脲酶—谷氨酸脫氫酶法快速測定黃酒及其發(fā)酵液中的尿素

高紅波 仇 凱 李國輝 吳 剛 屠振華 鄭 淼 陳楠楠 鐘其頂*

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.全國食品發(fā)酵標準化中心，北京 100015;3.食品行業(yè)生產(chǎn)力促進中心，北京 100062)

黃酒是我國民族特產(chǎn),含有豐富的營養(yǎng)組分深受廣大人民的喜愛，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒。隨著人們對食品安全的日益關(guān)注以及對發(fā)酵酒安全性的重視，研究發(fā)現(xiàn)黃酒中含有氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC，又叫Urethane)[1,2]，EC是一種多點致癌物廣泛存在于發(fā)酵食品,[3,4]，已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列入人類潛在致癌物質(zhì)(2A 類),加拿大、美國、聯(lián)合國糧農(nóng)組織等已對酒精飲料中EC的含量規(guī)定了限量標準[1]，我國尚未制定酒中EC的限量標準。研究表明，黃酒中含有的尿素是形成氨基甲酸乙酯最主要的前體物質(zhì)[1]，國家標準GB/T 34266—2017《黃酒中氨基甲酸乙酯預(yù)防控制措施指南》及文獻中指出黃酒中 EC 主要源尿素與乙醇反應(yīng)，且EC生成速率與其尿素含量，貯存時間 溫度正相關(guān)[5-9]，因此建立黃酒及發(fā)酵過程中尿素的準確快速檢測方法，對開展降低黃酒中EC含量的控制措施具有重要的意義。

目前，發(fā)酵酒中尿素的檢測方法主要有化學(xué)比色法[10-13]，柱前衍生-液相色譜熒光法法[14-18]分離和液相質(zhì)譜法[19]和脲酶法，即尿素經(jīng)脲酶水解后產(chǎn)生氨和二氧化碳，通過檢測氨或二氧化碳測定尿素含量[20-22]。其中化學(xué)比色法需水浴加熱，操作繁瑣，且易受黃酒中共存組分干擾；高效液相色譜法測定周期較長，無法滿足黃酒釀造過程中尿素含量呈動態(tài)變化快速測定；酶法特異性好、速度快，適合對黃酒及發(fā)酵液中尿素快速監(jiān)測，但是黃酒中內(nèi)源氨是尿素含量的6～10倍左右，根據(jù)黃酒中尿素的測定原理，內(nèi)源氨嚴重干擾尿素的測定[23]。

本實驗篩選不同的類型的離子交換樹脂，開展離子交換樹脂除去黃酒中內(nèi)源氨的研究，對離子交換樹脂的洗脫液種類、洗脫液體積和洗脫液pH值等條件進行了選擇和優(yōu)化，最終確定離子交換樹脂最佳前處理條件，可除去90 %的內(nèi)源氨，消除了氨對尿素測定的干擾。將該前處理方法與脲酶-谷氨酸脫氫酶法結(jié)合，對黃酒及其釀造過程發(fā)酵液中的尿素進行了檢測，并與柱前衍生高效液相色譜-熒光法[17]進行對比，通過方差分析和T檢驗說明兩種方法測定結(jié)果無顯著性差異，為適黃酒企業(yè)快速監(jiān)控黃酒和黃酒釀造過程尿素含量提供了一個有效途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

Arena 20XT全自動生化分析儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；高效液相色譜儀(Waters2695配熒光檢測器)；液相色譜柱(美國Waters公司，Atlantis dC18 (250 × 4.6 mm, 5 μm)，分析天平(梅特勒，感量0.0001g)；漩渦混合器(太倉市科教器材廠)；玻璃層析小柱(22×1.5(內(nèi)徑)cm)定制。

1.2 試劑和耗材

3種強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(001×1、001×7、001×14.5，天津南開和成科技有限公司)；氨試劑盒、尿素試劑盒均為賽默飛世爾(中國)科技有限公司；乙腈(色譜純)、9-占頓醇(美國Sigma公司)、尿素(純度99%，美國百靈威化學(xué)試劑公司)、硫酸氨、氫氧化鈉、濃鹽酸均為分析純；黃酒及黃酒釀造過程為黃酒廠家提供，水為二次蒸餾水。

