一株廣西雞源H6亞型禽流感病毒全基因組序列分析及其重要生物學(xué)特性

李孟　謝芝勛　李丹　羅思思　謝麗基　張民秀　黃嬌玲　范晴　王盛　謝志勤　鄧顯文　曾婷婷　張艷芳

摘要 2017年對(duì)廣西地區(qū)活禽交易市場(chǎng)進(jìn)行低致病性禽流感流行病學(xué)調(diào)查，從采集的雞咽喉和泄殖腔拭子中分離鑒定出一株雞源H6N6亞型禽流感病毒，命名為A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）。應(yīng)用RT-PCR方法分別對(duì)分離毒株的8個(gè)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)將產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，然后對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析。另外，還通過(guò)固相受體結(jié)合試驗(yàn)對(duì)毒株的唾液酸受體進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，該分離株的 HA 基因與廣東分離株A/chicken/Guangdong/G3249/2014（H6）的核苷酸同源性最高，裂解位點(diǎn)符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因與江西分離株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6）核苷酸同源性最高;內(nèi)部基因中，PB1和NS基因來(lái)源于廣東的雞，PB2基因來(lái)源于越南的雞，PA、NP和M基因來(lái)源于廣西的鵝;同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)該病毒的HA、NA、PA、NP和M基因來(lái)源H6亞型AIV，PB2、PB1和NS基因來(lái)源H9N2亞型AIV，推測(cè)A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）可能是由不同地區(qū)、不同宿主來(lái)源的H6和H9亞型 AIV通過(guò)基因重組產(chǎn)生的一株新的重配毒株。由于廣西地理位置特殊，今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該地區(qū)H6亞型禽流感病毒變異情況的監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞 禽流感病毒;H6亞型;雞;遺傳進(jìn)化;受體分析

中圖分類號(hào) S 852.65文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）23-0125-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.030

Whole Genome Sequence Analysis and Important Biological Characteristics of a Strain of H6 Subtype Avian Influenza Virus from Chicken in Guangxi

LI Meng，XIE Zhi-xun，LI Dan et al

（Guangxi Veterinary Research Institute，Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Nanning，Guangxi? 530001）

Abstract In 2017，an epidemiological investigation of low-pathogenicity avian influenza was conducted in the live poultry trading market of Guangxi.One strain of H6N6 subtype of avian influenza virus was isolated and identified from throat and cloacal swab samples of chicken，named A/chicken/Guangxi / 286C10/2017（H6N6）.RT-PCR was used to amplify 8 gene fragments of isolated strains，and the products were cloned and sequenced at the same time.Then homology comparison and genetic evolution analysis were performed on the sequencing results.In addition，the sialic acid receptor of the strain was determined by solid phase receptor binding test.The results showed that HA gene in the isolated strain from Guangdong had the highest nucleotide homology with that in A/chicken/Guangdong/G3249/2014 （H6），and the? cracking sites conformed to the molecular characteristics of low pathogenic avian influenza virus.NA genes in the isolated from this strain had the highest nucleotide similarity with that in? isolated strain A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6）.Among internal genes，PB1 and NS genes were derived from chicken in Guangdong， PB2 gene was? derived from chicken in Vietnam，and PA，NP and M genes were derived from geese in Guangxi.At the same time，we found that the HA，NA，PA，NP and M genes in this virus were from H6 subtype of AIV，PB2，PB1 and NS genes were from H9N2 subtype of AIV，and it was speculated that A/chicken/Guangxi / 286C10/2017 （H6N6） might be a new strain of H6 and H9 subtypes of AIV from different regions，different host sources by gene recombination. Due to special geographical location of Guangxi，the monitoring of the variation of H6 subtype avian influenza virus in this region should be strengthened in the future.

