紅曲霉菌株CS-5篩選及不產(chǎn)桔霉素機(jī)理研究

楊華　劉丹　馬博雅　王旭鋒　李貞景　陳勉華　王昌祿

摘要 對(duì)從紅曲米中分離出來的12株紅曲霉進(jìn)行桔霉素產(chǎn)量檢測(cè)，篩選出一株在大米培養(yǎng)基和YES培養(yǎng)基中均不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株CS-5。對(duì)CS-5進(jìn)行基因分析，發(fā)現(xiàn)在紅曲霉CS-5的桔霉素合成基因簇中缺少ctnA和ctnE基因（ctnA是桔霉素合成途徑中的激活基因，ctnE是脫氫酶的編碼基因）;紅曲霉CS-5上ctnF和ctnH基因與Monascus aurantiacu（Gen Bank accession No.EU309474）同源基因（ctnF和ctnH基因分別編碼變位酶和短鏈脫氫酶）同源性僅為71%和76%;同時(shí)發(fā)現(xiàn)，orf5基因（編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）在mRNA上不表達(dá)。結(jié)果表明：紅曲霉的桔霉素發(fā)酵特性與其基因結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。ctnA和ctnE基因的缺失、ctnF和ctnH基因的低同源性以及orf5基因不表達(dá)可能導(dǎo)致桔霉素合成途徑被中斷或桔霉素?zé)o法被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外。這些可能是導(dǎo)致紅曲霉CS-5不產(chǎn)桔霉素的關(guān)鍵原因。該研究為根據(jù)基因結(jié)構(gòu)篩選不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 紅曲霉CS-5;桔霉素;同源性

中圖分類號(hào) TS 264.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）23-0206-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.053

Selection of Monascus CS-5 and Mechanism of No-citrinin

YANG Hua1，2，LIU Dan1，2，MA Bo-ya1，2 et al

（1.State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Tianjin 300457;2.College of Food Science and Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）

Abstract 12 strains of Monascus isolated from red-rice，and ability of citrinin production were detected，then strain CS-5 which no citrinin produced neither in rice medium nor in YES medium was screened.Results of CS-5 gene analysis showed that strain CS-5 lacks ctnA and ctnA gene （citrinin biosynthesis gene activator and dehydrogenase encoding gene respectively） in citrinin biosynthesis gene cluster，ctnF and ctnH gene （encode mutase and short-chain dehydrogenase respectively） in CS-5 on the homology of only 71% and 76% to the Monascus aurantiacu（Gen Bank accession No.EU309474）.The orf5 gene （encoding a membrane transporter protein） didnt not express on mRNA level.The citrinin fermentation characteristics were closely related to their genetic structure.Lacking of ctnA and ctnE， low homology of ctnF and ctnH，orf5 didnt express at the mRNA level caused citrinin biosynthetic pathway interrupted or cant be transported outside the cell membrane.These maybe the reason why Monascus CS-5 didnt produce citrinin.This study provided a theoretical basis for screening strains of Monascus that do not produce citrinin based on genetic structure.

Key words Monascus CS-5;Citrinin;Homology

紅曲霉（Monascus）是一種在食品和醫(yī)藥行業(yè)有廣泛應(yīng)用的絲狀真菌。1995年，相關(guān)研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，紅曲霉在產(chǎn)生對(duì)人體有益的生物活性物質(zhì)（如 Monacolin K、γ-氨基丁酸以及紅曲色素等）的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生一種真菌毒素——桔霉素，桔霉素具有腎毒性，因此桔霉素的生成很大程度上制約了紅曲霉的廣泛應(yīng)用[1]。

由于桔霉素與色素同時(shí)存在，所以含有色素的紅曲菌產(chǎn)品中常常含有桔霉素。除了紅曲產(chǎn)品外，還檢測(cè)到其他易受霉菌毒素污染的產(chǎn)品，例如食品、動(dòng)物飼料等都可能含有桔霉素[2]。 關(guān)于葡萄牙霉菌毒素暴露評(píng)估的一份報(bào)告顯示，可以從尿液樣本中檢測(cè)出桔霉素[3]。 研究還發(fā)現(xiàn)，桔霉素可以與

其他霉菌毒素（如赭曲霉毒素A）協(xié)同作用，以提高彼此的毒性[4]。很多國(guó)家和地區(qū)為紅曲產(chǎn)品中的桔霉素殘留量設(shè)定了限制標(biāo)準(zhǔn)。因此，減少紅曲霉產(chǎn)品中桔霉素的殘留是促進(jìn)紅曲霉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要舉措。

