DNA 測(cè)序關(guān)鍵技術(shù)分析

秦子陽

（四川省成都市郫都區(qū)嘉祥外國(guó)語學(xué)校，四川 成都 610000）

1 基因的基本結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)

基因是在DNA 上具有遺傳信息的片段，所以基因的結(jié)構(gòu)和DNA 一樣，基因也是由四種堿基（ATCG）所對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸組成的。這四種脫氧核糖核酸可以組成一條單鏈，再和另外一條互補(bǔ)鏈組成雙鏈結(jié)構(gòu)。DNA 最大的特點(diǎn)之一便是半保留復(fù)制，意思是在復(fù)制的時(shí)候，雙鏈解開，其他的游離的脫氧核苷酸以其中一條母鏈為模板進(jìn)行復(fù)制，半保留復(fù)制這個(gè)特點(diǎn)有著很重要的意義[1]。

2 DNA 測(cè)序技術(shù)

2.1 焦磷酸（一代）測(cè)序基本原理及測(cè)序儀。Sanger 法是1977 年由Sanger 發(fā)明的，也是在第 一代測(cè)序技術(shù)中被應(yīng)用最多的技術(shù)。其測(cè)序的基本原理是，在DNA 合成的體系中加入雙脫氧核糖核酸（ddNTP）。當(dāng)雙脫氧核糖核酸和DNA 鏈結(jié)合的時(shí)候，就不會(huì)形成磷酸二酯鍵，所以反應(yīng)就終止了，因此形成了很多的DNA 模板[2]。每一個(gè)雙脫氧核糖核酸上面有一定的放射性標(biāo)記，而且每一個(gè)都不一樣，然后通過凝膠電泳，檢測(cè)放射性同位素的標(biāo)記，然后我們就可以通過分析來確定各個(gè)位點(diǎn)上所對(duì)應(yīng)的堿基。該測(cè)序技術(shù)代表性DNA 測(cè)序儀器為：毛細(xì)管測(cè)序儀。

2.2 第二代測(cè)序基本原理及測(cè)序儀。由于第一代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)化與發(fā)展是建立在 Sanger 法的原理之上，所以測(cè)序中的電泳過程始終 是限制第一代測(cè)序技術(shù)效率的瓶頸。第二代測(cè)序 技術(shù)又稱下一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)，是對(duì)第一代測(cè)序技術(shù)的劃時(shí)代變革[3]。

第二代測(cè)序儀先通過物理或者化學(xué)的方法將DNA 打碎成小片段（分子量片段大小為200-500bp），然后在這些DNA 片段上面添加接頭，形成了DNA 文庫。然后在flowcell 中引物會(huì)和樣品DNA 中的接頭結(jié)合，將其固定在通道的表面，形成bridge[4-5]。然后通過橋式PCR 擴(kuò)增，可以增強(qiáng)堿基的信號(hào)強(qiáng)度。在橋式PCR 擴(kuò)增中，因?yàn)樵? 端的羥基有特殊的保護(hù)，所以每次只能添加一個(gè)dNTP，然后其他的DNA 鏈就會(huì)被洗掉，只留下這一條鏈。然后再加入緩沖液來激發(fā)熒光，再通過光學(xué)儀器捕捉光學(xué)信號(hào)，然后把信號(hào)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)里，計(jì)算機(jī)就可以把光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為堿基的序列。該DNA 測(cè)序技術(shù)代表性測(cè)序儀為：①焦磷酸測(cè)序：454 測(cè)序儀、Ion Torrent/Proton 等；②新一代SBS：Illumina、BGISEQ-500、Max-Seq、LaserGen；③連接測(cè)序：solid。

2.3 第三代測(cè)序基本原理及測(cè)序儀。雖然第二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，并在各技術(shù)方面趨于成熟，但是無法避免的是在必要的流程上，如PCR 擴(kuò)增、熒光分析等方 面，帶來的成本和效率限制以及不可避免的系統(tǒng)誤差。第三代測(cè)序技術(shù)，又被成為“下、下一代測(cè)序”，基于單分子讀取技術(shù)，不需要PCR 擴(kuò)增，具有巨大的應(yīng)用前景。

