牛血清中6種外源性病毒的液相芯片檢測(cè)方法建立

王艷　嚴(yán)敏鳴　黃忠榮　張磊萍　張強(qiáng)　林穎崢　熊煒　李樹(shù)清

摘要 為建立牛血清中6種外源性病毒（BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV）的液相芯片檢測(cè)方法，根據(jù)6種病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)雜交偶聯(lián)檢測(cè)，利用Luminex檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)，建立了牛血清中6種外源性病毒的快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該試驗(yàn)建立的檢測(cè)體系具有良好的特異性和敏感性，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)50拷貝/反應(yīng)。該研究初步建立了同時(shí)檢測(cè)牛血清中6種外源性病毒的液相芯片檢測(cè)方法，為牛血清的質(zhì)量把關(guān)提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 牛血清;外源性病毒;液相芯片

中圖分類(lèi)號(hào) S 852.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）23-0116-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.028

Establishment of Liquichip Detection Method of Six Kinds of Exogenous Viruses in Bovine Serum

WANG Yan1，YAN Min-ming2，HUANG Zhong-rong3 et al

（1. Animal， Plant and Food Inspection and Quarantine Technology Center， Shanghai Customs， Shanghai 200135;2. Animal Disease Prevention and Control Center of Pudong New Area in Shanghai， Shanghai 200120; 3.Shanghai Customs， Shanghai 200135）

Abstract In order to establish the liquichip detection method of 6 kinds of exogenous viruses（BVDV，BPV，BTV，REOV，BPyV，RABV）in bovine serum，on the basis of the specific primers and their corresponding oligonucleotide probes of 6 kinds of viruses were designed， synthesized and modified. Specific probe labeled with biotin was prepared and coupled with fluorescence-coded microspheres. Luminex detector was used to detect fluorescence signal，a quick detection method of 6 kinds of exogenous viruses in? bovine serum was established. The results showed that this assay method displayed good specificity and sensitivity. The sensitivity test indicated the detection sensitivity could reach 50 copies. A liquichip detection method for? six kinds of exogenous viruses in bovine serum was preliminarily established，which provided the technology supports for the quality control of bovine serum.

Key words Bovine serum;Exogenous virus;Liquichip

隨著我國(guó)生物醫(yī)藥的發(fā)展，對(duì)血清的需求以每年25%的速度增長(zhǎng)，對(duì)外依存度越來(lái)越高。牛血清在疫苗生產(chǎn)中被大量使用，其質(zhì)量直接影響生物制品的質(zhì)量安全，特別是病毒類(lèi)生物活性物質(zhì)污染會(huì)嚴(yán)重影響制品的質(zhì)量安全。日本東京大學(xué)的Harasawa等[1]報(bào)道，在5批人用麻風(fēng)腮及風(fēng)疹疫苗成品中檢出了牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）RNA。Brown等[2]報(bào)道，由于使用了污染BVDV的胎牛血清，導(dǎo)致了胎牛腎細(xì)胞、牛腎細(xì)胞、牛鼻甲骨細(xì)胞、豬腎細(xì)胞、貓腎細(xì)胞核Vero細(xì)胞等多種細(xì)胞系的污染[3]。

牛腹瀉病毒是疫苗生產(chǎn)中常見(jiàn)的污染物及嚴(yán)重的外源性致病原之一，因此牛血清中BVDV的檢測(cè)尤為重要[4]。牛細(xì)小病毒（bovine parvovius， BPV）、藍(lán)舌病毒（bluetongue virus， BTV）、呼腸孤病毒（reoviridae， REOV）、牛多瘤病毒（bovine ploymavirus， BPyV）、狂犬病病毒（rabies virus， RABV）也是牛血清中重要的病原外源因子，牛血清的質(zhì)量應(yīng)嚴(yán)格要求[5-7]，由于牛血清質(zhì)量的把關(guān)是生物制品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，原上海檢驗(yàn)檢疫局曾在進(jìn)口胎牛血清中檢測(cè)出牛病毒性腹瀉病毒[8]，因此建立外源性病毒的快速檢測(cè)方法將有助于把控牛血清質(zhì)量，防止外源性病毒的污染。筆者以牛血清中BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV 6種重要外源性病毒為研究對(duì)象，建立可以同時(shí)檢測(cè)的液相芯片檢測(cè)方法，并對(duì)其靈敏度、特異性等指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉素-親和素（SA-PE）采購(gòu)自Invitrogen公司;6種不同編號(hào)的熒光編碼微球購(gòu)自Bio-Rad公司;Luminex200為L(zhǎng)uminex公司產(chǎn)品;BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV質(zhì)粒由上海海關(guān)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存，濃度為 500拷貝/μL，保存于-20 ℃下備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 探針及引物的設(shè)計(jì)和合成。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的基因序列，應(yīng)用Primer 5.0序列分析軟件進(jìn)行序列分析、引物、探針設(shè)計(jì)，并分別在5′端和3′端進(jìn)行修飾（表1）。引物、探針?biāo)椭辽虾Ｉ锕こ逃邢薰煞莨竞铣伞?/p>

