瞿麥毛狀根的高效誘導(dǎo)及培養(yǎng)

郝愛平， 薛巨坤， 吳啟康， 任如意， 魏繼承， 國(guó)會(huì)艷

(牡丹江師范學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157011)

早在20世紀(jì)80年代就有科研工作者研究植物毛狀根的應(yīng)用，但到目前為止研究最多的還是藥用植物，藥用植物毛狀根分泌的次生代謝產(chǎn)物可作為治療某些疾病藥物的有效成分之一。如單萜吲哚生物堿文多靈和長(zhǎng)春堿僅在藥用植物長(zhǎng)春花﹝Catharanthusroseus(L.)G. Don〕中合成，是醫(yī)學(xué)上生產(chǎn)抗癌藥物長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿的2種重要前體。SUN等[1]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使長(zhǎng)春花毛狀根中含有文多靈，還在毛狀根中檢測(cè)出2種新的代謝物環(huán)氧T16H和洛可辛堿。QI等[2]在丹參毛狀根中用含有0.5%的Triton X-100的蛋白提取緩沖液成功分離出相對(duì)較多的CYP76AH1蛋白，為深入分析丹參酮代謝途徑提供了依據(jù)。研究表明，毛狀根誘導(dǎo)技術(shù)還可以有效提高番茄(Solanumlycopersicum)中番茄紅素的含量[3]。齊墩果酸是治療肝病的輔助藥的有效成分之一[4]。而萬壽菊(TageteserectaL)經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌15834菌株處理后可以獲得毛狀根，毛狀根經(jīng)茉莉酸處理后其合成齊墩果酸的能力增加了10倍。ALI等[5-7]研究表明，植物毛狀根在大規(guī)模積累次級(jí)代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)代謝途徑和抗菌藥的研究開發(fā)等方面具有重要意義。

瞿麥(DianthussuperbusL.)又名野麥、石桂花等，系常用中藥，為石竹科植物瞿麥的帶花地上部分，主產(chǎn)于河北、河南、遼寧等地[8]。瞿麥除具有觀賞價(jià)值外，還含有5-羥基-7，3′，4′-三甲氧基二氫黃酮、5，3′-二羥基-7，4′-二甲氧基二氫黃酮、Β-菠甾醇、胖大海A等成分[9]，因此瞿麥在臨床上對(duì)治療糖尿病性水腫、慢性前列腺炎、各種出血及腹瀉等疾病有獨(dú)特效果[10]。瞿麥還含有大黃素、積雪草酸等多種活性成分，對(duì)乳腺癌、腎癌等細(xì)胞具有顯著抑制作用[11-14]。由于藥用植物本身的次生代謝產(chǎn)物存在產(chǎn)量低和不穩(wěn)定等特點(diǎn)，而毛狀根培養(yǎng)具有生產(chǎn)周期短，次生代謝成分合成能力強(qiáng)，能合成新化合物等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于藥用植物應(yīng)用研究[15]。目前，鮮見關(guān)于瞿麥的毛狀根研究的報(bào)道。為此，選用2種常用的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株和R1601菌株侵染藥用植物瞿麥的葉片，探究影響毛狀根誘導(dǎo)的因素，優(yōu)化誘導(dǎo)毛狀根培養(yǎng)條件，提高瞿麥毛狀根的誘導(dǎo)率，以期為瞿麥毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)，并為大規(guī)模開發(fā)利用瞿麥次級(jí)代謝產(chǎn)物提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

瞿麥種子，購于河北省安國(guó)中藥材推廣站，瞿麥為經(jīng)種子萌發(fā)的無菌苗，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株和R1601菌株，均保存于牡丹江師范學(xué)院分子實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 將保存的菌株從-80℃冰箱取出，融化預(yù)先滅菌的LB(100 mL)固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻至55℃左右時(shí)在超凈工作臺(tái)內(nèi)加入卡那霉素(50 mg/mL)100 μL，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基使卡那霉素混合均勻，然后倒平板。待平板冷卻凝固時(shí)，用接種環(huán)蘸取少量菌液，之字形平板劃線接種于培養(yǎng)基上，并用封口膜封好。將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗倒置培養(yǎng)48 h使其活化。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用移液槍加入卡那霉素于無菌的三角瓶?jī)?nèi)，用提前滅菌的牙簽尖端挑取培養(yǎng)48 h左右的單菌落，并將牙簽置于含有LB液體培養(yǎng)基三角瓶?jī)?nèi)，隨后將三角瓶用封口膜封好放置在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置為28℃，180 r/min培養(yǎng)至菌液濃度A600OD值為0.4～0.6時(shí)將三角瓶從搖床中取出備用。