Key words Avian influenza virus;H6 subtype;Chicken;Genetic evolution;Receptor analysis

禽流感（avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種動(dòng)物傳染性疾病。禽流感病毒基因組由8個(gè)不同的獨(dú)立片段組成，其片段包括 HA、NA、PB2、 PB1、 PA、 NP、 M和NS基因[1]。同時(shí)，依據(jù)AIV對(duì)雞的致病性，將AIV分為高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）[2]。1965年美國(guó)科學(xué)家從水禽樣品中首次分離到H6亞型AIV[3]，目前研究已發(fā)現(xiàn)H6亞型AIV廣泛存在于各種宿主動(dòng)物并在世界各地傳播[4-5];我國(guó)一些學(xué)者的研究表明，近年來(lái)我國(guó)華東和華南地區(qū)家禽中H6亞型AIV屬于分離率較高的禽流感亞型之一[6-8]。同時(shí)，一些其他研究也發(fā)現(xiàn)某些H6亞型AIV可以跨越動(dòng)物種屬屏障，直接感染哺乳動(dòng)物小鼠和水貂等，甚至在采集的健康人群血清中檢測(cè)到抗H6亞型AIV的特異性抗體[9-11]。2013年5月，我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)首次報(bào)道了H6N1亞型AIV直接感染人的病例[12]，通過(guò)基因遺傳進(jìn)化分析還發(fā)現(xiàn)H6亞型AIV可以為感染人的H5N6、H7N9和H9N2等亞型禽流感病毒提供內(nèi)部基因[13-15]。以上研究結(jié)果表明，H6亞型AIV存在潛在的直接感染哺乳動(dòng)物和人的可能性，且嚴(yán)重威脅到人類的公共衛(wèi)生安全。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室自2009年以來(lái)一直對(duì)廣西地區(qū)活禽交易市場(chǎng)進(jìn)行AIV流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，已經(jīng)從表觀健康的家禽體內(nèi)分離到多株不同HA和NA組合的H6亞型AIV[16]。由于H6亞型AIV經(jīng)常與H5、H9等亞型AIV同時(shí)存在于家禽體內(nèi)，當(dāng)不同亞型AIV同時(shí)感染一只家禽時(shí)，就大大增加了流感病毒基因重排的概率，為產(chǎn)生新的禽流感病毒株創(chuàng)造了便利條件。廣西處于華南“流感中心”，且與禽流感疫情十分復(fù)雜的越南山水相連，同時(shí)還處在候鳥遷徙路線上，地理位置十分特殊。筆者于2017年從廣西活禽市場(chǎng)分離到1株具有代表性的雞源H6N6病毒，進(jìn)行全基因組測(cè)序并分析其遺傳演化情況，同時(shí)對(duì)部分重要生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定，以期了解H6亞型AIV在廣西地區(qū)的遺傳進(jìn)化及變異情況，為該亞型禽流感病毒的研究和防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與雞胚。

2017年從廣西地區(qū)某活禽交易市場(chǎng)采集表觀健康雞群的咽喉和泄殖腔棉拭子，置于含有4種抗生素的保存液中，低溫運(yùn)輸至廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離和鑒定。9～11日胚齡SPF雞胚，購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑。DNA/RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞、PCR產(chǎn)物快速連接載體和DNA Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;高保真2× PCR Mix、隨機(jī)引物、dNTP、MLV 反轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑均購(gòu)自寶生物工程（北京）有限公司;6′-Sialyllactose-PAA-biotin（6′SL-PAA）和3′-Sialyllactose-PAA-biotin（3′SL-PAA）購(gòu)自GlycoTech公司;TMD底物溶液購(gòu)自北京天根生物科技有限公司;Streptavidin-HRP購(gòu)自美國(guó)R&D systems公司;其余試劑購(gòu)自商業(yè)公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)及合成。參照文獻(xiàn)[17]及GenBank中收錄的相關(guān)H6亞型AIV的全基因序列，利用 Primer Premier 和Oligo軟件設(shè)計(jì)多對(duì)A型流感病毒基因組8個(gè)節(jié)段的引物，用于擴(kuò)增A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）全基因，引物由南寧捷瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離、鑒定及空斑純化。將不同活禽交易市場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)采集的雞群棉拭子樣品低溫快速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室處理，經(jīng)離心取上清液接種于10日胚齡SPF雞胚尿囊腔，每個(gè)樣品接種2枚雞胚，0.2 mL/枚，37? ℃孵化96 h;收獲24 h后死亡和未死亡的雞胚尿囊液，分別采用血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，用針對(duì)H1～H16亞型AIV以及新城疫病毒的多抗血清對(duì)具有HA效價(jià)的樣品進(jìn)行HI試驗(yàn)，初步確定樣品的HA亞型。將HI試驗(yàn)確定為H6亞型AIV病毒株尿囊液接種于雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），通過(guò)空斑純化的方法進(jìn)行連續(xù)3輪的克隆純化，再接種SPF雞胚對(duì)純化的毒株進(jìn)行增殖，將收獲尿囊液經(jīng)HI試驗(yàn)鑒定后，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒RNA提取與RT-PCR擴(kuò)增。