1.3 實驗原理

首先一分子的尿素((NH2)2CO)在脲酶(Urease)的催化作用下轉(zhuǎn)化為二分子的氨離子(NH4+)，見反應(yīng)(1)；隨后氨離子(NH4+)與酮戊二酸(2-oxoglutarate)在谷氨酸脫氫酶(GLDH)的催化作用下轉(zhuǎn)化為L-谷氨酸(L-Glutamate)，同時等摩爾數(shù)的NADH轉(zhuǎn)變成NAD+，見反應(yīng)(2)，為了減去樣品中原來含有的游離氨，需同時對樣品中游離氨進行檢測，游離氨的檢測單獨使用氨試劑盒，只經(jīng)過反應(yīng)(2)。Arena分析儀通過分光光度法測定NADH在340nm波長下的吸光度變化，即可得出氨的濃度，隨后根據(jù)公式(3)計算出相對應(yīng)的尿素的含量。

(1)

(2)

由于1 mol尿素分解得到2 mol氨離子，其分子量比值為：MW(尿素/氨)=60.06/(2×18)=1.668，分解得到的氨離子和溶液中的氨離子按照實驗方法測定，測得的總氨離子含量扣除溶液中的游離氨離子濃度，尿素含量的結(jié)果是通過分析儀自動運行以下公式實現(xiàn)的：

尿素(mg/L)=(總氨離子(尿素分解氨和游離氨)(mg/L)-游離氨(mg/L))×1.668

(3)

1.4 實驗方法

1.4.1標準儲備液和定標液的配制

尿素標準溶液配制：準確稱取0.1000g尿素，用水溶解后定容至100mL，配制成尿素標準儲備液(1000 mg/L)于4 ℃冷藏，準確吸取該標準儲備液50 μL，用水稀釋至1000 μL，得50 mg/L尿素定標液。

氨根標準溶液配制：準確稱取0.3677g硫酸氨，用水溶解并定容至100 mL，根據(jù)硫酸氨和氨根離子的分子量，換算成氨根離子濃度為1000mg/L標準儲備液于4 ℃冷藏。準確吸取該標準儲備液50 μL，用水稀釋至1000 μL，得50 mg/L氨根離子作為定標液，定標液現(xiàn)配現(xiàn)用。其中硫酸氨((NH4)2SO4)分子量是132.14，氨根的相對分子量是18，因此硫酸氨質(zhì)量濃度與氨根質(zhì)量濃度的轉(zhuǎn)換系數(shù)為：C氨=C硫酸氨×36/132.14=C硫酸氨×0.272。

1.4.2樣品前處理

強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(001×1型樹脂)用水浸泡24小時，用2倍樹脂體積的4%鹽酸，通過樹脂層，并浸泡2～4小時，用去離子水通過樹脂層，洗至出水酸度穩(wěn)定pH 2～3；用2倍樹脂體積的2 %氫氧化鈉溶液，通過樹脂層，并浸泡2～4小時，用去離子水通過樹脂層，洗至出水酸度穩(wěn)定pH 8～10。反復(fù)3次后，用4 %的鹽酸將Na型樹脂轉(zhuǎn)換為H型樹脂即可使用。將處理好的陽離子交換樹脂裝入離子交換柱(22×1.5(內(nèi)徑)cm)中，柱高2.5 cm。取10 mL黃酒樣品加入離子交換柱內(nèi)，收集流出液，分次用純凈水洗脫(每次1 mL)，收集20 mL，混勻，取1 mL進樣測定。

1.4.3Arena20XT全自動生化分析儀測定參數(shù)

氨根測定采用氨試劑盒。根據(jù)儀器的測定條件，進樣量：5μL；試劑1：100μL；試劑2：25μL；試劑3：25μL；加入試劑2孵育300s，讀取空白值；加入試劑3孵育360s，讀終點。測定波長：340nm；反應(yīng)溫度：37℃。

尿素的測定采用尿素試劑盒，其他測定條件同氨。

1.4.4定標

取1mL超純水、1mL含尿素50mg/L的定標液置于樣品架上，按儀器設(shè)定參數(shù)定標，定標類型：線性；重復(fù)時間：1天；定標各點重測次數(shù)：2次。