1.2.2 瞿麥葉片預(yù)培養(yǎng) 將瞿麥無菌苗從MS固體培養(yǎng)基中用無菌的鑷子輕輕取出，放置在無菌的培養(yǎng)皿中，用刀片將無菌苗的根部和葉柄切除，把葉片放置在加入1/2MS固體培養(yǎng)基中，25～26℃光照預(yù)培養(yǎng)2 d。

1.2.3 侵染與共培養(yǎng) 分別將A4及R1601菌液倒入50 mL離心管中，5 000 r/min，離心10 min。離心后的菌液在超凈工作臺(tái)內(nèi)倒出上清液，加入等體積的1/2MS液體培養(yǎng)基，振蕩離心管使菌體懸浮。然后每個(gè)無菌的三角瓶?jī)?nèi)加入100 μL的乙酰丁香酮(AS)，再將菌液倒入三角瓶?jī)?nèi)，封口膜封好，把三角瓶放進(jìn)振蕩培養(yǎng)箱，28℃，180 r/min，震蕩培養(yǎng)30 min。把預(yù)培養(yǎng)的葉片用無菌的手術(shù)刀把葉片的尖端和基部各切1個(gè)傷口，再把帶傷口的葉片放進(jìn)菌液中，放置振蕩培養(yǎng)箱中，28℃，180 r/min，分別震蕩侵染3 min、5 min、10 min和15 min。隨后將葉片從菌液中用鑷子夾出來，在無菌的吸水紙上吸去多余的菌液，以防菌液濃度過大、長(zhǎng)勢(shì)過盛，使得葉片致死。再將葉片轉(zhuǎn)接到加入了AS的1/2MS固體培養(yǎng)基上，放在恒溫培養(yǎng)箱中23℃，黑暗倒置共培養(yǎng)2 d。觀察記錄不同侵染時(shí)間下的外植體數(shù)量、毛狀根平均數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率=長(zhǎng)出毛狀根外植體/侵染外植體總數(shù)×100%

1.2.4 除菌和繼代培養(yǎng) 用無菌的鑷子將暗培養(yǎng)后的外植體在無菌的吸水紙上吸去多余水分放入含有頭孢的1/2MS固體培養(yǎng)基。為了抑制發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株和R1601菌株的過度生長(zhǎng)，前3次除菌時(shí)每隔2 d除菌1次，此時(shí)頭孢的濃度為500 mg/L。當(dāng)后期發(fā)根農(nóng)桿菌比較少時(shí)每隔5 d除菌1次，為了避免因除菌培養(yǎng)基內(nèi)頭孢含量過高致使瞿麥葉片變黃，再把頭孢的濃度調(diào)為400 mg/L。當(dāng)毛狀根生長(zhǎng)至3～5 cm時(shí)，用無菌的手術(shù)刀在超凈工作臺(tái)內(nèi)從毛狀根基部將毛狀根切除，再用鑷子把毛狀根輕輕轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，每5 d需要繼代1次。繼代培養(yǎng)基分別為1/2MS固體培養(yǎng)基、1/2MS液體培養(yǎng)基、MS固體培養(yǎng)基和MS液體培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接到1/2MS液體培養(yǎng)基和MS液體培養(yǎng)基時(shí)，放置在振蕩培養(yǎng)箱25℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接在1/2MS固體培養(yǎng)基和MS固體培養(yǎng)基時(shí)則需要25℃光照培養(yǎng)。觀察瞿麥毛狀根在不同類型培養(yǎng)基的擴(kuò)繁情況。

1.2.5 毛狀根的分子鑒定 采取常規(guī)CTAB法分別提取未侵染瞿麥組培苗和瞿麥毛狀根基因組DNA。以瞿麥毛狀根DNA為模板，菌株A4及R1601作為陽性對(duì)照，瞿麥未經(jīng)侵染的外植體DNA作為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10 μL混合酶試劑[Premix TAP(Takapa TAP Version 2.0 plus dye)、2 μL rolB引物、7 μL水和模板1 μL]。反應(yīng)程序：95℃5 min預(yù)變性，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后72℃保溫5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將其擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 A4和R1601菌株不同侵染時(shí)間對(duì)瞿麥毛狀根誘導(dǎo)率的影響

由表1和圖1A～D可知，A4菌株分別侵染瞿麥葉片3 min、5 min、10 min和15 min后，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，均能誘導(dǎo)出毛狀根，說明A4菌株適于誘導(dǎo)瞿麥毛狀根。瞿麥侵染3 min、5 min、10 min和15 min的毛狀根誘導(dǎo)率分別為52.90%、81.2%、73.3%和56.2%，說明侵染時(shí)間超過5 min后，毛狀根的誘導(dǎo)率隨侵染時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，故A4菌株侵染瞿麥葉片5 min時(shí)誘導(dǎo)率最高，毛狀根分支較多，長(zhǎng)勢(shì)良好。