取經(jīng)空斑純化后增殖的病毒尿囊液，使用RNA 抽提試劑盒按照使用說(shuō)明書提取其病毒總RNA，利用流感病毒Uni-12通用引物及反轉(zhuǎn)錄酶按照其使用說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)不同的基因引物設(shè)計(jì)不同的PCR程序，分別對(duì)各基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收純化及克隆測(cè)序。

將目的片段從瓊脂糖凝膠切下后，按照膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收純化，然后與快速克隆載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液送交深圳華大基因（廣州）公司進(jìn)行序列測(cè)序。

1.2.4 序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析。利用DNASTAR軟件對(duì)毒株各基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和整理，并將比對(duì)結(jié)果與NCBI網(wǎng)站中的相關(guān)參考毒株進(jìn)行分析。同時(shí)，選擇一些具有代表性的參考毒株基因序列及不同宿主來(lái)源的H6亞型AIV基因序列，應(yīng)用MEGA6.0軟件對(duì)分離株和參考株的各基因進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建其遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)而分析分離毒株的遺傳演化情況。

1.2.5 分離株受體親和特性的測(cè)定。根據(jù)病毒的HA效價(jià)，用包被緩沖液將分離毒株尿囊液稀釋至7log2，將準(zhǔn)備好的病毒液100 μL/孔加入96孔ELISA板，放置4 ℃冰箱中包被過(guò)夜，設(shè)置空白對(duì)照;將6′SL-PAA及3′SL-PAA分別設(shè)置4個(gè)不同的稀釋梯度，每個(gè)稀釋梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，病毒和受體反應(yīng)終止后，用酶標(biāo)儀讀取樣品在450 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離鑒定及純化結(jié)果 收集HA試驗(yàn)效價(jià)大于或等于4log2的雞胚尿囊液樣品，進(jìn)行HI試驗(yàn)。編號(hào)為286C10樣品的尿囊液HI試驗(yàn)結(jié)果表明，其僅與H6亞型AIV抗血清發(fā)生作用，而與其他HA亞型AIV和新城疫病毒抗血清不存在任何交叉作用，其結(jié)果初步確定該分離株為H6亞型AIV。該毒株的尿囊液接種于CEF細(xì)胞上，經(jīng)過(guò)3輪的空斑純化后，經(jīng)過(guò)SPF雞胚增殖，通過(guò)HA試驗(yàn)測(cè)得其效價(jià)為26。同時(shí)，通過(guò)HI試驗(yàn)測(cè)定其對(duì)抗H6亞型AIV陽(yáng)性血清的HI效價(jià)為8log2。

2.2 病毒全基因RT-PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增均得到與引物設(shè)計(jì)預(yù)期大小相符的目的基因條帶。各目的基因經(jīng)克隆和PCR鑒定成功后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件進(jìn)行比對(duì)，將拼接后的基因序列進(jìn)行同源性BLAST比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果表明，HA和NA基因與H6及N6亞型AIV的核苷酸同源性最高。因此，將該分離毒株命名為A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）。

