不同花椒品種精油的抗氧化能力分析與比較試驗初報

吳朝暄

摘 要 為研究不同種花椒精油的抗氧化能力，使用ABTS法、DPPH法、β-胡蘿卜素漂白法、FARP法對不同花椒品種精油進行抗氧化分析。結(jié)果表明，竹葉椒的抗氧化能力尤為突出，其次是大紅袍，隨后是豆椒。雖然竹葉椒是一種藥用價值高于食用價值的花椒品種，但是在抗氧化能力方面高于其他三種花椒，這取決于其得天獨厚的生長環(huán)境，即生于海拔2 300 m的山坡疏林、灌叢中及路旁，分布于華東、中南、西南及陜西、甘肅、臺灣等地，只有在6—8月果實成熟時才能采收。

關鍵詞 花椒;抗氧化;精油

中圖分類號：S432.2+2 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.30.071

植物精油是一類天然植物次生代謝物，具有殺菌、抗病毒和抗氧化等生物活性，在香料、食品、制藥及農(nóng)業(yè)害蟲防治等方面得到了廣泛應用。本研究提取了產(chǎn)自全國各地將近22余種不同花椒籽的精油，并采用ABTS法、DPPH法、β-胡蘿卜素漂白法、FARP法進行抗氧化分析，為花椒精油在食品、醫(yī)療保健品等方面的加工應用提供參考[1-2]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗儀器：722/722S型光柵分光光度計（上海精密儀表儀器有限公司），BS200S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），CN69M/FW80高效植物樣品粉碎機（北京中西遠大科技有限公司）。

試驗材料：共22種花椒，見表1。

化學試劑：乙醇、醋酸、無水硫酸鈉，天津化學試劑廠;北京中西科儀科技有限責任公司的二苯代苦味肼基（DPPH）;Sigma公司的2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）;上海伊卡生物技術有限公司的三吡啶基三嗪（TPTZ）;海星生物科技有限公司的亞油酸β-胡蘿卜素;美國AlfaAesar公司吐溫80;上海耐因公司的HCl;K2S2O8;FeCl3·6H2O;氯仿。

1.2 方法

1.2.1 精油的提取

參照李大強等的方法，用CN59M/FW80高效植物樣品粉碎機將花椒原料粉碎，稱取粉碎原料100 g，加入

1 000 mL蒸餾水浸泡12 h，然后進行蒸餾，蒸餾2～3 h，將餾出液用冷凝水冷凝收集，然后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)并使用無水硫酸鈉干燥，即可獲得精油[3]。22組樣品依次使用此方法進行精油提取并編號，并將精油放置在4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 DPPH自由基清除率測定

參照陸占國等的方法，用無水酒精配制濃度為

6.0 mg·mL-1的精油溶液，分別將2.0 mL樣品溶液和

2.0 mL濃度為10 mmol·L-1的DPPH溶液混勻后暗處放置30 min，以無水乙醇作參比，在517 nm處測定其吸光值A;同樣測定2.0 mL樣品溶液與2.0 mL無水乙醇混合后

517 nm處的吸光值A0;再測定2.0 mL DPPH溶液與

2.0 mL無水乙醇混合液在517 nm處的吸光值A1，按公式（1）計算其清除率[4]。

（1）

1.2.3 ABTS自由基清除率測定

參照朱玉昌等的方法配制2 mmoL·L-1 ABTS溶液，吸取50 mL上述溶液與200 mL K2S2O8溶液（70 mmoL·L-1）

混合，暗處放置12～16 h，得到ABTS自由基溶液。用PBS（pH 7.4，0.1 moL·L-1）緩沖液將ABTS自由基溶液稀

釋，使其在745 nm下的吸光度為0.70±0.20[5]。用無水乙醇配制濃度為6.0 mg·mL-1的精油溶液，取0.5 mL稀釋溶液，加入4.5 mL ABTS自由基溶液，在745 nm處測其吸光值A，按公式（2）計算清除率：