近年來，很多學(xué)者通過發(fā)酵條件優(yōu)化、基因突變、基因敲除、基因沉默等方法從發(fā)酵和分子層面對(duì)紅曲霉桔霉素的產(chǎn)生機(jī)制和調(diào)控途徑進(jìn)行研究，并取得了一定進(jìn)展。Shimizu等[5]通過對(duì)紫色紅曲菌（M.purpureus）的研究，得到了與桔霉素合成相關(guān)的PKS基因簇，包括pksCT及其上下游的5個(gè)開放閱讀框。在此基礎(chǔ)上，Li等[6]繼續(xù)對(duì)M.aurantiacus基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選和克隆后得到了另外10個(gè)ORF（圖1）。

作為基因簇中桔霉素合成的關(guān)鍵聚酮合酶基因pksCT，其功能存在不同解釋，李琦等[7]敲除了紫色紅曲菌株J01基因組中的pksCT基因后，發(fā)現(xiàn)基因缺失菌株的菌絲體中未檢測(cè)出桔霉素;殷博薇[8]和張淑云等[9]發(fā)現(xiàn)pksCT基因敲除后仍有部分桔霉素合成，pksCT基因并不是紅曲霉合成桔霉素的唯一關(guān)鍵基因。 Ning等[10]研究發(fā)現(xiàn)ctnE缺失后，該菌株代謝產(chǎn)桔霉素的量與原菌株相比減少了96%，表明ctnE基因?qū)勖顾睾铣纱x有重要影響;ctnA基因敲除后[11]，pksCT和orf5轉(zhuǎn)錄的大量減少，且?guī)缀鯔z測(cè)不到桔霉素的產(chǎn)生，表明pksCT和orf5基因受ctnA產(chǎn)物的控制;在其他研究中，orf1、orf2、ctnG以及ctnB 基因的缺失也會(huì)造成桔霉素產(chǎn)量顯著降低，但不會(huì)完全消失[6，12-13]。此外，基因orf6，orf7和ctnRI基因上調(diào)均與抑制桔霉素的合成有關(guān)。orf6和ctnRI缺失均會(huì)導(dǎo)致桔霉素產(chǎn)量升高，可能是這2個(gè)基因作為調(diào)節(jié)因子對(duì)桔霉素的合成進(jìn)行反饋抑制[14]。

雖然多項(xiàng)研究都在對(duì)桔霉素合成調(diào)控基因進(jìn)行研究，但是單個(gè)基因，包括聚酮合酶關(guān)鍵基因pksCT和基因簇激活基因ctnA的缺失都無法使桔霉素合成徹底消失，這說明這些基因只決定桔霉素產(chǎn)量，并不直接決定桔霉素是否徹底合成。桔霉素的合成可能并不是由單個(gè)基因決定的，而是由多個(gè)基因共同決定。通過環(huán)境因子對(duì)桔霉素合成的影響研究發(fā)現(xiàn)，缺氧使ctnA基因表達(dá)量上調(diào)和orf7基因表達(dá)量下調(diào)，同時(shí)桔霉素產(chǎn)量減少，故進(jìn)一步推測(cè)桔霉素合成的調(diào)控可能是多個(gè)基因協(xié)同作用結(jié)果[15]。用藍(lán)光照射紅曲霉后，基因orf1、orf3、orf4 （ctnB）表達(dá)量上調(diào)且桔霉素產(chǎn)量提高，也表明桔霉素合成是由多個(gè)基因共同作用結(jié)果[16]。

雖然在分子生物學(xué)領(lǐng)域，桔霉素合成的相關(guān)基因已經(jīng)被分離和鑒定出來，但是仍未從根本上解決桔霉素殘留問題。桔霉素的合成是由多個(gè)基因決定的，即使同一基因，基因序列的差異也可能影響最終表達(dá)，從而影響桔霉素生成。因此，單個(gè)基因功能的研究具有局限性。篩選不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，有助于更深入了解桔霉素合成機(jī)理。