1.4.5樣品測定

取待測樣品1mL，置于樣品架各個樣品位上，按照儀器的使用規(guī)程和參數(shù)設(shè)定進行檢測，自動計算結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨對尿素測定的干擾

脲酶-谷氨酸脫氫酶法的原理是尿素在酶的作用下分解產(chǎn)生的氨，Iiday[23]研究報道黃酒及黃酒發(fā)酵液內(nèi)源氨含量是尿素含量的6～10倍，會對尿素的測定有干擾，本實驗對黃酒中氨含量對尿素的測定干擾情況進行了研究。固定尿素的含量，分別配制氨濃度為尿素濃度的1、2、6、10、12、15倍的混合溶液，按實驗方法測定，從圖1可以看出，當氨濃度是尿素濃度的6倍時(C氨/C尿素=6)，尿素的回收率為119%，當氨濃度是尿素濃度的10倍時(C氨/C尿素=10)，尿素的回收率超過140%以上，隨著C氨/C尿素比值增加，尿素的回收率增加，而氨根離子的回收率基本都在100%左右，實驗結(jié)果表明：當氨濃度超過尿素濃度的6倍以上對尿素的測定產(chǎn)生正干擾，本研究結(jié)果和文獻報道基本一致，因此，采用脲酶-谷氨酸脫氫酶法測定黃酒中尿素需要首先除去黃酒中高含量的游離態(tài)的氨根離子。

圖1 氨對尿素測定的干擾研究

2.2 前處理方法的優(yōu)化

本實驗對離子交換樹脂種類、洗脫液種類、洗脫液體積和洗脫液pH值等條件進行了選擇和優(yōu)化。

2.2.1陽離子交換樹脂類型比較

采用6 mg/L的尿素標準品(含60 mg/L氨)，按照1.4實驗方法比較001×1、001×7、001×14.5.3種陽離子交換樹脂的除氨效果，001×7和001×14.5 兩種樹脂的氨除去率均為100 %，但尿素回收率分別為68.14 %和17.35 %，均偏低，說明對尿素有一定吸附；001×1樹脂的氨除去率為89.29 %，尿素回收率為96.78 %，該樹脂除氨效果理想且對尿素影響較小,結(jié)果見圖2樣品前處理方法優(yōu)化(A)，因此本方法最終選擇001×1強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂。

2.2.2洗脫液的選擇

尿素易溶于水，可溶于乙醇，甲醇等有機溶劑，在酸性、堿性以及加熱條件下水解。選擇尿素的洗脫液優(yōu)先考慮水，本實驗按照實驗方法采用純水、50 %乙醇、80 %乙醇和90 %乙醇4種洗脫液，根據(jù)黃酒中尿素的加標回收率比較洗脫液的效果，從圖2樣品前處理方法優(yōu)化(B)中可見純水洗脫液效果最佳。

2.2.3洗脫液體積的選擇

采用5、8、10、15 mL不同體積的二次蒸餾水分別為洗脫液，對10 mg/L尿素加標酒樣做回收率實驗。實驗結(jié)果表明洗脫體積為5mL時尿素未完全洗脫，洗脫體積為10 mL時，可以滿足洗脫需要，繼續(xù)增大洗脫液體積，回收率沒有明顯變化，確定洗脫劑用量為10 mL,見圖2樣品前處理方法優(yōu)化(C)。

2.2.4洗脫液pH的比較

黃酒的pH在3～4之間，氨在酒樣中以離子形式存在，用pH3.5、pH5.5、pH 7.5、pH 8.5水洗脫液對10 mg/L加標黃酒樣進行洗脫，通過回收率實驗測定洗脫效果，從圖2樣品前處理方法優(yōu)化(D)可以看出用二次蒸餾水(pH5.5)即可滿足測定要求。