2.3 分離株各基因片段的序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析

各個(gè)基因經(jīng)過(guò)比對(duì)拼接形成病毒的全基因序列，各片段與GenBank中核苷酸同源性最高的病毒株進(jìn)行BLAST分析，分析結(jié)果見表1。A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6） HA基因比對(duì)結(jié)果與廣東雞源分離株A/chicken/Guangdong/G3249/2014（H6） 相似性最高，核苷酸同源性為98.53%。序列分析結(jié)果表明，其HA 基因開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)1 701 bp。HA1和HA2蛋白裂解位點(diǎn)不存在3個(gè)以上連續(xù)的堿性氨基酸，具有低致病性AIV的分子特征。HA受體結(jié)合位點(diǎn)第226（參照H3亞型編號(hào)）位氨基酸未發(fā)生Q226L突變。HA基因遺傳進(jìn)化樹分析表明，該毒株屬于歐亞進(jìn)化譜系的ST339-like分支，與北美分支H6病毒株有一定的遺傳距離（圖1）。NA基因的ORF全長(zhǎng)為1 413 bp，與A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）的NA基因核苷酸同源性最高的毒株為江西分離株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6），核苷酸同源性為98.80%。PB2基因的ORF全長(zhǎng)為2 280 bp，與 A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）的PB2基因核苷酸同源性最高的毒株為越南分離株 A/chicken/Vietnam/H7F-14-BN4-339/2014（H9N2），核苷酸同源性為99.25%。PB1基因的ORF全長(zhǎng)為2 274 bp，與 PB1 基因核苷酸同源性最高的毒株是廣東分離株A/chicken/Shenzhen/1377/2013（H9N2），核苷酸同源性為96.26%。PA基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為2 151 bp，同源性最高的毒株為A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性為98.47%。NP基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 497 bp，與其核苷酸同源性最高的毒株是 A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性為 98.13%。M 基因編碼區(qū)全長(zhǎng)982 bp，與M基因核苷酸同源性最高的毒株為A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性為99.12%。NS基因編碼區(qū)全長(zhǎng)838 bp，核苷酸同源性最高的毒株為 A/chicken/Guangdong/SIC41/2015（H9N2），核苷酸同源性為99.55%。

2.4 受體親和性測(cè)定結(jié)果 通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)純化的毒株進(jìn)行了受體結(jié)合特異性的測(cè)定，結(jié)果表明分離毒株雖然優(yōu)先選擇與SAα2，3受體結(jié)合，但也同時(shí)具有與SAα2，6受體的親和特性，但結(jié)合能力存在差異（其與α-2，3唾液酸受體結(jié)合能力稍強(qiáng)，見圖2），表明該雞源H6N6 AIV 同時(shí)具備與α-2，3和α-2，6唾液酸受體結(jié)合的特性，具有潛在的感染人的風(fēng)險(xiǎn)。

3 討論

AIV由于亞型眾多，極易發(fā)生變異和重組，研究表明部分亞型AIV能夠跨越種屬屏障感染直接感染哺乳動(dòng)物和人，不但給全球養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且還會(huì)威脅到人類公共衛(wèi)生安全[18]。高致病性H5和H7亞型AIV及低致病性的H9亞型AIV分別因其對(duì)家禽的高致死率及在家禽中的廣泛流行而受到人們的普遍關(guān)注[19]。低致病性的H6亞型AIV雖然在自然界中普遍存在，但由于其一般不引起宿主產(chǎn)生明顯的臨床癥狀和死亡，因而一直沒(méi)有引起人們對(duì)它的重視。2014年5月在我國(guó)四川地區(qū)首次出現(xiàn)人感染H5N6亞型 AIV 病例，通過(guò)對(duì)毒株基因組分析發(fā)現(xiàn)該病毒的NA基因片段來(lái)自禽源H6N6亞型病毒[20]。另外，有報(bào)道利用血清學(xué)調(diào)查的方法在美國(guó)和中國(guó)的健康人群中發(fā)現(xiàn)了一定比例的H6亞型AIV抗體陽(yáng)性人員[21]。因此，H6亞型AIV引起的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題已經(jīng)越來(lái)越引起人們的重視。