該研究從紅曲米中分離的12株紅曲霉中篩選出一株在大米培養(yǎng)基和YES培養(yǎng)基中均不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株CS-5。通過對(duì)CS-5的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)兩方面進(jìn)行分析，進(jìn)而闡述其不產(chǎn)桔霉素的原因。通過對(duì)CS-5不產(chǎn)桔霉素特性的研究，為開發(fā)更安全的紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品提供理論支持，同時(shí)也為從基因結(jié)構(gòu)鑒定和篩選不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 紅曲霉CS-5保存在天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)研究室。

試劑：色譜純甲醇、色譜純乙腈，德國(guó)默克（Merck）公司;超純水，實(shí)驗(yàn)室自制;桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%），美國(guó)西格瑪（Sigma）公司;植物RNA提取試劑盒，美國(guó)Omega Bio-Tek公司;植物基因組DNA提取試劑盒，康為世紀(jì)生物技術(shù)公司。

菌種保藏培養(yǎng)基：麥芽汁（糖度10～12°Bx），瓊脂粉2%;發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉5 g，NaNO3 0.3 g，KH2PO4 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，自來水100 mL，pH 7.0;葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，NaNO3 10 g/L， KH2PO4 10 g/L。YES培養(yǎng)基：YES1培養(yǎng)基為酵母浸膏40 g/L、蔗糖160 g/L，YES2培養(yǎng)基為酵母浸粉40 g/L、蔗糖160 g/L，2種培養(yǎng)基成分分別滅菌，滅菌后混勻。以上培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃，15 min。

1.2 儀器設(shè)備 回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜（HYG-Ⅱa 型），上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司;微電腦控制光照培養(yǎng)箱（LRH-250-GⅡ 型），珠江廣東省醫(yī)療器械廠;立式壓力蒸汽滅菌鍋（HX05L288 型），上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;超凈工作臺(tái)（ SW-CJ-1FD 型），上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;高速冷凍離心機(jī)（J-26 XP 型），貝克曼庫(kù)爾特（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉培養(yǎng)條件。

液體發(fā)酵：在菌種保藏管中加入3 mL生理鹽水制成菌懸液，接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)28 h，得到種子液，將孢子濃度調(diào)整為106個(gè)/mL。在裝有50 mL YES培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中接種5 mL調(diào)好濃度的種子液，置于相應(yīng)的條件下培養(yǎng)。無菌條件下采集上層菌絲體用于RNA或DNA的提取和測(cè)定生物量。發(fā)酵液用于桔霉素的測(cè)定，大米發(fā)酵：將5 mL種子液均勻接種到裝有50 g大米培養(yǎng)基的100 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.3.2 樣品處理。

1.3.2.1 固體樣品。

紅曲霉發(fā)酵物60 ℃烘干6～8 h至恒重，研缽研磨均勻成粉并過100目篩后準(zhǔn)確稱取0.500 0 g放置到潔凈離心管中，加入75%乙醇3.2 mL，超聲30 min，3 000 r/min離心15 min，取出上清液移入容量瓶，再向沉淀中加入75%乙醇3.2 mL ，超聲30 min后3 000 r/min離心10 min，再次取出上清液移入容量瓶，重復(fù)3次。合并上清液，用75%乙醇定容至10 mL，靜置沉淀30 min，取上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

1.3.2.2 液體樣品。取0.5 mL紅曲發(fā)酵液至離心管，加1 mL無水乙醇后混勻，60 ℃水浴60 min，5 000 r/min離心15 min，收集上清液，靜置沉淀30 min，取上清0.45 μm濾膜后檢測(cè)備用。

1.3.3 桔霉素含量測(cè)定。

1.3.3.1 實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)法。

檢測(cè)條件為色譜柱：Agilent TC-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶水=70∶10∶20，配好的混合溶液須放置過夜，用磷酸調(diào)pH 2.66～2.68，調(diào)好pH后用有機(jī)濾膜過濾2次，超聲脫氣30 min，超聲后的流動(dòng)相在移動(dòng)過程中需盡量減少晃動(dòng)以免氣泡混入;選擇熒光檢測(cè)器，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)λex=331 nm，λem=500 nm，開燈預(yù)熱20 min后進(jìn)樣;柱溫25 ℃;流速1 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3.2 國(guó)標(biāo)方法。檢測(cè)條件為色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，粒度5 μm）;流動(dòng)相為乙腈∶水=35∶65，水用色譜純磷酸調(diào)pH至2.5，乙腈和水分別用有機(jī)濾膜過濾2次，超聲脫氣30 min，超聲后的流動(dòng)相在移動(dòng)的過程中需盡量減少晃動(dòng)以免氣泡混入;檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：發(fā)射波長(zhǎng)（λem）=500 nm，激發(fā)波長(zhǎng)（λex）=331 nm;柱溫28 ℃;流速1 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4 紅曲霉CS-5桔霉素合成基因的克隆及表達(dá)分析。分別用康為世紀(jì)生物技術(shù)公司植物基因組提取試劑盒和美國(guó)Omega Bio-Tek公司 RNA提取試劑盒進(jìn)行紅曲霉CS-5基因組DNA提取和RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4.1 紅曲霉CS-5基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。取紅曲霉的基因組DNA樣品5 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組DNA的純度及濃度，具體步驟參考文獻(xiàn)[17]。