圖2 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍和檢出限

配制系列2.0、5.0，10、25.0、50.0 mg/L的尿素標準溶液，按照Arena 20 XT 儀器設(shè)定的條件進行測定，以測定響應(yīng)值(y)對濃度(x)作標準曲線圖，計算線性回歸方程，尿素在2.0～50.0mg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999，見表1。用Arena 20 XT 儀器測定尿素空白溶液20次，按照AOAC推薦的方法[24]，計算得本方法對尿素的檢出限為0.47 mg/L和定量限為2.23mg/L見表1。

表1 線性范圍、檢出限

2.3.2方法的加標回收率

分別向成品黃酒和黃酒生產(chǎn)過程發(fā)酵液中加入高、中、低3個不同濃度梯度的尿素標準液，按照實驗方法測定并計算回收率，成品黃酒的回收率在101.3 %～107.4 %之間，黃酒生產(chǎn)過程發(fā)酵液的回收率在100.3 %～109.1 %之間，結(jié)果見表2。

表2 脲酶-谷氨酸脫氫酶法測定黃酒及黃酒生產(chǎn)過程發(fā)酵液中尿素的加標回收率(n=3)

2.3.3方法的精密度

對同一樣品取10份按本方法分別測定，計算成品黃酒和黃酒過程樣的重復(fù)性RSD%,分別為2.62%和3.51%；結(jié)果分別見表3。

表3 尿酶法對葡萄酒中尿素含量的精密度測定結(jié)果(n=10)

2.4 脲酶-谷氨酸脫氫酶法與液相色譜法測定尿素的結(jié)果比較

分別用本實驗方法脲酶-谷氨酸脫氫酶(Urease-GLDH)和QB/T 4710—2014，發(fā)酵酒中尿素測定方法高效液相色譜法[17]兩種方法處理并測定黃酒成品酒和黃酒生產(chǎn)過程發(fā)酵液中尿素含量，結(jié)果見表4。

表4 Urease-GLDH和HPLC-FLD法對黃酒及黃酒生產(chǎn)過程發(fā)酵液中尿素測定結(jié)果的比較

對表4中數(shù)據(jù)進行方差分析(表5)，P0.05=0.891>0.5；F=0.1980.5。以上分析說明兩種方法測定無顯著性差異，經(jīng)與QB/T 4710-2014 HPLC-FLD法對比實驗表明，Urease-GLDH法檢測黃酒及黃酒發(fā)酵液中的尿素具有較高準確性。將國標HPLC-FLD和Urease-GLDH兩種方法的相關(guān)參數(shù)進行對比(表7)，可以得到：

表5 兩種方法測定結(jié)果方差分析

表6 兩種方法測定結(jié)果T檢驗表

表7 Urease-GLDH法與HPLC-FLD法對比結(jié)果

(1)HPLC-FLD和Urease-GLDH兩種方法都具有良好的回收率、精密度和重復(fù)性，可滿足黃酒生產(chǎn)過程尿素監(jiān)控的要求，且Urease-GLDH成本更低，操作簡單，所用試劑基本無毒無害；

(2)HPLC-FLD相對Urease-GLDH法具有較高的靈敏度，而Urease-GLDH法測定黃酒樣所需平均時間17min,測定速度較HPLC法提高近4倍，黃酒生產(chǎn)過程中尿素含量處于不斷變化的狀態(tài)，因此從快速監(jiān)控的角度考慮，Urease-GLDH法更適合于黃酒生產(chǎn)過程發(fā)酵液中尿素的快速測定。

3 結(jié) 論

本研究對除去黃酒中內(nèi)源性的氨根離子的前處理方法進行了系統(tǒng)研究，對比不同離子交換樹脂除氨的效果、選擇了強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，并對洗脫液種類、體積和pH值等主要影響因素進行了選擇優(yōu)化，研制的陽離子交換樹脂可除去黃酒中近90 %的氨，消除氨對尿素測定的影響，實現(xiàn)了酶法快速測定黃酒及黃酒生產(chǎn)過程發(fā)酵液中尿素，本方法前處理簡單，方法易于掌握，且不需使用乙腈等有機化學(xué)溶劑，與液相色譜法相比，測定效率提高近4倍，可供釀酒企業(yè)進行黃酒產(chǎn)品及生產(chǎn)過程中尿素的快速監(jiān)控，為開展黃酒中質(zhì)量安全過程監(jiān)控提供一種快速的分析測試方法。