（2）

式中，A0為ABTS自由基溶液的吸光度，A為加精油溶液后的吸光度。

1.2.4 FRAP法測定抗氧化活性

參照Chaillou LL等的方法，將300 mol·L-1的醋酸緩沖液（pH 3.6）、20 mmoL·L-1 FeCl3·6H2O溶液、10 mmol·L-1

TPTA溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）以10∶1∶1（體積比）混合，得TPTA工作液[6]。準確吸取樣品溶液0.3 mL，加入

2.7 mL預熱至37 ℃的TPTZ工作液，搖勻后放置10 min，

于595 nm波長處測其吸光度，以無水乙醇代替樣品加入FRAP工作液作為空白，每個樣品做3次平行試驗.由反應后吸光度在標準曲線上獲得的相應的Trolox×質(zhì)量分數(shù)定義為FRAP值（mg Trolox/g提取物）。

1.2.5 β-胡蘿卜素漂白法測定抗氧化活性

參照Shah MA等的方法，將1 mL含有β-胡蘿卜素（1 mg·mL-1）的氯仿溶液置于梨形瓶，加入40 μL亞油酸和400 μL吐溫80，然后于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓去除氯仿，再加入100 mL蒸餾水，于混勻器中形成乳化液。取0.2 mL各種植物提取物（稀釋到合適質(zhì)量濃度）和

4.8 mL乳化液于試管中，然后將所有試管置于50 ℃恒溫水浴鍋中，在120 min后測定反應終點在470 nm波長下的吸光度值，對照管不含試樣，以體積分數(shù)為70%乙醇代替[7]。

β-胡蘿卜素的清除率用下式進行計算：

（3）

其中A0s表示樣品在0 min時的吸光度，A∞s是樣品在終點的吸光度，A0c是空白對照樣品在0 min時的吸光度，A∞c是空白對照樣品在終點的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 22種精油的提取率

經(jīng)過提取發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)于陜西省鳳縣和隴南市武都區(qū)的大紅袍花椒樣品出油率尤為突出，分別是5.50%、5.40%。甘肅省天水市秦安縣郭嘉鎮(zhèn)的油椒和天水市張家川回族自治縣的油椒在供試油椒品種中出油率略高，分別是3.0%、2.3%;靜寧縣仁大鄉(xiāng)南門村的豆椒出油率為2.2%，云南省邵通市永善縣和四川金陽的青花椒出油分別為5.4%、5.0%，湖南祁陽的竹葉椒出油率則是1.8%，

詳見表1。

2.2 不同品種的抗氧化能力

2.2.1 DPPH自由基清除率

如圖1所示，在14組樣品中，處于相同的6.0 mg·mL-1濃度，清除率最高的三個樣品是10號定西臨洮辛店鎮(zhèn)杜家村、6號河南省蘭考縣、11號四川漢源，清除率分別是91.39%、91.06%、90.86%。

如圖2所示，縱坐標是DPPH自由基清除率，橫坐標中15～18號代表的是油椒，19號是豆椒，20號、21號是青花椒，22號是竹葉椒。油椒清除率最高的是18號樣品，產(chǎn)地是莊浪，清除率為91.55%，19號樣品靜寧縣仁大鄉(xiāng)南門村豆椒清除率為90.65%，青花椒清除率最高的是20號樣品，產(chǎn)地四川省金陽縣，清除率為91.44%，22號樣品竹葉椒產(chǎn)地湖南祁陽，清除率為91.05%。

22個樣品共5個花椒品種，在DPPH試驗中每種樣品清除率的算數(shù)平均數(shù)分別為：竹葉椒91.50%，豆椒90.65%，青花椒89.80%，油椒88.40%，大紅袍88.13%。

2.2.2 ABTS自由基清除率

如圖3所示，在圖中，清除率最高的依次是8號隴南市武都區(qū)磨壩鄉(xiāng)、10號定西臨洮辛店鎮(zhèn)杜家村、1號咸陽禮泉縣紹陵鎮(zhèn)孫家村，相對應的清除率分別是71.83%、71.58%、71.39%。

