基因編輯豬在農(nóng)業(yè)與生物醫(yī)學中的應用

戴偉龍 李榮陽 劉紅林

（南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇南京 210095）

豬是生物醫(yī)學中常用的疾病模型動物，也是肉類工業(yè)的重要動物物種。同人生理和遺傳學的相似性使豬成為疾病模型的理想模型。例如，X連鎖原發(fā)性免疫缺陷的征狀在豬身上比在小鼠身上能夠更好的重現(xiàn)，將白細胞介素2受體亞基γ（ILRG2）破壞后，人和豬的T細胞檢測均呈陰性，B細胞陽性，自然殺傷細胞陰性。豬肉也是肉類蛋白質(zhì)的重要來源。根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部的報告，在2017年中豬提供了超過90億kg的肉。隨著收入的增高和城市化的發(fā)展，人們的生活水平會逐漸上升，預計肉類消費量將明顯提高。然而，目前的肉類生產(chǎn)水平難以滿足人們不斷增長的需求。

通過基因工程的方法進行遺傳改良，既可以生產(chǎn)出應用于生物醫(yī)學的豬模型，也能提高肉用豬的生產(chǎn)力。遺憾的是，基因工程運用在豬身上的效率一直不高，因此限制了基因編輯豬在各個領域的應用。例如，第一個攜帶基因定向修飾的基因編輯豬的報道，比第一個基因敲除小鼠晚了10多年才出現(xiàn)，而且基因編輯豬僅在少數(shù)幾個領域出現(xiàn)。近年來，隨著基因組編輯技術的發(fā)展，基因工程的效率得到了明顯的提高，逐漸改變了基因編輯豬的生產(chǎn)和使用模式。因此，可用于生物醫(yī)學和農(nóng)業(yè)的豬模型數(shù)量急劇增加。本文，我們總結(jié)了基因組編輯系統(tǒng)是如何在豬身上開發(fā)和使用的，并討論其潛在的影響。

1 豬的傳統(tǒng)基因工程

與小鼠不同，目前還沒有建立豬多能干細胞系，導致制備攜帶定向修飾的基因編輯豬難度很大，從而阻礙了豬的基因研究和使用。為了建立可用于基因編輯豬生產(chǎn)的多能干細胞系，科學家們做了大量的研究，然而鮮有成功[7]。通過體細胞核轉(zhuǎn)移技術（SCNT），第一個克隆哺乳動物多莉羊的誕生，開啟了一條不必使用多能干細胞，生產(chǎn)基因編輯豬的新途徑。概況來說就是利用內(nèi)源性同源重組機制將定向修飾基因?qū)塍w細胞的基因組中，這些經(jīng)過基因修飾的體細胞被用作SCNT的供體，以生產(chǎn)基因編輯動物。這種方法的可行性首先在綿羊身上得到驗證，并迅速擴展到包括豬在內(nèi)的非嚙齒類動物。第一次克隆豬的報道出現(xiàn)之后，這種方法被用來生產(chǎn)第一批基因敲除豬。這些基因敲除豬缺乏編碼α-（1，3）-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的糖蛋白α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（GGTA1），該基因合成半乳糖-α-（1，3）-半乳糖（α-Gal），主要功能是在異種移植后引起超急性排斥。GGTA1修飾豬為利用豬模型向異種移植的應用奠定了基礎。

第一批基因敲除豬的出現(xiàn)引起了更多豬模型在生物醫(yī)學領域的應用。例如，缺乏功能性囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)（CFTR）基因的豬模型的應用，證明了豬模型在生物醫(yī)學領域的可適用性。該疾病的遺傳因素已被明確識別，但現(xiàn)有的CFTR嚙齒動物模型并沒有表現(xiàn)出CFTR患者中觀察到的典型癥狀，而豬具有較好的重現(xiàn)性[11]。與GGTA1基因敲除豬類似，將CFTR的定向破壞導入豬體細胞的基因組中，然后利用SCNT以產(chǎn)生CFTR基因敲除豬。當通過育種生產(chǎn)出同種豬模型時，豬（CFTR2/2）重現(xiàn)了CFTR患者的所有已知癥狀，證明了這種模型的實用性。但是由于體細胞的基因工程的效率極低，所有這些修飾都是以異種方式引入的，并且需要育種步驟來產(chǎn)生具有同種修飾的基因編輯豬。考慮到豬的妊娠期（114d）和達到性成熟天數(shù)（6個月左右），豬的一輪育種需要1年以上的時間。如果通過傳統(tǒng)方法培養(yǎng)少量的初代豬，那么需要經(jīng)過回交多個繁殖步驟，這將需要多年的育種計劃來產(chǎn)生足夠數(shù)量的基因編輯豬。此外，效率因供體細胞系的不同而有所差異。SCNT不僅高度費時并且技術難度大。更重要的是，通過SCNT出生的豬經(jīng)常突然死亡或出現(xiàn)與SCNT過程相關的并發(fā)癥。因此，SCNT引起的相關的并發(fā)癥阻礙了通過育種來擴大基因編輯豬模型的數(shù)量。