廣西地處我國(guó)華南地區(qū)，同時(shí)又處于全球8大候鳥遷徙路線之一的東亞和澳大利亞線路上，每年都有大量遷徙的候鳥途經(jīng)此地。此外，廣西是全國(guó)的養(yǎng)禽大省，與廣東等省份有著頻繁的活禽貿(mào)易往來(lái)，還與流感疫情復(fù)雜的越南相鄰，加上廣西地區(qū)人口稠密，活禽市場(chǎng)遍布城鄉(xiāng)，水禽養(yǎng)殖規(guī)模大，且有放養(yǎng)畜禽的習(xí)慣，人與家禽、野鳥和候鳥的生活空間高度重疊，密切接觸，這些都為流感病毒變異株或新亞型AIV的產(chǎn)生創(chuàng)造了理想的條件，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生的安全。當(dāng)不同亞型和不同宿主來(lái)源的AIV在感染同一宿主或細(xì)胞時(shí)，病毒可以通過(guò)交換某些基因片段發(fā)生基因重排，進(jìn)而產(chǎn)生新的子代重配病毒，研究也表明自然界往往會(huì)發(fā)生多重AIV重組[22-23]。通過(guò)對(duì)雞源A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6） 病毒的全部基因組序列進(jìn)行分析以及與其他亞型病毒株的比較顯示，該研究中的病毒基因組的序列來(lái)源可能各不相同：HA、PB1和NS基因來(lái)源于廣東的雞，NA基因來(lái)源于江西的鴨，PB2基因來(lái)源于越南的雞，PA、NP和M基因來(lái)源于廣西的鵝;同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)該病毒的HA、NA、PA、NP和M基因來(lái)源H6亞型AIV，PB2、PB1和NS基因基因來(lái)源H9N2亞型AIV，推測(cè)A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）可能是由不同地區(qū)不同宿主來(lái)源的H6和H9亞型 AIV通過(guò)基因重組產(chǎn)生的一株新的重配毒株，由此可見該病毒基因來(lái)源的復(fù)雜性。正是因?yàn)閺?fù)雜來(lái)源及重配導(dǎo)致目前AIV毒株的生物學(xué)特性也變得日益復(fù)雜化，同時(shí)也給AI 的科學(xué)綜合防控造成新的難題。

已有的研究發(fā)現(xiàn)禽流感病毒HA蛋白某些受體結(jié)合位點(diǎn)的特異性可以決定該病毒感染的宿主范圍[24]，A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）HA基因的226位受體結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有由Q變異為L(zhǎng)，說(shuō)明該毒株存在與哺乳動(dòng)物受體結(jié)合的潛在可能性較小。該研究中AIV受體結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果也顯示A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）具備與α-2，6唾液酸受體結(jié)合的特性（即跨越種屬屏障感染哺乳動(dòng)物），該毒株其他相關(guān)的生物學(xué)特性有待進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，家禽中H6N6亞型AIV的分離率逐漸升高，H6N6亞型AIV極易與其他亞型的禽流感病毒在宿主體內(nèi)發(fā)生基因重配進(jìn)而形成新的流感病毒重組毒株或變異株，對(duì)畜牧業(yè)健康發(fā)展和對(duì)人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。因此，深入研究H6N6 AIV的起源、進(jìn)化和生物學(xué)特性等的變化對(duì)H6亞型禽流感病毒的科學(xué)防控具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]譚偉，徐倩，謝芝勛.禽流感病毒研究概述[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014，33（1）：194-199.

[2] 秦愛(ài)建.禽流感病毒[M]//韋平，秦愛(ài)建.重要?jiǎng)游锊《痉肿由飳W(xué).北京： 科學(xué)出版社，2008：3-27.

[3]王熹婧，朱銀川，龐夏鳳，等.H6N6亞型禽流感病毒進(jìn)化演變及跨種屬傳播研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2019，35（6）：558-562.

[4] 陳思，崔鵬飛，關(guān)立崢，等.一株H6N6亞型野鳥禽流感病毒全基因組序列分析以及對(duì)小鼠的感染性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，39（6）：431-434.

[5] 陳佳琪，嵇辛勤，段志強(qiáng)，等.一株鴨源H6N6亞型禽流感病毒的遺傳進(jìn)化及致病性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38（3）：175-179.