如圖4所示，縱坐標是ABTS自由基清除率，橫坐標中15～18號代表的是油椒，19號是豆椒，20、21號是青花椒，22號是竹葉椒。油椒清除率最高的是17號樣品，產(chǎn)地是甘肅省天水市秦安縣郭嘉鎮(zhèn)，清除率為69.38%，19號樣品靜寧縣仁大鄉(xiāng)南門村豆椒清除率為68.6%，青花椒清除率最高的是20號樣品，產(chǎn)地四川省金陽縣，清除率為68.81%，22號樣湖南祁陽竹葉椒清除率為68.78%。

22個樣品共5個花椒品種，在ABTS試驗中每種樣品清除率的算數(shù)平均數(shù)分別為：大紅袍71.16%，豆椒68.60%，青花椒68.39%，竹葉椒67.97%，油椒65.33%。

2.2.3 FRAP法測定抗氧化活性

如圖5所示，縱坐標是FRAP值（mg Trolox/g提取物），橫坐標是14組大紅袍樣品，花椒精油的抗氧化活性從高到低依次是6號河南省蘭考縣>3號永靖縣三條硯鄉(xiāng)大臺子村>5號甘肅省天水市秦安縣。

如圖6所示，縱坐標是FRAP值，橫坐標中15～18號代表的是油椒，19號是豆椒，20號、21號是青花椒，22號是竹葉椒。油椒中抗氧化活性最強的是15號樣品，產(chǎn)地是天水市張家川回族自治縣;19號產(chǎn)地為靜寧縣仁大鄉(xiāng)南門村的豆椒樣品在這8種樣品中的抗氧化活性最強，青花椒抗氧化活性最強的是20號樣品，產(chǎn)地四川省金陽縣。

22個樣品中共5個花椒品種，在FRAP試驗中每個樣品FRAP值的算數(shù)平均數(shù)從大到小依次為豆椒>油椒>大紅袍>青花椒>竹葉椒。

2.2.4 β-胡蘿卜素漂白法測定抗氧化活性

如圖7所示，縱坐標是β-胡蘿卜素清除率，橫坐標是14組大紅袍樣品。由水浴前的吸光值和水浴后的吸光度進行公式換算得到抑制率。在14組樣品中，如果處于相同的6.0 mg·mL-1濃度，清除率最高的三個樣品是11號四川漢源、4號陜西鳳縣、8號隴南市武都區(qū)磨壩鄉(xiāng)，清除率分別是71.44%、70.82%、70.81%。

如圖8所示，縱坐標是β-胡蘿卜素清除率值，橫坐標中15～18號代表的是油椒，19號是豆椒，20號、21號是青花椒，22號是竹葉椒。油椒清除率最高的是16號樣品，產(chǎn)地是臨夏縣南塬鄉(xiāng)，清除率71.39%;19號樣品靜寧縣仁大鄉(xiāng)南門村豆椒清除率71.10%;青花椒清除率最高的是20號樣品，產(chǎn)地四川省金陽縣，清除率67.77%;22號樣湖南祁陽竹葉椒，清除率71.40%。

22個樣品共5個花椒品種，在β-胡蘿卜素清除率實驗中每種樣品清除率的算數(shù)平均數(shù)分別為：竹葉椒71.40%，豆椒71.10%，油椒70.32%，大紅袍68.74%，青花椒67.32%。