由于傳統(tǒng)的SCNT方法缺點較多，只有少量的基因編輯豬模型是通過SCNT生產(chǎn)的。因此，養(yǎng)豬界對提高基因編輯豬的生產(chǎn)效率產(chǎn)生了極大的興趣。近10年來，基因組編輯技術的發(fā)展和應用極大地改變了基因編輯豬的設計和生產(chǎn)過程。

2 基因組編輯技術的研究進展

基因組編輯技術的應用改變了制備基因編輯豬的方法?；蚪M編輯技術的基礎在于它能夠識別基因組上的特定序列，并引入位點特異性雙鏈斷裂（DSB）。由于DSB對細胞是有害的，可能會導致細胞死亡。在這個過程中主要有兩種DNA修復途徑參與：非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復（HDR）。修復途徑是一個有序的過程，每個修復途徑中都有特定的蛋白質(zhì)參與。因此，人們嘗試利用化學抑制劑來調(diào)節(jié)NHEJ和HDR的效率。目前，有三種不同類型的基因組編輯系統(tǒng)：鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）和成簇規(guī)則間隔短重復回文序列（CRISP/Cas9）系統(tǒng)。

ZFNs是第一個被開發(fā)用于修飾哺乳動物基因組的基因組編輯技術。在豬上，首次使用ZFNs破壞外源性綠色熒光蛋白（GFP）基因。具體來說，通過將ZFNs引入GFP陽性細胞中，導致GFP基因失活，并使用SCNT生產(chǎn)GFP基因敲除豬。通過在體細胞中引起GGTA1基因的定向修飾，并以該細胞作為SCNT的供體，產(chǎn)生GGTA1基因敲除豬。

與ZFNs的作用類似，TALENs能夠識別并引起特定位點的DSBs，從而對基因組進行定向修飾。在選擇基因組上的靶點位置時，TALENs更靈活。因為TALENs可以有效地識別富含AT的區(qū)域[15]，而ZFNs的活性則是在富含GC的靶區(qū)。2012年出現(xiàn)利用TALENs進行基因編輯豬生產(chǎn)的首次報道。該研究表明，TALENs可以有效地在豬基因組的各個位點上進行靶向修飾。在基因編輯豬生產(chǎn)中，使用TALENs的另一個重要報道則是在胚胎發(fā)生過程中引起靶向修飾。然而，由于ZFNs和TALENs的組裝比較困難，這兩種基因組編輯技術并不總是表現(xiàn)出很高特異性核酸酶活性。正是由于CRISPR/Cas9技術的開發(fā)，才大大減少了在豬體上使用基因組編輯技術所需的工作量。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬上首次應用是在體細胞中引起定向突變。次年，有項研究證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于生產(chǎn)基因編輯豬。這兩項研究都將CRISPR/Cas9系統(tǒng)以mRNA形式導入發(fā)育中的胚胎中，通過NHEJ途徑對基因組定向引起破壞。與ZFNs和TALENs報道的較低效率相比，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)直接注射到豬胚胎中可以達到100%的基因修飾效率。其中一項研究還表明，將基因組靶向修飾的體細胞作為供體，通過SCNT成功生產(chǎn)基因編輯豬，證實了經(jīng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)修飾的體細胞在體內(nèi)仍具有發(fā)育成個體的能力。

前人研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用來有效地產(chǎn)生基因編輯豬，SCNT并不是生產(chǎn)攜帶定向修飾的GE豬的唯一途徑。基因組編輯系統(tǒng)的應用，特別是CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可以產(chǎn)生用于生物醫(yī)學和農(nóng)業(yè)的基因修飾豬。