1.3.4.2 紅曲霉CS-5桔霉素合成相關(guān)基因克隆、產(chǎn)物純化及產(chǎn)物回收。

（1）紅曲霉桔霉素合成相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)。桔霉素合成相關(guān)基因序列參考來源：orf1，ctnA，orf3，orf4，orf5（GenBank accession No.AB243687，NCBI），pksCT （GenBank accession No.AB167465，NCBI），ctnD，ctnE，ctnF，ctnG，ctnH，ctnI，ctnR1，orf7 （GenBank accession No.EU309474，NCBI），actin gene （GenBank accession No.AJ417880，NCBI），引物設(shè)計(jì)軟件：Primer-Blast在線軟件（NCBI），設(shè)計(jì)引物見表1、2。

若PCR產(chǎn)物為單一條帶，則進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化;若PCR產(chǎn)物中有雜帶，則對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收。若某些基因沒有擴(kuò)增出目的條帶，重新設(shè)計(jì)引物克隆這些基因。

（2）PCR產(chǎn)物純化。使用康為世紀(jì)生物技術(shù)公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，按照試劑盒操作說明操作。

（3）PCR產(chǎn)物回收方法。

使用加拿大FERMENTAS公司的膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，按照試劑盒操作說明操作。

1.3.4.3 紅曲霉CS-5 RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄。使用美國(guó)Omega Bio-Tek公司 RNA提取試劑盒進(jìn)行紅曲霉CS-5 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒操作說明操作。

1.3.4.4 Rt-qPCR鑒定紅曲霉CS-5桔霉素合成相關(guān)基因是否表達(dá)。紅曲霉桔霉素合成相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量監(jiān)控采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（SYBR Green染色）。擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)如表3所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉CS-5不產(chǎn)桔霉素驗(yàn)證

以YES為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 d后取發(fā)酵液，分別用快速檢測(cè)法和國(guó)標(biāo)法2種HPLC方法測(cè)定樣品中桔霉素含量。應(yīng)用快速檢測(cè)法對(duì)進(jìn)樣量為濃縮5倍后100 μL的CS-5樣品進(jìn)行檢測(cè)，未檢出桔霉素，HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

采用國(guó)標(biāo)法對(duì)進(jìn)樣量為濃縮5倍后CS-5發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

對(duì)CS-5發(fā)酵液進(jìn)行以上2種檢測(cè)方法檢測(cè)均未檢測(cè)出桔霉素，可見CS-5為一株不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株。

2.2 紅曲霉CS-5桔霉素合成基因的克隆及表達(dá)分析 以不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株CS-5為研究對(duì)象，對(duì)已報(bào)道的桔霉素合成相關(guān)基因簇上14個(gè)基因進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，從基因組成及表達(dá)水平對(duì)紅曲霉CS-5不產(chǎn)桔霉素的原因進(jìn)行研究。

2.2.1 DNA克隆結(jié)果。

用第一批引物（表1）以CS-5基因組DNA為模板對(duì)桔霉素合成相關(guān)基因進(jìn)行克隆，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。圖4中，DNA Marker為1 kb plus DNA Ladder。由圖4可知，沒有擴(kuò)增出orf1、ctnA、orf3、orf4、orf5、ctnE和ctnG基因（或條帶不清晰、雜帶）。將擴(kuò)增出的pksCT、orf7、ctnD、ctnF、ctnH、ctnI和ctnR1基因片段經(jīng)純化后，送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI上報(bào)道的桔霉素合成相關(guān)基因序列（GenBank accession No.EU309474）進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果見表4。