[6] HUANG K，ZHU H C，F(xiàn)AN X H，et al.Establishment and lineage replacement of H6 influenza viruses in domestic ducks in southern China[J].J Virol，2016，86（11）：6075-6083.

[7] WU H B，LU R F，PENG X M，et al.Isolation and genetic characterization of novel reassortant H6N6 subtype avian influenza viruses isolated from chickens in eastern China[J].Arch Virol，2016，161：1859-1872.

[8] YUAN R Y，ZOU L R，KANG Y F，et al.Reassortment of avian influenza A/H6N6 viruses from live poultry markets in Guangdong，China[J].Front Microbiol，2016，7：1-8.

[9] KIM H R，LEE Y J，LEE K K，et al.Genetic relatedness of H6 subtype avian influenza viruses isolated from wild birds and domestic ducks in Korea and their pathogenicity in animals[J].J Gen Virol，2010，91：208-219.

[10] 葛志闖，孫文強(qiáng)，劉東，等.一株鴨源H6N6亞型禽流感病毒的基因組測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析[J].中國(guó)家禽，2017，39（14）：21-28.

[11] 王飛.低致病性禽流感病毒感染人的機(jī)制研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[12] 孫增輝，朱銀川，王熹婧，等.H6N1亞型禽流感病毒跨種屬傳播研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2017，33（3）：236-240.

[13] 黎玉蓮.2株H5N6亞型禽流感病毒的序列分析和致病性研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[14] 祁思敏，宋勇春，崔侖標(biāo)，等.1株H6N6亞型禽流感病毒分子遺傳特性分析[J].微生物與感染，2017，12（5）：287-293.

[15] 張爍，林宏文，袁潤(rùn)余，等.H6N6亞型禽流感病毒廣東分離株分子遺傳演化分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45（6）：989-996.

[16] PENG Y，XIE Z X，LIU J B，et al.Epidemiological surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus （LPAIV） from poultry in Guangxi Province，Southern China[J].PLoS One，2013，8（10）：1-7.

[17] HOFFMANN E，STECH J，GUAN Y，et al.Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J].Arch Virol，2001，146：2275-2289.

[18] 張蔚，施一.禽流感病毒跨種傳播的分子機(jī)制[J].生命科學(xué)，2015，27（5）：539-548.

[19] 顧敏，彭大新，劉秀梵.我國(guó)H9N2亞型禽流感病毒的流行和進(jìn)化特點(diǎn)[J].生命科學(xué)，2015，27（5）：531-538.

[20] 李曉丹，張燁，鄒淑梅，等.高致病性A（H5N6）亞型禽流感病毒全基因組序列測(cè)定方法的建立[J].病毒學(xué)報(bào)，2017，33（1）：19-23.

[21] 王熹婧.雞源禽流感病毒H6N6亞型對(duì)小鼠致病性以及在豬和人呼吸道組織復(fù)制的研究[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2019.

[22] 丁晴微，鄧國(guó)華，施建忠，等.兩株鴨源H6N2亞型禽流感病毒的序列分析及對(duì)雞的致病性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（4）：270-275.

[23] 熊文婕，謝芝勛，曹國(guó)敏，等.2016～2017年防城港市活禽市場(chǎng)低致病性禽流感病毒監(jiān)測(cè)分析[J].中國(guó)家禽，2018，40（9）：70-72.

[24] 徐曉龍，包紅梅，陳化蘭，等.影響禽流感病毒致病性和傳播的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36（2）：165-168.

基金項(xiàng)目 廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA17204057）;廣西科技基地和人才專項(xiàng)項(xiàng)目（桂科AD17195083）;廣西“八桂學(xué)者”專項(xiàng) （2019-79）;國(guó)家“萬(wàn)人計(jì)劃”領(lǐng)軍人才專項(xiàng)（2016-37-88）。

作者簡(jiǎn)介 李孟（1981—），男，河南南陽(yáng)人，副研究員，博士，從事病原分子生物學(xué)研究。*通信作者，研究員，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

收稿日期 2020-03-22