3 豬模型在生物醫(yī)學領域的應用

如前所述，第一批基因敲除豬被設計用于異種移植。現(xiàn)在，基因組編輯系統(tǒng)的使用允許引入對多個等位基因的編輯。使得快速生成攜帶多種遺傳修飾的基因編輯豬，以改善異種移植的豬模型成為可能。例如，利用基因組編輯系統(tǒng)（ZFNs），產(chǎn)生了缺乏GGTA1和胞苷一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（CMAH）的基因編輯豬，以減少異種移植后發(fā)生的免疫排斥反應。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以生產(chǎn)攜帶修飾的GGTA1、CMAH和β-1，4-N-乙酰-半乳糖胺酰轉(zhuǎn)移酶2（b4GalNT2）的三重基因敲除豬。來自GGTA1/CMAH/ b4GalNT2-基因敲除豬的血清中減少了與人類抗體的結(jié)合。如果使用傳統(tǒng)的基因工程方法并結(jié)合育種步驟制備這些雙重或三重基因敲除豬則通常需要花費長達幾年的時間。在異種移植領域使用基因組編輯系統(tǒng)時，另一個重要的優(yōu)點是破壞了可能在異種移植后傳染給患者的豬病毒序列。有報道稱，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERVs）序列進行全基因組破壞。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬體細胞基因組中對PERV序列的全部62個拷貝插入修飾。當體細胞用于SCNT時，產(chǎn)生了PERV失活的基因編輯豬，從豬身上沒有觀察到健康問題。最近發(fā)表的一篇文章表明，來自基因編輯豬的心臟可以具有非人類靈長類動物的心臟功能，基因編輯豬的器官移植將在不久的將來可能會進入臨床應用階段?；蚪M編輯技術的發(fā)展有助于生產(chǎn)免疫缺陷型的GE豬。缺乏免疫系統(tǒng)的動物模型可用于疫苗的開發(fā)，研究感染和細胞移植時的發(fā)病機制和免疫反應。

4 基因組編輯豬在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的爆發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)造成了相當大的損失，針對該病毒的疫苗往往效果欠佳。通過應用基因組編輯系統(tǒng)，特別是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的使用，促進了對CD163的定向破壞，已知CD163是PRRSV發(fā)病的潛在關鍵受體。CD163基因敲除豬用于PRRSV的研究時，發(fā)現(xiàn)豬對病毒完全具有抗性，將此基因編輯豬引入生產(chǎn)將顯著提高生產(chǎn)者經(jīng)濟效益。采用類似的策略，通過破壞推測的受體氨基肽酶N（ANPEP）來產(chǎn)生對傳染性胃腸炎病毒具有抗性的豬。這些研究證明，利用基因組編輯系統(tǒng)生產(chǎn)的基因編輯豬可以對病毒產(chǎn)生抗性，從而顯著提高豬的生產(chǎn)和經(jīng)濟效益。

培育含有肌肉生長抑制素（MSTN）基因修飾的豬也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應用之一。該基因在肌肉發(fā)育過程中起著抑制肌肉發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。自然發(fā)生的MSTN突變已經(jīng)在許多物種中被識別出來，包括牛，著名的比利時藍牛和山羊。使用ZFNs或TALENs對豬的MSTN進行靶向性破壞，可獲得更好的飼養(yǎng)效率和生長速度以及更高的肌肉質(zhì)量。此外，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改變豬的生理狀況，可以提高豬的生產(chǎn)力。已知解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）基因是棕色脂肪組織介導的產(chǎn)熱的關鍵基因，但豬通過進化已失去其功能。通過CRISPR/Cas9介導的HDR途徑，用功能性鼠UCP1基因替換豬內(nèi)源性UCP1基因，從而提高仔豬抵御寒冷的能力，并有助于能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。

5 總結(jié)

近些年來基因組編輯技術的發(fā)展擴大了基因編輯豬在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學領域的應用范圍。使用基因組編輯系統(tǒng)可以實現(xiàn)基因編輯豬的快速生產(chǎn)。豬的體外胚胎生產(chǎn)基因編輯豬效率已得到顯著改善，這有得益于使用直接胚胎注射的方法。這些基因組編輯技術的進步，為基因的復雜修飾奠定了基礎，可以提高農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學中基因修飾豬的產(chǎn)量。