑視蛋白是一種視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)的感光視蛋白，其由Opn4基因編碼，被認(rèn)為是視錐和視桿細(xì)胞之后的哺乳動(dòng)物第3種光感受性細(xì)胞[21]。環(huán)境中的不同光信息在視網(wǎng)膜經(jīng)節(jié)細(xì)胞中黑視蛋白的作用下，通過(guò)視網(wǎng)膜-下丘腦束視神經(jīng)傳遞到SCN，進(jìn)而影響松果體調(diào)控褪黑激素的分泌，而褪黑激素再參與調(diào)節(jié)腺垂體促性腺激素的分泌最終發(fā)揮對(duì)動(dòng)物繁殖行為的調(diào)節(jié)。本試驗(yàn)中，與白熾燈對(duì)照組和LED綠光組相比，LED紅光顯著增加兔視網(wǎng)膜內(nèi)Opn4基因的表達(dá)，與靳二輝等[22]在雞視網(wǎng)膜上Opn4-2 mRNA表達(dá)模式一致。

3.5 不同LED光色對(duì)MLT分泌及MLT合成限速酶Aanat mRNA表達(dá)的影響

松果體褪黑激素分泌屬于晝夜波峰波谷連續(xù)分泌。孟繁臣[23]研究發(fā)現(xiàn)，不同光色對(duì)母兔在授精之前血清中褪黑激素水平有顯著影響，紅光和綠光能顯著降低母兔血清褪黑激素水平。Kalaba等[24]研究發(fā)現(xiàn)，紅色燈光能降低母兔血液中褪黑激素水平，提高FSH和雌二醇水平，且母兔的分娩率及產(chǎn)仔情況都有所提高。Jin等[25]研究了松果體和視網(wǎng)膜中不同單色光對(duì)雞血漿褪黑激素水平和AanatmRNA表達(dá)的影響，其研究結(jié)果顯示，與綠光和紅光相比，白光和藍(lán)光表現(xiàn)出對(duì)MLT分泌的微弱抑制，其抑制作用的大小為綠光<紅光<白光<藍(lán)光，綠光的松果體和視網(wǎng)膜中AanatmRNA的表達(dá)與血漿MLT水平的變化一致。本研究中，紅光能夠降低母兔血清褪黑激素水平，且AanatmRNA表達(dá)也受到LED不同光色的影響，LED紅光能顯著抑制松果體內(nèi)AanatmRNA表達(dá)，這一結(jié)果與Jin等[25]在禽類上的研究結(jié)論不一致，分析這一差異的原因可能是哺乳動(dòng)物只有眼球這1個(gè)光輸入來(lái)源來(lái)調(diào)控從感知到神經(jīng)內(nèi)分泌再到相關(guān)基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而禽類擁有多個(gè)光信號(hào)輸入路徑，這種生理上的差異可能是導(dǎo)致機(jī)體感受不同光色后的下游基因響應(yīng)差異不同的原因。

3.6 母兔MLT受體Mel1a/b表達(dá)譜及不同LED光色對(duì)Mel1a/b mRNA表達(dá)的影響

褪黑激素受體在很多動(dòng)物中樞系統(tǒng)和外周組織中都有分布[26]，表明褪黑激素受體對(duì)于機(jī)體生理功能的調(diào)節(jié)從神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)到外周組織均起作用[27]。在人類上，褪黑激素受體在SCN、視上核、室旁核、海馬、大、小腦皮質(zhì)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)中樞以外的系統(tǒng)如心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)中均有表達(dá)[28]；在禽類中，褪黑激素更是直接調(diào)節(jié)禽類的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，特別是在季節(jié)性繁殖的禽類，在不同靶細(xì)胞類型中，尤其是卵泡膜表面和顆粒細(xì)胞表層，褪黑激素通過(guò)激活受體信號(hào)通路參與禽類卵巢功能[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，母兔褪黑激素受體Mel1a mRNA在母兔視網(wǎng)膜、SCN、松果體、下丘腦、垂體、卵巢均有表達(dá)，并且在松果體中表達(dá)量顯著增加；MLT受體Mel1b mRNA在母兔視網(wǎng)膜、SCN、松果體、下丘腦、垂體、卵巢表達(dá)；LED紅光組母兔松果體中Mel1a mRNA表達(dá)量顯著高于LED綠光組和藍(lán)光組，但與白熾燈組和LED白光組相比差異不顯著。這一表達(dá)譜分析結(jié)果與上述褪黑激素受體在不同物種體內(nèi)神經(jīng)中樞及生殖系統(tǒng)上的表達(dá)模式基本一致，表明褪黑激素受體直接參與了母兔繁殖調(diào)控進(jìn)程。

4 結(jié)論

規(guī)模兔場(chǎng)短日照季節(jié)周期化繁殖生產(chǎn)中，每周連續(xù)三次，每次晚間18:00至凌晨6:00之間，采用100 lx強(qiáng)度的LED紅光進(jìn)行補(bǔ)光，可提高母兔同期發(fā)情率；LED紅光能夠通過(guò)Opn4-MLT通路對(duì)兔行為及同期發(fā)情產(chǎn)生影響。