由表1和圖1E～H可知，R1601菌株分別侵染瞿麥葉片3 min、5 min、10 min和15 min后，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，均能誘導(dǎo)出毛狀根，說明R1601菌株適于誘導(dǎo)瞿麥毛狀根。但不同侵染時(shí)間的誘導(dǎo)率有所差別，當(dāng)侵染時(shí)間為10 min時(shí)，其毛狀根的誘導(dǎo)率最高，為78.60%。侵染時(shí)間為0～10 min隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，毛狀根的誘導(dǎo)率隨之增高，當(dāng)侵染時(shí)間大于10 min，毛狀根的誘導(dǎo)率降低且葉片褐化嚴(yán)重直至最后干枯死亡，故R1601菌株最佳侵染時(shí)間為10 min，此時(shí)誘導(dǎo)率最高毛狀根長(zhǎng)勢(shì)較好。

表1 A4和R1601菌株不同侵染時(shí)間的瞿麥毛狀根誘導(dǎo)率

2.2 不同培養(yǎng)基類型對(duì)瞿麥毛狀根增殖的影響

由圖2可知，1/2MS固體培養(yǎng)基上瞿麥毛狀根的每根毛狀根上面都新生長(zhǎng)出了很多乳白色絨毛狀的側(cè)根，而MS固體培養(yǎng)基上的毛狀根只有3根毛狀根新長(zhǎng)出了側(cè)根，且側(cè)根的數(shù)量比1/2MS固體培養(yǎng)基少。所以瞿麥毛狀根在1/2MS固體培養(yǎng)基中比MS固體培養(yǎng)基長(zhǎng)勢(shì)更好。由于1/2MS培養(yǎng)基大量元素減少了50%，由此推測(cè)瞿麥毛狀根在低鹽培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)更好。

此外，瞿麥毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基和MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后的重量明顯增加，新長(zhǎng)出的毛狀根較纖細(xì)并呈現(xiàn)出抱團(tuán)現(xiàn)象。然而，毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基的長(zhǎng)勢(shì)比MS液體培養(yǎng)基好。對(duì)比毛狀根在1/2MS固體培養(yǎng)基、MS固體培養(yǎng)基、1/2MS液體培養(yǎng)基、MS液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況發(fā)現(xiàn)，毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于固體培養(yǎng)基。

由圖3可知，瞿麥毛狀根質(zhì)量在1/2MS液體培養(yǎng)基中前4次繼代時(shí)呈上升趨勢(shì)，在第5次繼代時(shí)質(zhì)量有所下降。毛狀根在第1天放入1/2MS液體培養(yǎng)基中增殖時(shí)質(zhì)量為0.336 g，當(dāng)培養(yǎng)至第16天時(shí)質(zhì)量為2.915 g，僅15 d毛狀根質(zhì)量約增加7.7倍，說明瞿麥毛狀根適于在1/2MS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁。在第5次繼代時(shí)毛狀根的質(zhì)量下降可能是由于毛狀根的老化造成。

2.3 瞿麥毛狀根的分子鑒定

由圖4可知，2～5號(hào)點(diǎn)樣孔上方在425 bp左右出現(xiàn)明顯條帶。其中1號(hào)點(diǎn)樣孔沒有條帶，4～5號(hào)點(diǎn)樣孔上方出現(xiàn)的條帶與2號(hào)、3號(hào)點(diǎn)樣孔陽性對(duì)照結(jié)果一致，表明農(nóng)桿菌A4及R1601的Ri質(zhì)粒中的T-DNA所含有的rolB基因已經(jīng)成功整合到瞿麥的基因組中，說明試驗(yàn)所得毛狀根是經(jīng)過A4及R1601侵染誘導(dǎo)后得到的。

3 結(jié)論與討論

瞿麥葉片經(jīng)A4菌株和R1601菌株侵染后均能誘導(dǎo)出毛狀根，侵染時(shí)間不同，誘導(dǎo)率也不相同，用A4菌株侵染5 min時(shí)誘導(dǎo)率最高，為81.2%；用R1601菌株侵染10 min時(shí)誘導(dǎo)率最高，為78.60%。瞿麥毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁效果最好。

另外，在誘導(dǎo)藥用植物瞿麥毛狀根時(shí)發(fā)現(xiàn)，毛狀根的誘導(dǎo)率與瞿麥葉片的年齡和外植體的大小有很大關(guān)系。當(dāng)瞿麥葉片年齡和外植體的大小都較小時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，外植體褐化程度也會(huì)越來越嚴(yán)重，直至最后死亡。當(dāng)選用的瞿麥葉片年齡較大且外植體較大時(shí)，外植體在培養(yǎng)過程中只有輕微的失綠現(xiàn)象，且誘導(dǎo)出的毛狀根長(zhǎng)較粗壯。由于瞿麥毛狀根比較纖細(xì)且毛狀根有時(shí)會(huì)伸進(jìn)培養(yǎng)基，在除菌2次左右時(shí)，外植體會(huì)變得比較脆，所以在除菌時(shí)應(yīng)該用鑷子小心夾取長(zhǎng)出毛狀根的外植體，避免破壞毛狀根和外植體。