1.2.2 單對(duì)引物及多重引物的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)。利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)目標(biāo)質(zhì)粒進(jìn)行單重和多重?cái)U(kuò)增，以鑒定引物的特異性。PCR反應(yīng)體系：10×buffer（Mg2+） 2.5 μL、dNTP （2.5 mol/L）1.0 μL、引物 1.0 μL、模板 2.0 μL、Taq 0.5 U、ddH2O 18.5 μL，總PCR體系25 μL。多重PCR引物的加入量REOVF/R 1.5 pmol，BPVF/R 2.0 pmol，BTVF/R 3.0 pmol，BVDVF/R 2.0 pmol，BPyVF/R 1.5 pmol，RABVF/R 2.0 pmol。PCR擴(kuò)增程序如下：95? ℃預(yù)變性 10 min;95? ℃ 30 s，52? ℃ 30 s，72? ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸1 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 微球探針的交聯(lián)。在EP管中加入相應(yīng)的熒光編碼微球100 μL（表2），5 000 r/min離心10 min 后棄上清，并用ddH2O沖洗2次;用100 μL 0.1 mol/L pH 6.0的MES將之懸浮后，加入0.2 nmol/μL探針3 μL，充分混勻后，加入15% EDC，用鋁箔紙包裹EP 管于37 ℃條件下放置30 min;離心吸去上清，用0.1% SDS洗滌2次后，用50 μL TE緩沖液（pH 8.0）重新懸浮后，4? ℃下避光保存，備用[9-10]。

1.2.4 雜交捕獲檢測(cè)。取PCR產(chǎn)物5 μL，加入微球溶液25 μL（熒光編碼微球的數(shù)量約80個(gè)/μL），充分混合均勻后按照以下步驟進(jìn)行雜交反應(yīng)：94? ℃變性3? min，50 ℃孵育30? min;隨后加入0.2 μg/μL SA-PE 70 μL，50 ℃孵育20? min，孵育結(jié)束后直接上機(jī)讀取信號(hào)（試驗(yàn)須在微球個(gè)數(shù)不小于20個(gè)且背景空白熒光強(qiáng)度不高于300的情況下才成立）。

1.2.5 探針特異性的檢測(cè)。每個(gè)反應(yīng)體系25 μL，將6種不同編碼的熒光微球混合，與每一對(duì)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交。

1.2.6 液相芯片檢測(cè)體系的建立。取20份其他檢測(cè)方法檢測(cè)為陰性的樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算每種微球平均熒光強(qiáng)度（median fluorescent intensity，MFI）的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的值作為對(duì)應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)的cut-off值，確定閾值，高于cut-off值就視為陽(yáng)性。

1.2.7 液相芯片檢測(cè)體系特異性。將牛腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、藍(lán)舌病毒、呼腸孤病毒、牛多瘤病毒、狂犬病毒、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenzavirus 3，BPIV3）、傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、赤羽病病毒（Akabane disease virus， ADV）的DNA作為PCR擴(kuò)增模板，利用已建立的檢測(cè)方法進(jìn)行雜交檢測(cè)。

1.2.8 液相芯片檢測(cè)體系靈敏度。將質(zhì)粒BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV進(jìn)行5、10、50倍稀釋?zhuān)⒎謩e作為PCR擴(kuò)增模板，利用已建立的檢測(cè)方法進(jìn)行雜交檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果 擴(kuò)增結(jié)果表明，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性（圖1）。

2.2 探針特異性檢測(cè) 6種混合微球?qū)我灰飻U(kuò)增產(chǎn)物的雜交檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

以上數(shù)據(jù)顯示，混合的6種探針能特異性識(shí)別捕獲引物，表明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針具有良好的特異性。

2.3 液相芯片檢測(cè)體系的建立

20份陰性樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用于液相芯片檢測(cè)方法閾值的確定，計(jì)算MFI的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，閾值=42.15+3×10.62=74.01。

2.4 液相芯片檢測(cè)體系特異性

特異性檢測(cè)結(jié)果表明，建立的液相芯片體系對(duì)REOV、BPV、BTV、BVDV、BPyV、RABV產(chǎn)生特異性反應(yīng);與牛血清其他重要病原不產(chǎn)生反應(yīng)，表明建立的液相芯片檢測(cè)體系具有良好的特異性（表4）。

2.5 液相芯片檢測(cè)體系靈敏度 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，所建立的檢測(cè)體系的靈敏度為50拷貝/反應(yīng)。

3 討論

動(dòng)物疫苗的主要作用是預(yù)防傳染病。動(dòng)物疾病傳入某一國(guó)家，其最主要的風(fēng)險(xiǎn)途徑是通過(guò)進(jìn)口活動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品，通過(guò)疫苗進(jìn)口傳入疾病則較為少見(jiàn)。但是，由于動(dòng)物疫苗本身產(chǎn)品的特殊性，在疫苗生產(chǎn)期間若使用的種子毒株、細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物或動(dòng)物源性成分被污染，或發(fā)生交叉污染，或疫苗本身滅活工作沒(méi)有做好，動(dòng)物疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中就會(huì)被污染。此類(lèi)污染疫苗一經(jīng)使用，就會(huì)將病原直接傳入動(dòng)物體內(nèi)。為此，對(duì)進(jìn)口動(dòng)物疫苗進(jìn)行病毒安全性研究，為控制其風(fēng)險(xiǎn)提供有力保障。該研究利用液相芯片技術(shù)，建立了能特異性檢測(cè)BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV 6種病原的液相芯片檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法能夠?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行快速檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度達(dá)50拷貝/反應(yīng)，特異性好。

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基金項(xiàng)目 上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研項(xiàng)目（16DZ0501502）。

作者簡(jiǎn)介 王艷（1981—），女，江蘇南通人，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，從事動(dòng)物檢疫工作。

收稿日期 2020-04-15;修回日期 2020-05-12