采用第二批引物，對(duì)上次試驗(yàn)沒有擴(kuò)增出的orf1、ctnA、orf3、orf4、orf5、ctnE和ctnG基因進(jìn)行克隆，引物列表見表2（F1，R1），PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。圖5中第1條Marker為1 kb plus DNA Ladder，第2條Marker為DM2000。由圖5可知，仍然沒有擴(kuò)增出ctnA基因;擴(kuò)增出的of5、ctnE和ctnG因?yàn)閱我粭l帶且大小與目的產(chǎn)物大小一致，將這3個(gè)基因進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序;orf1、orf3和orf4基因雖然有雜帶，但圖中用方框標(biāo)出的條帶與目的產(chǎn)物大小一致且與雜帶相距較遠(yuǎn)，將這3個(gè)條帶切膠回收后，送測(cè)序公司測(cè)序。雖然擴(kuò)增出的ctnE基因與目的產(chǎn)物大小一致，但測(cè)序結(jié)果顯示與NCBI上報(bào)道的ctnE基因序列同源性幾乎為0。測(cè)序結(jié)果見表4。

設(shè)計(jì)第三批引物，克隆ctnA和ctnE基因引物列表見表2（F2，R2），結(jié)果仍然沒有擴(kuò)增出這2個(gè)基因。將克隆得到的基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化或膠回收后送測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)果見表4。

2.2.2 紅曲霉CS-5 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及基因表達(dá)分析。

紅曲霉CS-5 RNA電泳結(jié)果見圖6。第一泳道為紅曲霉CS-5 RNA，第二條泳道為Marker：1 kb plus DNA Ladder。從圖6可以看出，紅曲霉CS-5 RNA條帶清晰，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以CS-5 cDNA為模板，用表3引物作Rt-qPCR，分析各基因的表達(dá)情況，結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，采用3批不同引物進(jìn)行擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，紅曲霉CS-5的基因組DNA中缺少ctnA和ctnE基因（ctnA基因編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子是桔霉素合成途徑中的激活基因，ctnE是脫氫酶的編碼基因）;克隆得到的紅曲霉CS-5 ctnF和ctnH基因與NCBI上報(bào)道的ctnF和ctnH基因（ctnF和ctnH基因分別編碼變位酶和短鏈脫氫酶）同源性僅為71%和76%;通過熒光定量PCR的方法進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，在紅曲霉CS-5基因組DNA中雖然克隆得到orf5基因（編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），但該基因不表達(dá)。

3 結(jié)論

桔霉素殘留一直是困擾紅曲霉發(fā)酵制品的重要安全問題，通過發(fā)酵條件優(yōu)化能夠減少但是并不能完全去除桔霉素。通過分析桔霉素合成基因簇中各基因功能發(fā)現(xiàn)，基因簇中的各個(gè)基因具有協(xié)同作用，桔霉素合成并不是單個(gè)基因起作用。篩選一株不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌在工業(yè)化生產(chǎn)中具有重要的實(shí)用意義，同時(shí)研究其基因結(jié)構(gòu)有助于了解桔霉素的合成調(diào)節(jié)機(jī)理。

該研究表明，CS-5中orf5基因沒有表達(dá)，同時(shí)ctnA基因缺失。Shimizu等[11]敲除了紅曲霉的ctnA基因，結(jié)果pksCT和orf5轉(zhuǎn)錄大量減少。推測(cè)，CS-5中orf5的不表達(dá)可能和ctnA的缺失有關(guān)。而在CS-5中，雖然沒有ctnA基因，但是pksCT基因仍然可以表達(dá)，并且沒有桔霉素產(chǎn)生。這說明ctnA并不是整個(gè)基因簇的唯一激活因子。紅曲霉MX-1在藍(lán)光下誘導(dǎo)以后桔霉素合成基因簇表達(dá)規(guī)律也顯示ctnA并不是整個(gè)基因簇的唯一激活因子。有研究顯示，ctnA敲除后，仍有部分桔霉素產(chǎn)生，而缺少ctnA和ctnE基因的CS-5不產(chǎn)桔霉素，說明，ctnA僅決定桔霉素的產(chǎn)量，并不決定是否產(chǎn)桔霉素。有研究證實(shí)，敲除ctnE基因，桔霉素的產(chǎn)量降低，但是仍有桔霉素生成。這說明ctnE也不是決定是否生產(chǎn)桔霉素的原因。真正造成不產(chǎn)桔霉素的原因可能是ctnF和ctnH基因的低同源性，因此ctnF和ctnH基因的同源性也可能是決定紅曲霉是否產(chǎn)桔霉素的重要因素。

該研究得出以下結(jié)論：雖然CS-5中orf5基因沒有表達(dá)，同時(shí)ctnA基因缺失，但紅曲霉CS-5不產(chǎn)桔霉素的主要原因是ctnF和ctnH基因的同源性較低。ctnF和ctnH基因的同源性可以作為篩選不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株的重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]李貞景，薛意斌，劉妍，等.紅曲菌中桔霉素的控制策略及研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2018，39（17）：263-268.