影響毛狀根誘導(dǎo)效果的因素多種多樣，如菌種類型、培養(yǎng)基類型、菌液OD值、侵染時(shí)間、侵染方式等。同一植物材料用不同的菌種侵染時(shí)，效果也不盡相同，每種植物外植體都有誘導(dǎo)率相對(duì)較高的菌種。如薛雯心等[16]用A4、C58C1和A14763菌株誘導(dǎo)黨參毛狀根發(fā)現(xiàn)，A4誘導(dǎo)率最高。然而，任如意等[17]用發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1、R1601和ATCC15834菌株侵染毛酸漿外植體發(fā)現(xiàn)，4種發(fā)根農(nóng)桿菌均能誘導(dǎo)毛酸漿外植體產(chǎn)生毛狀根，其中ATCC15834的誘導(dǎo)率相對(duì)較高。培養(yǎng)基的類型不同，所含的成分也千差萬別，不同的培養(yǎng)基類型為毛狀根生長(zhǎng)提供不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此選擇合適的培養(yǎng)基會(huì)更利于毛狀根的生長(zhǎng)。鄒凱等[18]以發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060誘導(dǎo)甜葉菊毛狀根，建立毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸類物質(zhì)體系，結(jié)果表明，MS液體培養(yǎng)基較B5和WPM更利于甜葉菊毛狀根生長(zhǎng)及綠原酸類物質(zhì)的積累。施和平等[19]用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC 15834誘導(dǎo)美洲商陸毛狀根時(shí)發(fā)現(xiàn)，在供試的MS、1/2MS、B5和6，7-V液體培養(yǎng)基中，以無外源激素的MS液體培養(yǎng)基最適合美洲商陸毛狀根根系生長(zhǎng)。針對(duì)外植體的生長(zhǎng)狀況選擇合適的侵染時(shí)間是影響毛狀根誘導(dǎo)率的一個(gè)關(guān)鍵因素之一。李素紅等[20]在誘導(dǎo)決明毛狀根的研究中發(fā)現(xiàn)，浸染時(shí)間在5 s至20 min隨著浸染時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的誘導(dǎo)率變化不顯著，但平均每個(gè)誘導(dǎo)外植體的毛狀根干重卻在逐漸下降，浸染30 min，誘導(dǎo)率顯著降低，平均每個(gè)誘導(dǎo)外植體的毛狀根干重也顯著降低。故決明毛狀根培養(yǎng)的最佳浸染時(shí)間是5s，即浸濕后立刻取出。陳晨[21]對(duì)蠶豆外植體分別侵染5 min、10 min和15 min發(fā)現(xiàn)，侵染5 min與侵染10 min、15 min誘導(dǎo)率相差較大，而侵染10 min與15 min誘導(dǎo)率相差不大。劉連旺等[22]誘導(dǎo)地黃毛狀根發(fā)現(xiàn)，侵染10 min時(shí)地黃毛狀根的誘導(dǎo)效果最佳，之后隨著侵染時(shí)間的增加，誘導(dǎo)率逐漸下降。對(duì)大多數(shù)的植物材料來說，一般最合適的侵染時(shí)間為8～15 min，一旦超過了最適侵染時(shí)間，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，毛狀根的誘導(dǎo)率反而會(huì)降低。A600的OD值對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)率也有極其重要的影響，宗曉秋[23]在誘導(dǎo)大豆毛狀根的過程中發(fā)現(xiàn)，菌液A600OD為0.6時(shí)，毛狀根的轉(zhuǎn)化率最高，A600OD值為0～0.6時(shí)，毛狀根的轉(zhuǎn)化率與菌液A600OD值呈正相關(guān)，A600OD值為0.6～1.5時(shí)，二者呈負(fù)相關(guān)。林志豪等[24]在誘導(dǎo)黃瓜毛狀根時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)OD600值小于0.8時(shí)，毛狀根誘導(dǎo)率較低，為21.24%～57.69%；OD600值為1.2時(shí)，黃瓜毛狀根誘導(dǎo)率大大提高，為70.83%。

綜上所述，影響植物毛狀根誘導(dǎo)的條件多種多樣，相關(guān)科研工作者需通過不斷探究找到不同材料誘導(dǎo)毛狀根生長(zhǎng)的最優(yōu)條件。研究初步建立了瞿麥毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)技術(shù)，后續(xù)還需對(duì)瞿麥毛狀根的有效成分進(jìn)一步研究。