Pacbio：在DNA 合成的體系中，加入DNA 聚合酶，然后DNA 聚合酶就會(huì)捕獲這些DNA 模板，將其束縛在零模波導(dǎo)孔中，再加入dNTP，隨著不同的堿基進(jìn)入，就會(huì)發(fā)出不同的熒光，通過分析光的波長(zhǎng)和峰值就可以判斷這個(gè)堿基的類型Nanopore：納米孔技術(shù)主要是用了電信號(hào)來判斷堿基類型。當(dāng)DNA 堿基通過納米孔的時(shí)候，他們會(huì)使電荷發(fā)生變化，從而短暫的影響通過納米孔的電流強(qiáng)度，因?yàn)槊恳环N堿基所造成的電流變化的幅度不同，所以通過電子設(shè)備來檢測(cè)這個(gè)差異就可以從中分析通過的堿基是哪一種[6-7]。

3 DNA 測(cè)序關(guān)鍵技術(shù)方法

3.1 點(diǎn)測(cè)序（PCR 擴(kuò)增原理和方法）。點(diǎn)測(cè)序是專門專注于某個(gè)片段的測(cè)序方法。而這種方法就需要用的PCR 擴(kuò)增方法。PCR 擴(kuò)增是通過模擬體內(nèi)的環(huán)境，使DNA 片段在體外進(jìn)行指數(shù)bei7 的擴(kuò)增。當(dāng)DNA 被提取出來以后，被放入熱循環(huán)儀里進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)需要的還有dNTP，DNA 聚合酶，引物，以及鎂離子。

PCR 擴(kuò)增主要有三個(gè)步驟：變性，退火，延伸。當(dāng)DNA 被加熱到大約93-95 度時(shí)，DNA 的雙鏈會(huì)解開，形成兩條DNA 模板。在下一個(gè)步驟退火的時(shí)候，溫度大約會(huì)降至比變性溫度低25 度的溫度，這個(gè)時(shí)候引物會(huì)以DNA 母鏈為模板進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。在延伸的階段時(shí)，dNTP 會(huì)在DNA 聚合酶的作用下合成新的互補(bǔ)鏈，通過多次重復(fù)以上的操作，DNA 會(huì)在體外呈指數(shù)倍擴(kuò)增。

3.2 靶區(qū)域測(cè)序。靶區(qū)域測(cè)序是對(duì)一個(gè)較大的區(qū)域或者幾個(gè)不同的基因組區(qū)域進(jìn)行測(cè)序的方法，也是屬于DNA 捕獲（DNA capture）的方法。這種技術(shù)就是把基因組的DNA隨機(jī)打斷成小片段，然后再片段的兩頭加上特異性接頭，然后芯片上的特異性結(jié)構(gòu)和接頭連接后，就會(huì)連在一起，然后對(duì)他們進(jìn)行洗脫，把最后得到的再拼接起來，這就是靶區(qū)域測(cè)序。

3.3 全基因組測(cè)序。全基因組測(cè)序是將DNA 模板隨機(jī)打斷，然后將所有片段的序列整體組裝成為一個(gè)整個(gè)的基因組的序列。

3.4 Indexing 測(cè)序。Index 是像一個(gè)標(biāo)簽，他對(duì)每一個(gè)測(cè)試的個(gè)體，每一個(gè)序列上面都要加上一個(gè)標(biāo)簽，每次測(cè)完之后，這種標(biāo)簽可以把每一個(gè)樣本相互區(qū)分開，再通過其他方法去掉標(biāo)簽。

4 展望

隨著科技水平的持續(xù)進(jìn)步，DNA 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展呈現(xiàn)出加速趨勢(shì)，不斷地從物理學(xué)、光學(xué)、電學(xué)等領(lǐng)域借鑒最新的發(fā)明技術(shù)來滿足生物領(lǐng)域?qū)y(cè)序技術(shù)日益提高的要求[8-9]。當(dāng)然，DNA 測(cè)序技術(shù)也在逐步擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域，在目的DNA片段被鑒定出來后及時(shí)地進(jìn)行測(cè)序，有助于進(jìn)一步深入研究的開展。

各類的測(cè)序儀產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)也給研究人員帶來困難。一方面，測(cè)序儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量很大，研究人員需要掌握生物信息學(xué)的相關(guān)技術(shù)，并且懂得如何對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類儲(chǔ)存整理，才能有可能挖掘出原始測(cè)序結(jié)果背后潛在的意義。而通常對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析的工作是由負(fù)責(zé)測(cè)序的生物公司進(jìn)行的。另一方面，測(cè)序儀生產(chǎn)商只提供了特定的測(cè)序結(jié)果處理軟件，并未有其他下游的生物學(xué)信息分析軟件可以選擇[10-11]。如何建立標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)序信息分析軟件是亟需待解決的問題。相信隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的不斷完善，各類的測(cè)序儀之間也會(huì)建立統(tǒng)一的測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)。