[2] ARROYO-MANZANARES N，RODRGUEZ-ESTVEZ V，ARENAS-FERNNDEZ P，et al.Occurrence of mycotoxins in swine feeding from Spain[J].Toxins，2019，11（6）：1-13.

[3] MARTINS C T，VIDAL A，DE BOEVRE M，et al.Exposure assessment of Portuguese population to multiple mycotoxins：The human biomonitoring approach[J].Int J Hyg Environ Health，2019，222（6）：913-925.

[4] GONG L，ZHU H，LI T T，et al.Molecular signatures of cytotoxic effects in human embryonic kidney 293 cells treated with single and mixture of ochratoxin A and citrinin[J].Food Chem Toxicol，2019，123：374-384.

[5] SHIMIZU T，KINOSHITA H，ISHIHARA S，et al.Polyketide synthase gene responsible for citrinin biosynthesis in Monascus purpureus[J].Applied and environmental microbiology，2005，71（7）：3453-3457.

[6] LI Y P，XU Y，HUANG Z B.Isolation and characterization of the citrinin biosynthetic gene cluster from Monascus aurantiacus[J].Biotechnol Lett，2012，34（1）：131-136.

[7] 李琦，高健信，陳福生，等.不產(chǎn)桔霉素高產(chǎn)紅曲色素的基因工程紅曲菌株構(gòu)建[J].中國(guó)釀造，2018，37（6）：30-35.

[8] 殷博薇.橙色紅曲菌AS3.4384及其基因缺失株的發(fā)酵以及幾種代謝產(chǎn)物的分析[D].南昌：南昌大學(xué)，2016.

[9] 張淑云，黃志兵，許楊，等.橙色紅曲菌及其pksCT基因缺失株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)橘霉素及色素的變化[J].食品科學(xué)，2013，34（19）：148-152.

[10] NING Z Q，CUI H，XU Y，et al.Deleting the citrinin biosynthesis-related gene，ctnE，to greatly reduce citrinin production in Monascus aurantiacus Li AS3，4384[J].International journal of food microbiology，2017，241：325-330.

[11] SHIMIZU T，KINOSHITA H，NIHIRA T.Identification and in vivo functional analysis by gene disruption of ctnA，an? activator gene involved in citrinin biosynthesis in Monascus purpureus[J].Applied and environmental microbiology，2007，73（16）：5097-5103.

[12] HE Y，COX R J.The molecular steps of citrinin biosynthesis in fungi[J].Chemical science，2016，7（3）：2119-2127.

[13] 吳偉.橙色紅曲菌ctnG基因和ctnH基因缺失菌株的構(gòu)建及其功能分析[D].南昌：南昌大學(xué)，2010：38-42.

[14] 郭會(huì).紅曲霉桔霉素合成相關(guān)基因的功能驗(yàn)證[D].天津：天津科技大學(xué)，2017.

[15] 馬博雅，張佳，王雪蓮，等.缺氧對(duì)紅曲霉桔霉素相關(guān)基因表達(dá)量及產(chǎn)量的影響[J].中國(guó)釀造，2016，35（7）：143-146.

[16] WANG C L，YANG H，CHEN M H，et al.Real-time quantitative analysis of the influence of blue light on citrinin biosynthetic gene cluster expression in Monascus[J].Biotechnol Lett，2012，34（9）：1745-1748.

[17] 柳燕.高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的福建紅曲菌種構(gòu)建[D].福州：福建師范大學(xué)，2015.

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31330059、 31801519）。

作者簡(jiǎn)介 楊華（1985—），男，河北唐山人，博士，從事發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)與利用方面的研究。*通信作者，教授，碩士，博士生導(dǎo)師，從事食品生物技術(shù)方面的研究。

收稿日期 2020-01-03;修回日期 2020-02-11