2.3 聚類分析

如圖9所示，使用4組不同的抗氧化實驗得到結(jié)果為數(shù)據(jù)基準，使用軟件進行聚類分析。以縱坐標為6這條線可將22組樣品一共分為三大類，第一大類中分別有陜西鳳縣的大紅袍、四川漢源的大紅袍、甘肅省臨夏縣南塬鄉(xiāng)的油椒、四川省金陽縣的青花椒、定西臨洮辛店鎮(zhèn)的大紅袍、咸陽禮泉縣紹陵鎮(zhèn)的大紅袍、三門峽靈寶縣西閆鄉(xiāng)的大紅袍、甘肅省平?jīng)鍪星f浪的油椒、榆林市西沙聚財巷的大紅袍、高峻區(qū)鹿苑鎮(zhèn)安宋村的大紅袍（其樣品號為4、11、16、20、10、1、14、18、7、9）。第二類中有甘肅省天水市秦安縣的大紅袍、天水市張家川回族自治縣的油椒、永靖縣三條硯鄉(xiāng)的大紅袍、靜寧縣仁大鄉(xiāng)南門村的豆椒、河南省蘭考縣的大紅袍、陜西省韓城桑樹坪鎮(zhèn)的大紅袍（其樣品號為5、15、3、19、6、2）。第三類中有甘肅省天水市秦安縣的油椒、湖南祁陽肖家鎮(zhèn)的竹葉椒、隴南市武都區(qū)磨壩鄉(xiāng)的大紅袍、天水市張家川回族大紅袍、云南邵通永善縣的大紅袍、陜西省富平縣塬原鄉(xiāng)的大紅袍（其樣品號為17、22、8、13、21、12）。

3 討論

3.1 ABTS清除能力

本實驗首先測定了22種花椒精油提取物的含量，結(jié)果表明，產(chǎn)于陜西鳳縣和隴南武都的花椒樣品出油率尤為突出，分別是5.50%、5.40%。通過ABTS自由基清除率法、FRAP測定法、β-胡蘿卜素漂白測定法和DPPH自由基清除率實驗，對各種花椒植物精油提的抗氧化活性進行評估。

ABTS在適當?shù)难趸瘎┳饔孟驴杀谎趸删G色的ABTS+自由基，在抗氧化物存在時ABTS+的產(chǎn)生會被抑制[8]，因此可以確定ABTS法可用于檢測抗氧化物清除ABTS+自由基的能力。

3.2 FRAP測定抗氧化物還原Fe3+-PTZ的能力

FRAP測定抗氧化物還原Fe3+-TPTZ的能力。這兩種方法的結(jié)果都以Trolox×為衡量標準，即1 g受試物清除自由基（或還原Fe3+）的能力相當于Trolox×清除自由基（或還原Fe3+）的量。本實驗結(jié)果表明，隴南市武都區(qū)磨壩鄉(xiāng)的大紅袍自由基能力最高。

3.3 β-胡蘿卜素漂白能力

β-胡蘿卜素漂白測定法的原理為乳狀漩濁液中的亞油酸氧化，生成的自由基與β-胡蘿卜素發(fā)生一定反應，引起β-胡蘿卜素的黃色衰減（A470值減?。?。β-胡蘿卜素漂白試驗結(jié)果卻和ABTS及FRAP法不一致。

綜合這3種抗氧化活性檢測法，可見花椒精油提取物的抗氧化作用方式有所差異。所以在評價抗氧化物總的抗氧化能力時，需要各種方法同時評價并互為補充，單獨使用一兩種抗氧化實驗方式不足以說明抗氧化物的抗氧化能力。

4 結(jié)論

綜合以上四個實驗（DPPH、ABTS、FRAP測定抗氧化物還原Fe3+-PTZ能力、β-胡蘿卜素漂白能力）可以證明，竹葉椒的抗氧化能力尤為突出，其次是大紅袍，隨后是豆椒，DPPH和β-胡蘿卜素漂白能力實驗表明竹葉椒的抗氧化能力最優(yōu)（清除率分別為91.50%、71.40%），并且微微高于大紅袍的抗氧化能力。雖然竹葉椒是一種藥用價值高于食用價值的花椒品種，但是在抗氧化能力方面高于其他三種花椒，這取決于其得天獨厚的生長環(huán)境，即生于海拔2 300 m的山坡疏林、灌叢中及路旁，分布于華東、中南、西南及陜西、甘肅、臺灣等地，只有在6—8月果實成熟時才能采收。

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（責任編輯：劉 昀）